Summary
Her præsenteres en protokol for in vivo helhjernebilleddannelse af larvezebrafisk ved hjælp af tredimensionel fluorescensmikroskopi. Den eksperimentelle procedure omfatter prøveforberedelse, billedoptagelse og visualisering.
Abstract
Som et hvirveldyrs modeldyr er larvezebrafisk meget udbredt inden for neurovidenskab og giver en unik mulighed for at overvåge hele hjernens aktivitet ved cellulær opløsning. Her leverer vi en optimeret protokol til udførelse af helhjernebilleddannelse af larvezebrafisk ved hjælp af tredimensionel fluorescensmikroskopi, herunder prøveforberedelse og immobilisering, prøveindlejring, billedoptagelse og visualisering efter billeddannelse. Den nuværende protokol muliggør in vivo-billeddannelse af strukturen og neuronal aktivitet af en larvezebrafiskhjerne ved en cellulær opløsning i over 1 time ved hjælp af konfokalmikroskopi og specialdesignet fluorescensmikroskopi. De kritiske trin i protokollen diskuteres også, herunder prøvemontering og positionering, forebyggelse af bobledannelse og støv i agarosegelen og undgåelse af bevægelse i billeder forårsaget af ufuldstændig størkning af agarosegelen og lammelse af fisken. Protokollen er blevet valideret og bekræftet i flere indstillinger. Denne protokol kan let tilpasses til billeddannelse af andre organer hos en larvezebrafisk.
Introduction
Zebrafisk (Danio rerio) er blevet bredt vedtaget som et mønsterhvirveldyr inden for neurovidenskab på grund af dets optiske gennemsigtighed på larvestadiet, dets hurtige udvikling, dets lave vedligeholdelsesomkostninger og tilgængeligheden af forskellige genetiske værktøjer 1,2,3,4. Især larvernes optiske gennemsigtighed kombineret med genetisk kodede fluorescerende reportere af biologiske begivenheder 5,6,7,8,9 giver en unik mulighed for at afbilde både neuronal aktivitet og struktur på hele hjerneniveau 10,11,12,13,14 . Men selv med et mikroskop, der understøtter cellulær opløsning, bevarer de erhvervede billeder ikke nødvendigvis informationen på enkeltcelleniveau; Den optiske billedkvalitet kan blive forringet på grund af den aberration, der indføres af agarosegelen, der anvendes til prøvemontering, fisken kan monteres i en vinkel, således at interesseområderne ikke er fuldt ud indeholdt i mikroskopets synsfelt, og fisken kan bevæge sig under optagelsen, hvilket forårsager bevægelsesartefakter i billederne eller forhindrer nøjagtig signalekstraktion fra billederne.
Således er en effektiv og reproducerbar protokol nødvendig for at erhverve billeddata af høj kvalitet med minimal støj og bevægelse. Desværre beskriver offentligt tilgængelige protokoller til billeddannelse af en hel hjerne af larvezebrafisk in vivo 15,16,17,18,19 kun kort proceduren, hvilket efterlader væsentlige dele af detaljerne, såsom agarosestørkning, præcise monteringsteknikker og prøvepositionering ved hjælp af tang, op til hver eksperimentalist. Derudover kan uoverensstemmelser i agarosekoncentration og immobiliseringsmetoder 10,11,14,15,16,17,18,19 føre til udfordringer som følge af fiskens bevægelse under billeddannelsesprocessen.
Her tilvejebringes en detaljeret protokol for helhjernebilleddannelse af larvezebrafisk ved hjælp af tredimensionel fluorescensmikroskopi. Figur 1 giver et grafisk overblik over protokollen: prøveforberedelse og immobilisering, prøveindlejring, billedoptagelse og visualisering efter billeddannelse. Den strukturelle og funktionelle billeddannelse af larvezebrafiskens hjerne in vivo demonstreres ved hjælp af et kommercielt konfokalmikroskop og et specialdesignet fluorescensmikroskop. Denne protokol kan skræddersys af praktikere til hjernebilleddannelse med visse sensoriske stimuli eller adfærdssammenhænge afhængigt af de eksperimentelle behov og design.
Protocol
Alle zebrafiskforsøg blev godkendt af KAIST's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (KA2021-125). I alt 12 voksne zebrafisk med panneuronal ekspression af calciumindikatoren GCaMP7a [Tg(huc:GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a)] på en casper [mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9)] baggrund blev brugt til avl. Denne gruppe bestod af otte kvinder og fire mænd, med aldre varierende fra 3 til 12 måneder. Billeddannelseseksperimenter blev udført på larvezebrafisk 3-4 dage efter befrugtning (d.p.f.), et stadium, hvor deres køn ikke kan bestemmes.
1. Forberedelse af zebrafiskprøver
- Indsamle embryoner efter opdræt af voksne fisk af en ønsket transgen linje, såsom Tg (huc: GAL4); Tg (UAS: GCaMP7a) 20,21,22, i en petriskål fyldt med ægvand (se materialetabel). Anbring embryonerne i en inkubator ved 28 °C og hæv dem til 3-4 d.p.f. larver23,24,25.
- Hvis zebrafiskens baggrund ikke er albino, overføres embryonerne 24 timer efter befrugtning (h.p.f.) til petriskålen fyldt med æggevand indeholdende 200 μM 1-phenyl-2-thiourea (PTU; se materialetabel) 25,26 for at hæmme pigmentdannelsen. Hver 24. time overføres fisken til en ny skål med frisk ægvand indeholdende 200 μM PTU.
BEMÆRK: Zebrafisken holdes under standardbetingelser ved 28 °C og en 14:10 timers lys:mørk cyklus. PTU-behandlingen er kendt for at påvirke adfærd og skjoldbruskkirtelfunktion hos larvezebrafisk27,28. Derfor er det vigtigt at bruge PTU med forsigtighed og omhyggeligt kontrollere for potentielle forstyrrende faktorer i eventuelle eksperimenter.
- Hvis zebrafiskens baggrund ikke er albino, overføres embryonerne 24 timer efter befrugtning (h.p.f.) til petriskålen fyldt med æggevand indeholdende 200 μM 1-phenyl-2-thiourea (PTU; se materialetabel) 25,26 for at hæmme pigmentdannelsen. Hver 24. time overføres fisken til en ny skål med frisk ægvand indeholdende 200 μM PTU.
- For at finde prøven, der udtrykker fluorescerende proteiner af interesse (f.eks. Pan-neuronal GCaMP7a), screenes prøven under et epifluorescensmikroskop og vælger en prøve med et lyst udtryk.
- Forbered den udvalgte 3-4 d.p.f. zebrafiskprøve i petriskålen fyldt med æggevand (figur 2A).
BEMÆRK: For at registrere spontan neuronal aktivitet anbefales det at bruge prøver i alderen 80-100 h.p.f., da niveauet af spontan aktivitet er lavt før 80 h.p.f., og pigmenteringsudvikling, selv med en casperbaggrund, kan forringe billedkvaliteten efter 100 h.p.f. - Forbered en 0,25 mg/ml pancuroniumbromidopløsning 14,19,29,30,31 ved at tilsætte 1 ml af en 2,5 mg/ml stamopløsning (se materialetabel) til 10 ml æggevand. Pancuroniumbromidopløsningen alivot i 1,5 ml mikrocentrifugeglas.
- Den forhåndsscreenede prøve overføres til petriskålen ved hjælp af en overførselspipette.
BEMÆRK: Prøv at overføre et minimum af ægvand med prøven. - Overfør 0,1 ml af pancuroniumbromidopløsningen til petriskålen til lammelse.
BEMÆRK: Pancuroniumbromid har en potentiel dæmpende effekt på neural aktivitet hos larvezebrafisk32. Det er vigtigt at overveje koncentrationen og varigheden af eksponeringen for pancuroniumbromid nøje.
2. 2% (WT / vol) agarosegel præparat
- Tænd for en varmeblok, og indstil måltemperaturen til 37 °C. Vent på, at enheden opvarmes og ekvilibreres ved den indstillede temperatur.
- Opløs 0,2 g agarosepulver med lavt smeltepunkt (se materialetabel) i 10 ml ægvand.
- Opvarm agaroseopløsningen i en mikrobølgeovn og bland den ved omrystning og hvirvelstrøm, indtil agaroseen er helt opløst.
- Agarosegelen alikvotes i 1,5 ml mikrocentrifugeglas og mikrocentrifugeglassene opbevares på varmeblokken (figur 2B).
BEMÆRK: Kontroller, om boblerne i agarosegelen er forsvundet.
3. Prøvemontering og positionering
- Kontroller prøven under et stereomikroskop for at kontrollere, at larvernes bevægelse er stoppet, og for at evaluere prøvens helbred visuelt ved at kontrollere dens hjerteslag (figur 2C). Hvis hjerteslaget er for langsomt, skal du kassere prøven.
BEMÆRK: Hvis hjerterytmen for den fisk, der afbildes, er for langsom (f.eks. under 60 slag i minuttet), er det muligvis ikke muligt at udføre langtidsbilleddannelse. For at vurdere fiskens velvære kan pulsen kontrolleres visuelt ved at sammenligne den med andre fisk i samme petriskål. Dette vil hjælpe med at sikre, at fisken, der afbildes, er sund og stabil nok til billeddannelsesproceduren. - Brug overførselspipetten til at placere en enkelt larvezebrafisk i agarosegelen i 1,5 ml mikrocentrifugerøret (figur 2D).
BEMÆRK: Sørg for at kassere pipetten efter overførsel af prøven. - Hæld agarosegelen i petriskålen for at lave en 1-2 mm frakke. Overfør prøven i mikrocentrifugerørene til petriskålen ved hjælp af overførselspipetten, så larven placeres i midten af skålen.
BEMÆRK: Hvis der er støv og bobler i agarosegelen, fjernes de ved hjælp af overførselspipetten. - Brug pincet til at placere prøven i den ønskede retning, så hoved og hale er flade (figur 2E).
- Drej prøven med pincet, så begge øjne er plane (figur 2F).
BEMÆRK: Justeringsprocedurer (position og rotation) skal være afsluttet, før agarosegelen begynder at størkne. - Efter justeringen ventes, indtil agarosegelen er størknet (figur 2G, H).
BEMÆRK: Ventetiden for agarosegelen til at størkne kan variere fra 5-10 min, afhængigt af gelens volumen og størrelse. - Efter størkning af agarosegelen fyldes petriskålen med ægvand og placeres petriskålen med den indlejrede prøve på mikroskoptrinnet (figur 2I).
4. Optagelse af billeder
- Tænd mikroskopsystemet (f.eks. lasere, konfokale controllere, mikroskop og computer; se materialetabel), og kontroller, at hele systemet fungerer.
- Vælg et objektivobjektiv med lav forstørrelse, og find prøven i midten af synsfeltet.
- Vælg et objektivobjektiv til nedsænkning eller vanddypning med korrekt forstørrelse (f.eks. 16x 0,8 numerisk blænde (NA) vanddyppeobjektiv; se materialetabel). Foretag finjusteringer af synsfeltet.
- Indstil billedparametrene (f.eks. billedstørrelse, lasereffekt, eksponeringstid, antal billeder) ved hjælp af billedoptagelsessoftware.
BEMÆRK: Indstil billedparametrene for at opnå de bedst mulige resultater til specifikke behov (se opsætningen for billedoptagelse i afsnittet om repræsentative resultater). Hvis billedet er mættet, skal du reducere lasereffekten. - Find prøvens hjerne ved at flytte scenen og bestemme dens tykkelse ved hjælp af live view-tilstand i softwaren ved at ændre fokusplanerne manuelt op og ned. Indstil lydstyrkens nedre og øvre grænser.
BEMÆRK: Sørg for, at hele hjernen er indeholdt i synsfeltet langs både laterale og aksiale retninger. - Indstil en z-trinstørrelse i betragtning af mikroskopets aksiale opløsning.
BEMÆRK: Den optimale z-trinstørrelse til billeddannelse af larvezebrafiskhjernen afhænger af billeddannelsesmodaliteten og mikroskopets opløsning. Som et eksempel blev der anvendt en z-trinstørrelse på 5 μm i betragtning af tykkelsen af lyspladen og den gennemsnitlige diameter af cellelegemerne10. - Fortsæt med billedoptagelsen for det indstillede synsfelt.
- For volumetrisk strukturel billeddannelse erhverver du et 3D-billede (x, y, z) af hele hjernen ved at ændre fokusplanerne og opnå 2-D-billeder af hvert z-plan sekventielt.
- For funktionel billeddannelse af et enkelt z-plan erhverves tidsseriebilleder (x, y, t) af hjernens neuronale aktivitet i en bestemt dybde.
- Til volumetrisk funktionel billeddannelse erhverver du et 4D-billede (x, y, z, t) af neuronaktiviteten i hele hjernen ved at opnå 3D-billeder sekventielt.
BEMÆRK: Indstil antallet af billeder under hensyntagen til computerens tilgængelige hukommelsesstørrelse. En erhvervelsestid på mindre end 1 time anbefales på grund af varigheden af virkningen af pancuroniumbromid.
- Når du har hentet billeder, skal du gemme resultaterne og registrere billedparametrene (f.eks. pixelstørrelse, z-trinstørrelse, billedhastighed, lasereffekt) til billedanalyse.
- Eksporter billederne i et passende format til datagengivelse og billedanalyse.
BEMÆRK: Det anbefales at eksportere billeder i format med tagget billedfil (TIF). TIF understøtter tabsfri billedkomprimering og er kompatibel med de fleste billedbehandlingsprogrammer og programmeringssprog. Derudover understøtter TIF-formatet inkludering af metadata, såsom erhvervelsesparametre, billedopløsning og anden relevant information, der kan hjælpe med datafortolkning og reproducerbarhed.
5. Opsætning af visualiseringer ved hjælp af napari
BEMÆRK: napari er en open source multidimensionel billedfremviser i et Python-miljø med grafikbehandlingsenhed (GPU)-baseret gengivelse33. Napari -animation plugin giver en programmatisk oprettelse af film. Brug af Fiji, et open source-billedbehandlingsprogram, anbefales til billedbehandling til generelle formål, såsom filtrering og geometrisk transformation (se materialetabel). Den kildekode, der bruges til visualiseringen ved hjælp af napari, er tilgængelig på GitHub (https://github.com/NICALab/Zebrafish-brain-visualization).
- Installer napari og napari-animation ved hjælp af enten pip eller conda. Efter installationen skal du oprette en ny jupyter notebook-fil.
BEMÆRK: Det anbefales at køre med jupyter notebook, som er et interaktivt værktøj til Python, frem for Python-scriptet. - Import napari og napari-animation.
6. Visualisering af strukturer ved hjælp af napari
- For at visualisere billeder og lave film af den gengivne zebrafiskhjerne skal du indlæse 3D-billedet (x, y, z) og åbne napari-vinduet. Tilslut napari-animation plugin (figur 3A).
- Angiv parametre som voxelstørrelse, farvekort og kontrastgrænser i lagkontrolelementerne.
- Juster seerindstillingerne (f.eks. perspektiv, vinkler) på lærredet.
- For at fange det gengivne billede skal du trykke på optageknappen i animationsguiden.
- For at generere film af den gengivne lydstyrke skal du ændre seerindstillingerne og tilføje nøglerammer (figur 3B).
- Når du har tilføjet nøglerammer, skal du angive antallet af billeder (trin) mellem nøglerammer i animationsguiden. Gem den gengivne animation.
7. Billedbehandling og visualisering af neuronal aktivitet ved hjælp af napari
BEMÆRK: For at visualisere tidsseriebillederne af neuronal aktivitet som overlejrede billeder af en statisk baggrund og aktivitet skal der anvendes en nedbrydningsalgoritme på de rå billeder. Brug en MATLAB-implementering af en nedbrydningsalgoritme kaldet BEAR24. MATLAB-versionen af BEAR er tilgængelig på GitHub (https://github.com/NICALab/BEAR).
- For at nedbryde den statiske baggrund og neuronal aktivitet skal du anvende BEAR på de rå tidsseriebilleder (x, y, t eller x, y, z, t). Efter nedbrydningen gemmes billederne af baggrunden og neuronaktiviteten som TIF-filer (figur 3C).
- Indlæs baggrunds- og neuronaktivitetsbillederne, og åbn napari-vinduet. Tilslut napari-animation plugin.
- Brug et gråt farvekort til baggrundsbilleder og et hot colormap til neuronale aktivitetsbilleder (figur 3C).
- Angiv parametre som opacitet og kontrastgrænser i lagkontrolelementerne.
- For at generere film med neuronal aktivitet skal du ændre seerindstillingerne og tilføje nøglerammer for at gengive animationen.
- Når du har tilføjet nøglerammer, skal du angive antallet af billeder (trin) mellem nøglerammer i animationsguiden. Gem den gengivne animation.
Representative Results
Strukturen og neuronal aktivitet af larvezebrafiskens hjerner, der udtrykker calciumindikator pan-neuronal GCaMP7a (Tg (huc: GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a))20,21,22 med en casper (mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9))34 baggrund blev afbildet ved 3-4 d.p.f. ved at følge den beskrevne protokol.
Til volumetrisk strukturel billeddannelse blev prøven afbildet ved hjælp af et kommercielt punkt-scanning konfokalmikroskopisystem udstyret med en 16x 0,8 NA vanddyppende objektivlinse. En 488 nm excitationslaser blev brugt til både strukturel og funktionel billeddannelse. Billedhastigheden, billedopløsningen, pixelstørrelsen og den aksiale trinstørrelse var henholdsvis 0,25 Hz, 2048 x 2048, 0,34 μm og 1,225 μm. Billedoptagelsen tog ca. 1 time og 20 min. Det volumetriske synsfelt for det erhvervede billede dækkede hjerneområderne i forhjernen, mellemhjernen og baghjernen (figur 4A). Neuronale cellelegemer af medulla oblongata, cerebellarplade, optisk tectum, habenula og dorsal telencephalon i hele hjernen hos 4 d.p.f. larvezebrafisk var tydeligt synlige i de konfokale mikroskopibilleder (figur 4B). 3D-gengivelsen af de konfokale mikroskopibilleder blev udført ved hjælp af napari27 ved at følge ovennævnte protokol (figur 4C og video 1).
Til funktionel billeddannelse i 2-D blev prøven afbildet ved hjælp af det samme konfokale mikroskopisystem, udstyret med en 16x 0,8 NA vanddyppende objektivlinse. Billedhastigheden, billedopløsningen og pixelstørrelsen var henholdsvis 2 Hz, 512 x 256 og 1,5 μm. De neuronale cellelegemer var tydeligt synlige i både baggrunden og den overlejrede neuronale aktivitet (figur 5A, B).
Til 3D-funktionel billeddannelse blev der anvendt et specialdesignet 3D-mikroskopisystem18 , som var i stand til in vivo-billeddannelse af neuronaktiviteten i en hel larvezebrafiskhjerne med et synsfelt på 1.040 μm × 400 μm × 235 μm og laterale og aksiale opløsninger på henholdsvis 1,7 μm og 5,4 μm. Billedhastigheden var op til 4, 2 volumener pr. Sekund. I lighed med gengivelse af de strukturelle billeddannelsesdata blev napari brugt til 3D-gengivelse af calciumbilleddata i hele hjernen (figur 5C og video 2).
Figur 1: Oversigt over forsøgsproceduren. Forberedelse af zebrafiskprøver og lammelse (trin 1). 2% (vægt / vol) agarosegelpræparat (trin 2). Prøvemontering og positionering (trin 3). Billedoptagelse (trin 4). Billedbehandling og visualisering af struktur og neuronal aktivitet (trin 5-7). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksperimentel procedure til fremstilling af helhjernebilleddannelse . (A) Screenet zebrafiskprøve, der udtrykker panneuronal GCaMP7a i en petriskål fyldt med ægvand. B) Udstyr og materiale, der kræves til montering og placering af prøver. (1) varmeblok ved 37 °C; (2) 2% (vægt/vol) agarosegel; (3) 1,5 ml mikrocentrifugerør 4) ægvand (5) 0,25 mg/ml pancuroniumbromidopløsning; (6) petriskål; (7) tang; (8) Overfør pipette. C) Stereomikroskopbillede af den lammede prøve. Den sorte pil peger på prøvens hjerte. (D) Prøven i 1,5 ml mikrocentrifugeglasset overføres ved hjælp af en pipette. Indsatsen viser en forstørret visning af boksområdet. (E) Prøven (sort pil) placeres i midten af petriskålen ved hjælp af pincet. (F) Prøven justeres ved hjælp af pincet. (G) Et eksempel på en forkert justeret indlejret prøve. (H) Et eksempel på en justeret indlejret prøve. (I) Prøven anbringes på et mikroskopstadium under objektivlinsen til billedoptagelse. Vægtstang: 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Visualisering af larvezebrafiskhjernebilleder . (A) 3D-gengivelse af et konfokalmikroskopibillede af en larvezebrafisk (4 d.p.f) hjerne, der udtrykker panneuronal GCaMP7a. napari, en open source multidimensionel billedfremviser i et Python-miljø, blev brugt til gengivelsen. Napari-vinduet består af lagkontrolelementer (rød boks), en lagliste (gul boks), et lærred (blå boks) og en animationsguide (grøn boks). (B) Nøglebilleder med flere fremviserindstillinger tilføjes til gengivelse af en animation. (C) Konfokalmikroskopi billede af 2-D time-lapse billeddannelse af neuronal aktivitet i larvezebrafiskhjernen. Billedet nedbrydes til baggrunden (venstre) og neuronal aktivitet (midten) og derefter overlejret (højre). Skalabjælke: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Billeddannelsesstruktur af en larvezebrafiskhjerne. (A) Maksimal intensitetsprojektion (MIP) af et konfokalmikroskopibillede af en larvezebrafisk (4 d.p.f.) hjerne, der udtrykker panneuronal GCaMP7a. Øverst: lateral MIP. Nederst: aksial MIP. Hver grænse indeholder forhjernen (rød), mellemhjernen (gul) og baghjernen (blå). (B) I alt 10 aksiale skiver i flere dybder fra et volumetrisk billede af hjernen (ved z = 25 μm, 50 μm, 75 μm, 100 μm, 125 μm, 150 μm, 175 μm, 200 μm, 225 μm, 250 μm, talt opad fra top til bund; z = 0 μm angiver hjernens øverste overflade). Hver hvid boks repræsenterer hjernens region (medulla oblongata, cerebellar plade, optisk tectum, habenula, og dorsal telencephalon). (C) Hele hjernen gengivet ved hjælp af napari. Skalabjælke: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Billeddannelse af neuronal aktivitet af en larvezebrafiskhjerne. (A) Konfokalmikroskopibillede af neuronal aktivitet i en larvezebrafisk (4 d.p.f.) hjerne, der udtrykker panneuronal GCaMP7a. Skalabjælke: 100 μm. (B) Forstørret billede af det indrammede område i A, der viser neuronal aktivitet i det optiske tektum på flere tidspunkter. Skalabjælke: 20 μm. (C) 3D-gengivelsen af hele hjernens neuronale aktivitet i larvezebrafiskhjernen erhvervet ved hjælp af et specialdesignet mikroskop (venstre: t = 133 s; højre: t = 901 s). Den neuronale aktivitet er overlejret på den statiske baggrund. Skalabjælke: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Time-lapse-billeddannelse med og uden prøvedrift. (A) Time-lapse-billeddannelse af larvezebrafiskens hjerne, der udtrykker panneuronal GCaMP7a med prøvedrift. Æggevand blev tilsat til prøven før størkning af agarosegelen (trin 3.6-3.7). Fisken bevægede sig i laterale og aksiale retninger. (B) Time-lapse billeddannelse af en larvezebrafiskhjerne uden prøvedrift. Æggevand blev tilsat til prøven efter størkning af agarosegelen (trin 3.6-3.7). Skalabjælke: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: 3D-gengivelse af hele hjernestrukturen i en larvezebrafisk (4 d.p.f.) hjerne, der udtrykker panneuronal GCaMP7a. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: 3D-gengivelse af helhjernens neuronale aktivitet i en larvezebrafisk (4 d.p.f.) hjerne, der udtrykker panneuronal GCaMP7a. Klik her for at downloade denne video.
Discussion
Den nuværende protokol muliggør in vivo helhjernebilleddannelse af larvezebrafisk over en længere periode (f.eks. længere end 1 time) og visualiseringer af de erhvervede strukturelle og funktionelle billeddata.
De mest kritiske trin er prøvemontering og positionering. Under prøveindlejring er det afgørende at forhindre bobledannelse og undgå støv i agarosegelen. Hvis gelen indeholder luftbobler og støv, kan billedkvaliteten blive alvorligt forringet. Når prøven placeres ved hjælp af pincet, er det vigtigt at sikre, at prøven er plan både vandret og lodret. Ellers er regionerne af interesse muligvis ikke indeholdt i mikroskopets synsfelt. Derudover skal denne positionering udføres inden for et kort tidsvindue før størkning af agarosegelen for at undgå at forårsage skade på overfladen, da en sådan skade kompromitterer billedkvaliteten.
En anden stor udfordring er at undgå bevægelse i billeder, der kommer fra ufuldstændig størkning af agarosegelen (figur 6) og lammelse af zebrafisken. Når der tilsættes ægvand til prøven inden fuldstændig størkning af agorsegelen, bevæger fisken sig langsomt både lateralt og aksialt, hvilket manifesterer sig som prøvedrift i tidsseriebillederne (figur 6A). Hvis dosis af paralytika er utilstrækkelig, eller virkningens varighed slutter, kan prøven forsøge at bevæge sig, hvilket fremstår som hurtige trækninger i time-lapse-billederne.
På trods af vigtigheden af de ovennævnte trin for at erhverve billeder af høj kvalitet uden bevægelsesartefakter giver offentligt tilgængelige protokoller 15,16,17,18,19 kun et kort overblik over den eksperimentelle procedure, der mangler disse detaljer. For eksempel lider de erhvervede billeder uden immobiliseringsprotokoller11 af betydelige bevægelsesartefakter, der gør nedstrøms billedanalysen udfordrende. Ved at integrere vigtige komponenter, såsom agarosegelstørkning og prøvelammelse, forbedrer vores protokol signifikant konsistensen i kvaliteten af erhvervede billeder, samtidig med at bevægelsesartefakter minimeres.
Sammenfattende beskrives en optimeret og reproducerbar eksperimentel procedure til in vivo-billeddannelse af larvezebrafiskhjernen. Gyldigheden og reproducerbarheden af denne protokol til in vivo-billeddannelse af hjerneaktivitet og -struktur er blevet bekræftet i flere indstillinger 14,18,29,30,31. Den nuværende arbejdsgang fokuserede på helhjernebilleddannelse af larvezebrafisk, men den kan let anvendes til billeddannelse af andre organer hos larvezebrafisk35,36.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Zebrafisklinjerne, der blev brugt til calciumbilleddannelse, blev leveret af Zebrafish Center for Disease Modeling (ZCDM), Korea. Denne forskning blev støttet af National Research Foundation of Korea (2020R1C1C1009869, NRF2021R1A4A102159411, RS-2023-00209473).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | SciLab | SL.Tub3513 | To aliquot agarose gel and pancuronium bromide solution |
| 15 mL Falcon tubes | Falcon | 352096 | To prepare agarose gel and pancuronium bromide solution |
| 16× 0.8NA water dipping objective lens | Nikon | CFI75 LWD 16×W | Objective lens for whole-brain imaging |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | 200 μM of 1-phenyl 2-thiourea (PTU) |
| 50 mL Falcon tubes | Falcon | 352070 | To prepare egg water |
| Disposable transfer pipette | SciLab | SL.Pip3032 | To transfer zebrafish larvae |
| Egg water | N/A | N/A | 0.6 g sea salt in 10 L deionized water |
| Forceps | Karl Hammacher GmbH | HSO 010-10 | Forceps used for sample positioning |
| Low melting point agarose | Thermo Scientific | R0801 | 2% (wt/vol) agarose gel |
| Napari | Napari | N/A | To visualize microscopy images in 3-D |
| NIS-Elements C | Nikon | N/A | Imaging software for confocal microscope |
| Pancuronium bromide | Sigma-Aldrich | P1918-10MG | 0.25 mg/mL of pancuronium bromide solution |
| Petri dish, 35 mm | SPL Life Sciences | 11035 | Petri dish used for sample embedding |
| Petri dish, 55 mm | SPL Life Sciences | 11050 | To prepare zebrafish larvae after screening |
| Point-scanning confocal microscopy system (C2 Plus) | Nikon | N/A | Confocal microscope for whole-brain imaging |
| Sea salt | Sigma-Aldrich | S9883-500G | Sea salt used for preparing egg water |
References
- Choi, T. -Y., Choi, T. -I., Lee, Y. -R., Choe, S. -K., Kim, C. -H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Experimental & Molecular Medicine. 53 (3), 310-317 (2021).
- Ahrens, M. B., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
- Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using selective plane illumination microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65 (2013).
- Bianco, I. H., Kampff, A. R., Engert, F. Prey capture behavior evoked by simple visual stimuli in larval zebrafish. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 101 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Piatkevich, K. D., et al. A robotic multidimensional directed evolution approach applied to fluorescent voltage reporters. Nature Chemical Biology. 14 (4), 352-360 (2018).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Looger, L., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. Biorxiv. , (2021).
- Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy. Nature Methods. 10 (5), 413-420 (2013).
- Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11 (7), 727-730 (2014).
- Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12 (12), 1171-1178 (2015).
- Ahrens, M. B., Engert, F.
- Yoon, Y. -G., et al. Sparse decomposition light-field microscopy for high speed imaging of neuronal activity. Optica. 7 (10), 1457-1468 (2020).
- Randlett, O., et al. Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas. Nature Methods. 12 (11), 1039-1046 (2015).
- Cong, L., et al. Rapid whole brain imaging of neural activity in freely behaving larval zebrafish (Danio rerio). eLife. 6, e28158 (2017).
- Bruzzone, M., et al. Whole brain functional recordings at cellular resolution in zebrafish larvae with 3D scanning multiphoton microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 11048 (2021).
- Cho, E. -S., Han, S., Lee, K. -H., Kim, C. -H., Yoon, Y. -G. 3DM: deep decomposition and deconvolution microscopy for rapid neural activity imaging. Optics Express. 29 (20), 32700-32711 (2021).
- Zhang, Z., et al. Imaging volumetric dynamics at high speed in mouse and zebrafish brain with confocal light field microscopy. NatureBiotechnology. 39 (1), 74-83 (2021).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Current Biology. 23 (4), 307-311 (2013).
- Köster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Developmental Biology. 233 (2), 329-346 (2001).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Morsch, M., et al. Triggering cell stress and death using conventional UV laser confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (120), e54983 (2017).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Parker, M. O., Brock, A. J., Millington, M. E., Brennan, C. H. Behavioral phenotyping of casper mutant and 1-pheny-2-thiourea treated adult zebrafish. Zebrafish. 10 (4), 466-471 (2013).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Han, S., Cho, E. -S., Park, I., Shin, K., Yoon, Y. -G. Efficient neural network approximation of robust PCA for automated analysis of calcium imaging data. Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention. , Springer International Publishing. 595-604 (2021).
- Shin, C., et al. Three-dimensional fluorescence microscopy through virtual refocusing using a recursive light propagation network. Medical Image Analysis. 82, 102600 (2022).
- Eom, M., et al. Statistically unbiased prediction enables accurate denoising of voltage imaging data. bioRxiv. , (2022).
- Johnston, L., et al. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (81), e51065 (2013).
- Sofroniew, N., et al. napari: a multi-dimensional image viewer for Python. Zenodo. , 3555620 (2022).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Voleti, V., et al. Real-time volumetric microscopy of in vivo dynamics and large-scale samples with SCAPE 2.0. Nature Methods. 16 (10), 1054-1062 (2019).
