Her præsenteres en protokol for in vivo helhjernebilleddannelse af larvezebrafisk ved hjælp af tredimensionel fluorescensmikroskopi. Den eksperimentelle procedure omfatter prøveforberedelse, billedoptagelse og visualisering.
Som et hvirveldyrs modeldyr er larvezebrafisk meget udbredt inden for neurovidenskab og giver en unik mulighed for at overvåge hele hjernens aktivitet ved cellulær opløsning. Her leverer vi en optimeret protokol til udførelse af helhjernebilleddannelse af larvezebrafisk ved hjælp af tredimensionel fluorescensmikroskopi, herunder prøveforberedelse og immobilisering, prøveindlejring, billedoptagelse og visualisering efter billeddannelse. Den nuværende protokol muliggør in vivo-billeddannelse af strukturen og neuronal aktivitet af en larvezebrafiskhjerne ved en cellulær opløsning i over 1 time ved hjælp af konfokalmikroskopi og specialdesignet fluorescensmikroskopi. De kritiske trin i protokollen diskuteres også, herunder prøvemontering og positionering, forebyggelse af bobledannelse og støv i agarosegelen og undgåelse af bevægelse i billeder forårsaget af ufuldstændig størkning af agarosegelen og lammelse af fisken. Protokollen er blevet valideret og bekræftet i flere indstillinger. Denne protokol kan let tilpasses til billeddannelse af andre organer hos en larvezebrafisk.
Zebrafisk (Danio rerio) er blevet bredt vedtaget som et mønsterhvirveldyr inden for neurovidenskab på grund af dets optiske gennemsigtighed på larvestadiet, dets hurtige udvikling, dets lave vedligeholdelsesomkostninger og tilgængeligheden af forskellige genetiske værktøjer 1,2,3,4. Især larvernes optiske gennemsigtighed kombineret med genetisk kodede fluorescerende reportere af biologiske begivenheder 5,6,7,8,9 giver en unik mulighed for at afbilde både neuronal aktivitet og struktur på hele hjerneniveau 10,11,12,13,14 . Men selv med et mikroskop, der understøtter cellulær opløsning, bevarer de erhvervede billeder ikke nødvendigvis informationen på enkeltcelleniveau; Den optiske billedkvalitet kan blive forringet på grund af den aberration, der indføres af agarosegelen, der anvendes til prøvemontering, fisken kan monteres i en vinkel, således at interesseområderne ikke er fuldt ud indeholdt i mikroskopets synsfelt, og fisken kan bevæge sig under optagelsen, hvilket forårsager bevægelsesartefakter i billederne eller forhindrer nøjagtig signalekstraktion fra billederne.
Således er en effektiv og reproducerbar protokol nødvendig for at erhverve billeddata af høj kvalitet med minimal støj og bevægelse. Desværre beskriver offentligt tilgængelige protokoller til billeddannelse af en hel hjerne af larvezebrafisk in vivo 15,16,17,18,19 kun kort proceduren, hvilket efterlader væsentlige dele af detaljerne, såsom agarosestørkning, præcise monteringsteknikker og prøvepositionering ved hjælp af tang, op til hver eksperimentalist. Derudover kan uoverensstemmelser i agarosekoncentration og immobiliseringsmetoder 10,11,14,15,16,17,18,19 føre til udfordringer som følge af fiskens bevægelse under billeddannelsesprocessen.
Her tilvejebringes en detaljeret protokol for helhjernebilleddannelse af larvezebrafisk ved hjælp af tredimensionel fluorescensmikroskopi. Figur 1 giver et grafisk overblik over protokollen: prøveforberedelse og immobilisering, prøveindlejring, billedoptagelse og visualisering efter billeddannelse. Den strukturelle og funktionelle billeddannelse af larvezebrafiskens hjerne in vivo demonstreres ved hjælp af et kommercielt konfokalmikroskop og et specialdesignet fluorescensmikroskop. Denne protokol kan skræddersys af praktikere til hjernebilleddannelse med visse sensoriske stimuli eller adfærdssammenhænge afhængigt af de eksperimentelle behov og design.
Den nuværende protokol muliggør in vivo helhjernebilleddannelse af larvezebrafisk over en længere periode (f.eks. længere end 1 time) og visualiseringer af de erhvervede strukturelle og funktionelle billeddata.
De mest kritiske trin er prøvemontering og positionering. Under prøveindlejring er det afgørende at forhindre bobledannelse og undgå støv i agarosegelen. Hvis gelen indeholder luftbobler og støv, kan billedkvaliteten blive alvorligt forringet. Når prøven placeres ved hjælp af pincet, er det vigtigt at sikre, at prøven er plan både vandret og lodret. Ellers er regionerne af interesse muligvis ikke indeholdt i mikroskopets synsfelt. Derudover skal denne positionering udføres inden for et kort tidsvindue før størkning af agarosegelen for at undgå at forårsage skade på overfladen, da en sådan skade kompromitterer billedkvaliteten.
En anden stor udfordring er at undgå bevægelse i billeder, der kommer fra ufuldstændig størkning af agarosegelen (figur 6) og lammelse af zebrafisken. Når der tilsættes ægvand til prøven inden fuldstændig størkning af agorsegelen, bevæger fisken sig langsomt både lateralt og aksialt, hvilket manifesterer sig som prøvedrift i tidsseriebillederne (figur 6A). Hvis dosis af paralytika er utilstrækkelig, eller virkningens varighed slutter, kan prøven forsøge at bevæge sig, hvilket fremstår som hurtige trækninger i time-lapse-billederne.
På trods af vigtigheden af de ovennævnte trin for at erhverve billeder af høj kvalitet uden bevægelsesartefakter giver offentligt tilgængelige protokoller 15,16,17,18,19 kun et kort overblik over den eksperimentelle procedure, der mangler disse detaljer. For eksempel lider de erhvervede billeder uden immobiliseringsprotokoller11 af betydelige bevægelsesartefakter, der gør nedstrøms billedanalysen udfordrende. Ved at integrere vigtige komponenter, såsom agarosegelstørkning og prøvelammelse, forbedrer vores protokol signifikant konsistensen i kvaliteten af erhvervede billeder, samtidig med at bevægelsesartefakter minimeres.
Sammenfattende beskrives en optimeret og reproducerbar eksperimentel procedure til in vivo-billeddannelse af larvezebrafiskhjernen. Gyldigheden og reproducerbarheden af denne protokol til in vivo-billeddannelse af hjerneaktivitet og -struktur er blevet bekræftet i flere indstillinger 14,18,29,30,31. Den nuværende arbejdsgang fokuserede på helhjernebilleddannelse af larvezebrafisk, men den kan let anvendes til billeddannelse af andre organer hos larvezebrafisk35,36.
The authors have nothing to disclose.
Zebrafisklinjerne, der blev brugt til calciumbilleddannelse, blev leveret af Zebrafish Center for Disease Modeling (ZCDM), Korea. Denne forskning blev støttet af National Research Foundation of Korea (2020R1C1C1009869, NRF2021R1A4A102159411, RS-2023-00209473).
1.5 mL microcentrifuge tube | SciLab | SL.Tub3513 | To aliquot agarose gel and pancuronium bromide solution |
15 mL Falcon tubes | Falcon | 352096 | To prepare agarose gel and pancuronium bromide solution |
16× 0.8NA water dipping objective lens | Nikon | CFI75 LWD 16×W | Objective lens for whole-brain imaging |
1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | 200 μM of 1-phenyl 2-thiourea (PTU) |
50 mL Falcon tubes | Falcon | 352070 | To prepare egg water |
Disposable transfer pipette | SciLab | SL.Pip3032 | To transfer zebrafish larvae |
Egg water | N/A | N/A | 0.6 g sea salt in 10 L deionized water |
Forceps | Karl Hammacher GmbH | HSO 010-10 | Forceps used for sample positioning |
Low melting point agarose | Thermo Scientific | R0801 | 2% (wt/vol) agarose gel |
Napari | Napari | N/A | To visualize microscopy images in 3-D |
NIS-Elements C | Nikon | N/A | Imaging software for confocal microscope |
Pancuronium bromide | Sigma-Aldrich | P1918-10MG | 0.25 mg/mL of pancuronium bromide solution |
Petri dish, 35 mm | SPL Life Sciences | 11035 | Petri dish used for sample embedding |
Petri dish, 55 mm | SPL Life Sciences | 11050 | To prepare zebrafish larvae after screening |
Point-scanning confocal microscopy system (C2 Plus) | Nikon | N/A | Confocal microscope for whole-brain imaging |
Sea salt | Sigma-Aldrich | S9883-500G | Sea salt used for preparing egg water |