Summary
这里介绍的是使用三维荧光显微镜对斑马鱼幼虫进行 体内 全脑成像的方案。实验程序包括样品制备、图像采集和可视化。
Abstract
作为一种脊椎动物模型动物，斑马鱼幼虫广泛用于神经科学，并为以细胞分辨率监测全脑活动提供了独特的机会。在这里，我们提供了一种优化的方案，用于使用三维荧光显微镜对斑马鱼幼虫进行全脑成像，包括样品制备和固定、样品包埋、图像采集和成像后的可视化。目前的协议能够使用共聚焦显微镜和定制设计的荧光显微镜以细胞分辨率对幼虫斑马鱼大脑的结构和神经元活动进行 体内 成像超过1小时。还讨论了方案中的关键步骤，包括样品安装和定位，防止琼脂糖凝胶中的气泡形成和灰尘，以及避免由于琼脂糖凝胶不完全凝固和鱼麻痹而导致的图像运动。该协议已在多种设置中得到验证和确认。该协议可以很容易地适用于斑马鱼幼虫的其他器官成像。
Introduction
斑马鱼（Danio rerio）因其在幼虫阶段的光学透明度，快速发育，维护成本低以及多种遗传工具的可用性而被广泛采用为神经科学中的模型脊椎动物1，2，3，4。特别是，幼虫的光学透明度与生物事件的基因编码荧光报告基因5，6，7，8，9相结合，为在全脑水平上对神经元活动和结构进行成像提供了独特的机会10，11，12，13，14.然而，即使使用支持细胞分辨率的显微镜，采集的图像也不一定保留单细胞水平的信息;由于用于样品安装的琼脂糖凝胶引入的像差，光学图像质量可能会降低，鱼可能以一定角度安装，因此感兴趣的区域不能完全包含在显微镜的视野内，并且鱼可能会在记录过程中移动，导致图像中的运动伪影或阻碍从图像中提取准确的信号。
因此，需要一种有效且可重现的协议来获取具有最小噪声和运动的高质量图像数据。不幸的是，用于对斑马鱼幼虫全脑成像的公开协议 15，16，17，18，19 仅简要描述了该过程，留下了大部分细节，例如琼脂糖凝固、精确安装技术和使用镊子定位样品，直到每个实验者。此外，琼脂糖浓度和固定方法10，11，14，15，16，17，18，19的不一致可能导致成像过程中鱼类移动带来的挑战。
在这里，提供了使用三维荧光显微镜对斑马鱼幼虫进行全脑成像的详细方案。 图1 提供了该实验方案的图形概述：样品制备和固定、样品包埋、图像采集和成像后的可视化。使用商业共聚焦显微镜和定制设计的荧光显微镜演示幼 虫斑马 鱼大脑体内的结构和功能成像。该协议可以由从业者根据实验需求和设计定制，用于具有某些感官刺激或行为背景的脑成像。
Protocol
所有斑马鱼实验均已获得KAIST机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（KA2021-125）。共有12条成年斑马鱼，钙指示剂GCaMP7a的泛神经元表达[Tg（huc：GAL4）;Tg（UAS：GCaMP7a）]在卡斯珀[mitfa（w2/w2）;mpv17（a9/a9）]背景上用于育种。该组由8名女性和4名男性组成，年龄从3个月到12个月不等。在受精后3-4天（d.p.f.）对幼虫斑马鱼进行成像实验，在此期间无法确定其性别。
1. 斑马鱼样品制备
- 在繁殖所需转基因系的成年鱼后收集胚胎，例如Tg（huc：GAL4）;Tg（UAS：GCaMP7a）20，21，22，在装满蛋水的培养皿中（见材料表）。将胚胎放入28°C的培养箱中，并将它们培养至3-4 d.p.f.幼虫23，24，25。
- 如果斑马鱼背景不是白化病，为了抑制色素沉着的形成，在受精后24小时（h.p.f.）将胚胎转移到装有含有200μM1-苯基2-硫脲（PTU;见 材料表）的蛋水中的培养皿中25，26。每24小时，将鱼转移到含有200μMPTU的新鲜蛋水的新盘中。
注意：斑马鱼在标准条件下保持在28°C和14：10小时光：暗循环。已知PTU治疗会影响斑马鱼幼虫的行为和甲状腺功能27，28。因此，在任何实验中，谨慎使用机动部队并仔细控制潜在的混杂因素非常重要。
- 如果斑马鱼背景不是白化病，为了抑制色素沉着的形成，在受精后24小时（h.p.f.）将胚胎转移到装有含有200μM1-苯基2-硫脲（PTU;见 材料表）的蛋水中的培养皿中25，26。每24小时，将鱼转移到含有200μMPTU的新鲜蛋水的新盘中。
- 要找到表达目标荧光蛋白的样品（例如，泛神经元GCaMP7a），请在落射荧光显微镜下筛选样品并选择具有明亮表达的样品。
- 在装满蛋水的培养皿中制备选定的3-4 d.p.f.斑马鱼样品（图2A）。
注意：要记录自发神经元活动，建议使用年龄在 80-100 h.p.f. 之间的样本，因为在 80 h.p.f. 之前自发活动水平较低，并且色素沉着发展，即使有卡斯珀背景，也可能在 100 h.p.f. 后降低图像质量。 - 通过将 1 mL 的 2.5 mg/mL 储备溶液（参见材料表）加入 10 mL 的蛋水中，制备 0.25 mg/mL 泮库溴铵溶液14，19，29，30，31。将泮库溴铵溶液分装到1.5 mL微量离心管中。
- 使用移液管将预先筛选的样品转移到培养皿中。
注意：尽量随样品一起携带最小体积的蛋水。 - 将0.1mL泮库溴铵溶液转移到培养皿中用于麻痹。
注意：泮库溴铵对斑马鱼幼虫32的神经活动具有潜在的抑制作用。必须仔细考虑暴露于泮库溴铵的浓度和持续时间。
2. 2%（重量/体积）琼脂糖凝胶制剂
- 打开加热块并将目标温度设置为 37 °C。 等待设备在设定温度下加热并平衡。
- 将0.2g低熔点琼脂糖粉（见 材料表）溶解在10mL蛋水中。
- 在微波炉中加热琼脂糖溶液，并通过摇晃和涡旋混合，直到琼脂糖完全溶解。
- 将琼脂糖凝胶分装到1.5 mL微量离心管中，并将微量离心管储存在加热块上（图2B）。
注意：检查琼脂糖凝胶中的气泡是否消失。
3. 样品安装和定位
- 在体视显微镜下检查样品以验证幼虫运动是否已停止，并通过检查其心跳来目视评估样品的健康状况（图2C）。如果心跳太慢，请丢弃样品。
注意：如果正在成像的鱼的心跳太慢（例如，低于每分钟 60 次），则可能无法进行长期成像。为了评估鱼的健康，可以通过将其与同一培养皿中的其他鱼进行比较来目视检查心率。这将有助于确保被成像的鱼足够健康和稳定，可以进行成像程序。 - 使用移液管，将一条斑马鱼幼虫放入 1.5 mL 微量离心管中的琼脂糖凝胶中（图 2D）。
注意：确保在转移样品后丢弃移液器。 - 将琼脂糖凝胶倒入培养皿中，制成1-2毫米的涂层。使用移液管将微量离心管中的样品转移到培养皿中，使幼虫放置在培养皿的中心。
注意：如果琼脂糖凝胶中有灰尘和气泡，请使用移液管将其清除。 - 使用镊子将样品定位在所需的方向，使头部和尾部平坦（图2E）。
- 使用镊子旋转样品，使两只眼睛水平（图2F）。
注意：对齐程序（位置和旋转）应在琼脂糖凝胶开始凝固之前完成。 - 对齐后，等待琼脂糖凝胶凝固（图2G，H）。
注意：琼脂糖凝胶凝固的等待时间可以从5-10分钟不等，具体取决于凝胶的体积和大小。 - 琼脂糖凝胶凝固后，用蛋水填充培养皿，并将带有嵌入样品的培养皿放在显微镜载物台上（图2I）。
4. 图像采集
- 打开显微镜系统（例如，激光器、共聚焦控制器、显微镜和计算机;参见 材料表）并验证整个系统是否正常工作。
- 选择低放大倍率物镜并将样品定位在视场中心。
- 选择具有适当放大倍率的水浸或水浸物镜（例如，16x 0.8数值孔径（NA）水浸透镜;见 材料表）。对视野进行微调。
- 使用图像采集软件设置成像参数（例如，图像尺寸、激光功率、曝光时间、帧数）。
注意：设置成像参数以获得最佳结果以满足特定需求（请参阅代表性结果部分中的图像采集设置）。如果图像饱和，请降低激光功率。 - 通过移动载物台找到样品的大脑，并通过手动上下更改焦平面，使用软件中的实时取景模式确定其厚度。设置音量的下限和上限。
注意：确保整个大脑沿横向和轴向都包含在视野中。 - 根据显微镜的轴向分辨率设置z步长。
注意：对斑马鱼幼虫大脑成像的最佳 z 步长取决于成像方式和显微镜的分辨率。例如，考虑到光片的厚度和细胞体的平均直径，使用了5μm的z步长10。 - 继续对设定的视野进行图像采集。
- 对于体积结构成像，通过改变焦平面并依次获取每个z平面的2-D图像来获取整个大脑的3D图像（x，y，z）。
- 对于单个z平面的功能成像，在一定深度获取大脑神经元活动的时间序列图像（x，y，t）。
- 对于体积功能成像，通过顺序获取 3D 图像来获取整个大脑中神经元活动的 4D 图像 （x，y，z，t）。
注：根据计算机的可用内存大小设置帧数。由于泮库溴铵作用的持续时间，建议采集时间小于1小时。
- 采集图像后，保存结果并记录成像参数（例如像素大小、z步长、帧速率、激光功率）以进行图像分析。
- 以适当的格式导出图像，以便进行数据渲染和图像分析。
注意：建议以标记图像文件 （TIF） 格式导出图像。TIF支持无损图像压缩，并与大多数图像处理软件和编程语言兼容。此外，TIF格式支持包含元数据，例如采集参数、图像分辨率和其他有助于数据解释和再现性的相关信息。
5. 使用 napari 进行可视化设置
注意：napari 是 Python 环境中的开源多维图像查看器，具有基于图形处理单元 （GPU） 的渲染33。纳帕里动画插件提供了电影的程序化创作。建议使用开源图像处理程序斐济进行通用图像处理，例如滤波和几何变换（参见 材料表）。用于使用 napari 进行可视化的源代码可在 GitHub （https://github.com/NICALab/Zebrafish-brain-visualization） 上找到。
- 使用 pip 或 conda 安装 napari 和 napari 动画。安装后，创建一个新的 jupyter 笔记本文件。
注意：使用 jupyter notebook（Python 的交互式工具）运行，建议使用 Python 脚本运行。 - 导入纳帕里和纳帕里动画。
6. 使用纳帕里可视化结构
- 要可视化图像并创建渲染斑马鱼大脑的电影，请加载 3D 图像 （x，y，z） 并打开 napari 窗口。连接纳帕里动画插件（图 3A）。
- 在图层控件中设置体素大小、颜色映射表和对比度限制等参数。
- 调整画布中的查看器设置（例如，透视、角度）。
- 要捕获渲染的图像，请按动画向导中的 捕获 按钮。
- 要生成渲染体积的电影，请修改查看器设置并添加关键帧（图 3B）。
- 添加关键帧后，在动画向导中设置关键帧之间的帧数（步长）。保存渲染的动画。
7. 使用纳帕里进行图像处理和可视化神经元活动
注意：要将神经元活动的时间序列图像可视化为静态背景和活动的叠加图像，必须对原始图像应用分解算法。使用名为 BEAR24 的分解算法的 MATLAB 实现。BEAR的MATLAB版本可在GitHub（https://github.com/NICALab/BEAR）上找到。
- 要分解静态背景和神经元活动，请将 BEAR 应用于原始时间序列图像（x，y，t 或 x，y，z，t）。分解后，将背景和神经元活动的图像保存为TIF文件（图3C）。
- 加载背景和神经元活动图像并打开纳帕里窗口。连接纳帕里动画插件。
- 对背景图像使用灰色颜色图，对神经元活动图像使用热颜色图（图3C）。
- 在图层控件中设置不透明度和对比度限制等参数。
- 要生成神经元活动的电影，请修改查看器设置并添加关键帧以渲染动画。
- 添加关键帧后，在动画向导中设置关键帧之间的帧数（步长）。保存渲染的动画。
Representative Results
表达钙指示剂泛神经元GCaMP7a（Tg（huc：GAL4）;Tg（UAS：GCaMP7a））20，21，22与 casper （mitfa（w2/w2）;mpv17（a9/a9））34 背景按照所述协议在 3-4 d.p.f. 下成像。
对于体积结构成像，使用配备16x 0.8 NA水浸物镜的商业点扫描共聚焦显微镜系统对标本进行成像。488 nm激发激光器用于结构和功能成像。帧速率、图像分辨率、像素尺寸和轴向步长分别为0.25 Hz、2048 x 2048、0.34 μm和1.225 μm。图像采集大约需要1小时20分钟。采集图像的体积视野覆盖了前脑、中脑和后脑的大脑区域（图 4A）。在共聚焦显微镜图像中，4 d.p.f.幼虫斑马鱼全脑中延髓、小脑板、视顶、habenula和背端脑的神经元细胞体清晰可见（图4B）。按照上述协议，使用napari27 对共聚焦显微镜图像进行3D渲染（图4C 和 视频1）。
对于2-D功能成像，使用相同的共聚焦显微镜系统对标本进行成像，该系统配备16x 0.8 NA水浸物镜。帧速率、图像分辨率和像素大小分别为 2 Hz、512 x 256 和 1.5 μm。神经元细胞体在背景和叠加的神经元活动中都清晰可见（图5A，B）。
对于3-D功能成像，使用了定制设计的3-D显微镜系统18 ，该系统能够对整个幼虫斑马鱼大脑的神经元活动进行 体内 成像，视野分别为1，040μm×400μm×235μm，横向和轴向分辨率分别为1.7μm和5.4μm。成像速率高达每秒 4.2 卷。与渲染结构成像数据类似，napari用于全脑钙成像数据的3D渲染（图5C 和 视频2）。
图1：实验程序概述。 斑马鱼样品制备和麻痹（步骤1）。将2%（重量/体积）琼脂糖凝胶制剂（步骤2）。样品安装和定位（步骤3）。图像采集（步骤4）。图像处理和可视化结构和神经元活动（步骤5-7）。 请点击此处查看此图的大图。
图2：制备全脑成像的实验程序 。 （A）在装满蛋水的培养皿中筛选表达泛神经元GCaMP7a的斑马鱼样品。（B）样品安装和定位所需的设备和材料。（1）37°C加热块;（2） 2%（重量/体积）琼脂糖凝胶;（3）1.5毫升微量离心管;（4）鸡蛋水;（5）0.25毫克/毫升泮库溴铵溶液;（6）培养皿;（7）镊子;（8）转移移液器。（C）瘫痪样品的立体显微镜图像。黑色箭头指向样品的中心。（D） 使用移液管转移 1.5 mL 微量离心管中的样品。插图显示了盒装区域的放大视图。（E）使用镊子将样品（黑色箭头）放置在培养皿的中心。（F）使用镊子对准样品。（G） 未对齐的嵌入样本示例。（H） 对齐的嵌入样本示例。（I）将标本放置在物镜下的显微镜载物台上进行图像采集。比例尺：500 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：幼虫 斑马鱼大脑图像的可视化。 （A）表达泛神经元GCaMP7a的幼虫斑马鱼（4 d.p.f）大脑的共聚焦显微镜图像的3D渲染。napari是Python环境中的开源多维图像查看器，用于渲染。napari 窗口包括图层控件（红色框）、图层列表（黄色框）、画布（蓝色框）和动画向导（绿色框）。（B） 添加了具有多个查看器设置的关键帧，用于渲染动画。（C）斑马鱼幼虫大脑中神经元活动的二维延时成像的共聚焦显微镜图像。图像被分解为背景（左）和神经元活动（中），然后叠加（右）。比例尺：100 μm。 请点击这里查看此图的大图。
图 4：斑马鱼幼虫大脑的成像结构。 （A） 表达泛神经元 GCaMP7a 的幼虫斑马鱼 （4 d.p.f.） 大脑的共聚焦显微镜图像的最大强度投影 （MIP）。上图：侧压。底部：轴向MIP。每个边界包含前脑（红色）、中脑（黄色）和后脑（蓝色）。（B）从大脑体积图像（z = 25 μm，50 μm，75 μm，100 μm，125 μm，150 μm，175 μm，200 μm，225 μm，250 μm，从上到下向上计数的总共10个轴向切片;z = 0 μm表示大脑的顶面）。每个白框代表大脑区域（延髓、小脑板、视顶、habenula和背端脑）。（C）使用纳帕里渲染的整个大脑。比例尺：100 μm。 请点击这里查看此图的大图。
图 5：对幼虫斑马鱼大脑的神经元活动进行成像。 （A） 表达泛神经元 GCaMP7a 的幼虫斑马鱼 （4 d.p.f.） 大脑中神经元活动的共聚焦显微镜图像。比例尺：100 μm。 （B）A中框框区域的放大视图，显示了多个时间点视顶中的神经元活动。比例尺：20 μm。 （C）使用定制设计的显微镜获得的斑马鱼幼虫大脑中全脑神经元活动的3D渲染（左：t = 133 s;右：t = 901 s）。神经元活动叠加在静态背景上。比例尺：100 μm。 请点击这里查看此图的大图。
图 6：有和没有 样品漂移的延时成像。 （A）表达泛神经元GCaMP7a的幼虫斑马鱼大脑的延时成像，具有样品漂移。在琼脂糖凝胶凝固之前向样品中加入蛋水（步骤3.6-3.7）。鱼在横向和轴向移动。（B）无样本漂移的斑马鱼幼虫大脑的延时成像。琼脂糖凝胶固化后向样品中加入蛋水（步骤3.6-3.7）。比例尺：100 μm。 请点击这里查看此图的大图。
视频 1：表达泛神经元 GCaMP7a 的斑马鱼幼虫 （4 d.p.f.） 大脑全脑结构的 3D 渲染。请点击此处下载此视频。
视频 2：表达泛神经元 GCaMP7a 的幼虫斑马鱼 （4 d.p.f.） 大脑中全脑神经元活动的 3D 渲染。请点击此处下载此视频。
Discussion
目前的协议能够在较长时间（例如，超过1小时）内对斑马鱼幼虫进行 体内 全脑成像，并对获得的结构和功能成像数据进行可视化。
最关键的步骤是样品安装和定位。在样品包埋过程中，防止气泡形成并避免琼脂糖凝胶中的灰尘至关重要。如果凝胶含有气泡和灰尘，图像质量可能会严重下降。使用镊子定位样品时，重要的是要确保样品水平和垂直水平。否则，感兴趣的区域可能不包含在显微镜的视野内。此外，这种定位应在琼脂糖凝胶凝固前的短时间内完成，以避免对其表面造成损坏，因为这种损坏会影响图像质量。
另一个主要挑战是避免图像中的运动，这些运动来自琼脂糖凝胶的不完全固化（图6）和斑马鱼的麻痹。当在阿戈尔斯凝胶完全凝固之前将蛋水添加到样品中时，鱼在横向和轴向上缓慢移动，在时间序列图像中表现为样品漂移（图6A）。如果麻痹剂的剂量不足或效果持续时间结束，样品可能会尝试移动，这在延时图像中表现为快速抽搐。
尽管上述步骤对于获取没有运动伪影的高质量图像很重要，但公开可用的协议15，16，17，18，19仅提供了实验程序的简要概述，缺乏这些细节。例如，没有固定协议11的采集图像存在大量的运动伪影，这使得下游图像分析具有挑战性。通过集成琼脂糖凝胶固化和样品麻痹等基本组件，我们的实验方案显著提高了采集图像质量的一致性，同时最大限度地减少了运动伪影。
总之，描述了一种优化且可重复的斑马鱼幼虫脑体内成像实验程序。该协议用于大脑活动和结构的体内成像的有效性和可重复性已在多种设置中得到证实14，18，29，30，31。目前的工作流程侧重于斑马鱼幼虫的全脑成像，但它可以很容易地应用于斑马鱼幼虫的其他器官成像35，36。
Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
用于钙成像的斑马鱼系由韩国斑马鱼疾病建模中心（ZCDM）提供。这项研究得到了韩国国家研究基金会（2020R1C1C1009869，NRF2021R1A4A102159411，RS-2023-00209473）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | SciLab | SL.Tub3513 | To aliquot agarose gel and pancuronium bromide solution |
| 15 mL Falcon tubes | Falcon | 352096 | To prepare agarose gel and pancuronium bromide solution |
| 16× 0.8NA water dipping objective lens | Nikon | CFI75 LWD 16×W | Objective lens for whole-brain imaging |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | 200 μM of 1-phenyl 2-thiourea (PTU) |
| 50 mL Falcon tubes | Falcon | 352070 | To prepare egg water |
| Disposable transfer pipette | SciLab | SL.Pip3032 | To transfer zebrafish larvae |
| Egg water | N/A | N/A | 0.6 g sea salt in 10 L deionized water |
| Forceps | Karl Hammacher GmbH | HSO 010-10 | Forceps used for sample positioning |
| Low melting point agarose | Thermo Scientific | R0801 | 2% (wt/vol) agarose gel |
| Napari | Napari | N/A | To visualize microscopy images in 3-D |
| NIS-Elements C | Nikon | N/A | Imaging software for confocal microscope |
| Pancuronium bromide | Sigma-Aldrich | P1918-10MG | 0.25 mg/mL of pancuronium bromide solution |
| Petri dish, 35 mm | SPL Life Sciences | 11035 | Petri dish used for sample embedding |
| Petri dish, 55 mm | SPL Life Sciences | 11050 | To prepare zebrafish larvae after screening |
| Point-scanning confocal microscopy system (C2 Plus) | Nikon | N/A | Confocal microscope for whole-brain imaging |
| Sea salt | Sigma-Aldrich | S9883-500G | Sea salt used for preparing egg water |
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