Apresentamos aqui um protocolo para imagens in vivo de todo o cérebro de larvas de peixes-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional. O procedimento experimental inclui preparo da amostra, aquisição e visualização das imagens.
Como um animal modelo de vertebrado, larvas de peixes-zebra são amplamente utilizadas em neurociência e fornecem uma oportunidade única para monitorar a atividade do cérebro inteiro na resolução celular. Aqui, fornecemos um protocolo otimizado para a realização de imagens de cérebro inteiro de larvas de peixe-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional, incluindo preparação e imobilização de amostras, incorporação de amostras, aquisição de imagens e visualização após exames de imagem. O protocolo atual permite imagens in vivo da estrutura e atividade neuronal de um cérebro de larvas de peixe-zebra em uma resolução celular por mais de 1 h usando microscopia confocal e microscopia de fluorescência personalizada. As etapas críticas do protocolo também são discutidas, incluindo a montagem e o posicionamento da amostra, evitando a formação de bolhas e poeira no gel de agarose, e evitando o movimento nas imagens causado pela solidificação incompleta do gel de agarose e paralisação dos peixes. O protocolo foi validado e confirmado em várias configurações. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para obtenção de imagens de outros órgãos de uma larva de peixe-zebra.
O peixe-zebra (Danio rerio) tem sido amplamente adotado como animal vertebrado modelo em neurociências, devido à sua transparência óptica na fase larval, seu rápido desenvolvimento, seu baixo custo de manutenção e a disponibilidade de diversas ferramentas genéticas 1,2,3,4. Em particular, a transparência óptica das larvas combinada com repórteres fluorescentes codificados geneticamente de eventos biológicos 5,6,7,8,9 fornece uma oportunidade única para obter imagens tanto da atividade neuronal quanto da estrutura em nível de todo o cérebro 10,11,12,13,14 . No entanto, mesmo com um microscópio que suporta a resolução celular, as imagens adquiridas não necessariamente retêm a informação em nível de célula única; A qualidade da imagem óptica pode ser degradada devido à aberração introduzida pelo gel de agarose usado para a montagem da amostra, os peixes podem ser montados em um ângulo, assim, as regiões de interesse não estão totalmente contidas no campo de visão do microscópio, e os peixes podem se mover durante a gravação, causando artefatos de movimento nas imagens ou impedindo a extração precisa do sinal das imagens.
Assim, um protocolo eficaz e reprodutível é necessário para obter dados de imagem de alta qualidade com o mínimo de ruído e movimento. Infelizmente, protocolos publicamente disponíveis para obtenção de imagens de todo o cérebro de larvas de peixe-zebra in vivo 15,16,17,18,19 descrevem apenas brevemente o procedimento, deixando partes substanciais dos detalhes, como solidificação de agarose, técnicas precisas de montagem e posicionamento da amostra usando pinças, para cada experimentalista. Além disso, inconsistências na concentração de agarose e nos métodos de imobilização 10,11,14,15,16,17,18,19 podem levar a desafios decorrentes da movimentação dos peixes durante o processo de imagem.
Aqui, um protocolo detalhado para imagens de todo o cérebro de larvas de peixe-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional é fornecido. A Figura 1 fornece uma visão gráfica do protocolo: preparo e imobilização da amostra, incorporação da amostra, aquisição da imagem e visualização após a aquisição de imagens. A imagem estrutural e funcional do cérebro de larvas de peixe-zebra in vivo é demonstrada usando um microscópio confocal comercial e um microscópio de fluorescência personalizado. Este protocolo pode ser adaptado por profissionais para imagens cerebrais com certos estímulos sensoriais ou contextos comportamentais, dependendo das necessidades experimentais e do design.
O protocolo atual permite imagens in vivo de todo o cérebro de larvas de peixes-zebra durante um período prolongado (por exemplo, mais de 1 h) e visualizações dos dados de imagem estruturais e funcionais adquiridos.
As etapas mais críticas são a montagem e o posicionamento da amostra. Durante a incorporação da amostra, é crucial evitar a formação de bolhas e evitar a poeira no gel de agarose. Se o gel contiver bolhas de ar e poeira, a qualidade da imagem pode ser severamente degradada. Ao posicionar a amostra usando pinças, é importante garantir que a amostra esteja nivelada horizontal e verticalmente. Caso contrário, as regiões de interesse podem não estar contidas no campo de visão do microscópio. Além disso, esse posicionamento deve ser feito em uma curta janela de tempo antes da solidificação do gel de agarose para evitar causar danos à sua superfície, pois tais danos comprometem a qualidade da imagem.
Outro grande desafio é evitar movimento em imagens provenientes da solidificação incompleta do gel de agarose (Figura 6) e paralisação do peixe-zebra. Quando a água do ovo é adicionada à amostra antes da solidificação completa do gel de agorse, os peixes movem-se lentamente tanto lateral quanto axialmente, manifestando-se como deriva da amostra nas imagens de séries temporais (Figura 6A). Se a dose de paralíticos for insuficiente ou a duração do efeito terminar, a amostra pode tentar mover-se, o que aparece como contração rápida nas imagens de lapso de tempo.
Apesar da importância das etapas citadas para a aquisição de imagens de alta qualidade sem artefatos de movimento, os protocolos disponíveis publicamente15,16,17,18,19 fornecem apenas uma breve visão geral do procedimento experimental, carecendo desses detalhes. Por exemplo, as imagens adquiridas sem protocolos de imobilização11 sofrem de artefatos de movimento substanciais que tornam a análise das imagens a jusante desafiadora. Ao integrar componentes essenciais, como solidificação em gel de agarose e paralisação de amostras, nosso protocolo aumenta significativamente a consistência na qualidade das imagens adquiridas, minimizando artefatos de movimento.
Em resumo, um procedimento experimental otimizado e reprodutível para obtenção de imagens in vivo do cérebro de larvas de peixe-zebra é descrito. A validade e a reprodutibilidade desse protocolo para imagens in vivo da atividade e estrutura cerebral foram confirmadas em múltiploscontextos 14,18,29,30,31. O presente fluxo de trabalho concentrou-se na imagem de todo o cérebro de larvas de peixes-zebra, mas pode ser facilmente aplicado em imagens de outros órgãos de larvas de peixes-zebra35,36.
The authors have nothing to disclose.
As linhagens de zebrafish usadas para imagens de cálcio foram fornecidas pelo Zebrafish Center for Disease Modeling (ZCDM), Coreia. Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (2020R1C1C1009869, NRF2021R1A4A102159411, RS-2023-00209473).
1.5 mL microcentrifuge tube | SciLab | SL.Tub3513 | To aliquot agarose gel and pancuronium bromide solution |
15 mL Falcon tubes | Falcon | 352096 | To prepare agarose gel and pancuronium bromide solution |
16× 0.8NA water dipping objective lens | Nikon | CFI75 LWD 16×W | Objective lens for whole-brain imaging |
1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | 200 μM of 1-phenyl 2-thiourea (PTU) |
50 mL Falcon tubes | Falcon | 352070 | To prepare egg water |
Disposable transfer pipette | SciLab | SL.Pip3032 | To transfer zebrafish larvae |
Egg water | N/A | N/A | 0.6 g sea salt in 10 L deionized water |
Forceps | Karl Hammacher GmbH | HSO 010-10 | Forceps used for sample positioning |
Low melting point agarose | Thermo Scientific | R0801 | 2% (wt/vol) agarose gel |
Napari | Napari | N/A | To visualize microscopy images in 3-D |
NIS-Elements C | Nikon | N/A | Imaging software for confocal microscope |
Pancuronium bromide | Sigma-Aldrich | P1918-10MG | 0.25 mg/mL of pancuronium bromide solution |
Petri dish, 35 mm | SPL Life Sciences | 11035 | Petri dish used for sample embedding |
Petri dish, 55 mm | SPL Life Sciences | 11050 | To prepare zebrafish larvae after screening |
Point-scanning confocal microscopy system (C2 Plus) | Nikon | N/A | Confocal microscope for whole-brain imaging |
Sea salt | Sigma-Aldrich | S9883-500G | Sea salt used for preparing egg water |