यहां प्रस्तुत किया गया है तीन आयामी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लार्वा ज़ेबराफिश के विवो पूरे मस्तिष्क इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल है। प्रयोगात्मक प्रक्रिया में नमूना तैयारी, छवि अधिग्रहण और विज़ुअलाइज़ेशन शामिल हैं।
एक कशेरुक मॉडल जानवर के रूप में, लार्वा ज़ेबराफ़िश का व्यापक रूप से तंत्रिका विज्ञान में उपयोग किया जाता है और सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर पूरे मस्तिष्क की गतिविधि की निगरानी करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। यहां, हम तीन-आयामी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लार्वा ज़ेब्राफिश के पूरे मस्तिष्क इमेजिंग करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जिसमें नमूना तैयारी और स्थिरीकरण, नमूना एम्बेडिंग, छवि अधिग्रहण और इमेजिंग के बाद विज़ुअलाइज़ेशन शामिल है। वर्तमान प्रोटोकॉल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और कस्टम-डिज़ाइन किए गए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके 1 घंटे से अधिक समय तक सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर लार्वा ज़ेब्राफिश मस्तिष्क की संरचना और न्यूरोनल गतिविधि की विवो इमेजिंग में सक्षम बनाता है। प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों पर भी चर्चा की गई है, जिसमें नमूना चढ़ाना और स्थिति, अगारोस जेल में बुलबुला गठन और धूल को रोकना, और अगारोस जेल के अपूर्ण जमने और मछली के लकवाकरण के कारण छवियों में गति से बचना शामिल है। प्रोटोकॉल को कई सेटिंग्स में मान्य और पुष्टि की गई है। इस प्रोटोकॉल को लार्वा ज़ेबराफिश के अन्य अंगों की इमेजिंग के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
लार्वा चरण में इसकी ऑप्टिकल पारदर्शिता, इसके तेजी से विकास, इसकी कम रखरखाव लागत और विविध आनुवंशिक उपकरणों की उपलब्धता 1,2,3,4 के कारण जेब्राफिश (डेनियो रेरियो) को व्यापक रूप से तंत्रिका विज्ञान में एक मॉडल कशेरुक जानवर के रूप में अपनाया गया है। विशेष रूप से,जैविक घटनाओं 5,6,7,8,9 के आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के साथ संयुक्त लार्वा की ऑप्टिकल पारदर्शिता पूरे मस्तिष्क स्तर 10,11,12,13,14 पर न्यूरोनल गतिविधि और संरचना दोनों को चित्रित करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करती है।. हालांकि, सेलुलर रिज़ॉल्यूशन का समर्थन करने वाले माइक्रोस्कोप के साथ भी, अधिग्रहित छवियां आवश्यक रूप से एकल-सेल स्तर पर जानकारी को बनाए नहीं रखती हैं; नमूना माउंटिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले अगारोस जेल द्वारा पेश किए गए विचलन के कारण ऑप्टिकल छवि की गुणवत्ता खराब हो सकती है, मछली को एक कोण पर रखा जा सकता है, इस प्रकार रुचि के क्षेत्र माइक्रोस्कोप के दृश्य के क्षेत्र में पूरी तरह से निहित नहीं हैं, और मछली रिकॉर्डिंग के दौरान आगे बढ़ सकती है, जिससे छवियों में गति कलाकृतियां हो सकती हैं या छवियों से सटीक संकेत निष्कर्षण में बाधा उत्पन्न हो सकती है।
इस प्रकार, न्यूनतम शोर और गति के साथ उच्च गुणवत्ता वाले छवि डेटा प्राप्त करने के लिए एक प्रभावी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। दुर्भाग्य से, विवो 15,16,17,18,19 में लार्वा ज़ेबराफिश के पूरे मस्तिष्क की इमेजिंग के लिए सार्वजनिक रूप से उपलब्ध प्रोटोकॉल केवल संक्षेप में प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, विवरण के पर्याप्त हिस्से छोड़ते हैं, जैसे कि अगारोस ठोसकरण, सटीक माउंटिंग तकनीक, और प्रत्येक प्रयोगवादी तक बल का उपयोग करके नमूना स्थिति। इसके अलावा, अगारोस एकाग्रता और स्थिरीकरण विधियों 10,11,14,15,16,17,18,19 में विसंगतियां इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान मछली आंदोलन से उत्पन्न चुनौतियों का कारण बन सकती हैं।
यहां, त्रि-आयामी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लार्वा ज़ेब्राफिश के पूरे मस्तिष्क इमेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। चित्रा 1 प्रोटोकॉल का एक ग्राफिकल अवलोकन प्रदान करता है: नमूना तैयारी और स्थिरीकरण, नमूना एम्बेडिंग, छवि अधिग्रहण और इमेजिंग के बाद विज़ुअलाइज़ेशन। विवो में लार्वा ज़ेब्राफिश मस्तिष्क की संरचनात्मक और कार्यात्मक इमेजिंग एक वाणिज्यिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और एक कस्टम-डिज़ाइन किए गए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रदर्शित की जाती है। यह प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक आवश्यकताओं और डिजाइन के आधार पर कुछ संवेदी उत्तेजनाओं या व्यवहार संदर्भों के साथ मस्तिष्क इमेजिंग के लिए चिकित्सकों द्वारा तैयार किया जा सकता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल एक विस्तारित अवधि (जैसे, 1 घंटे से अधिक) में लार्वा ज़ेब्राफिश के विवो पूरे मस्तिष्क इमेजिंग और अधिग्रहित संरचनात्मक और कार्यात्मक इमेजिंग डेटा के विज़ुअलाइज़ेशन में सक्षम बनाता है।
सबसे महत्वपूर्ण कदम नमूना माउंटिंग और पोजिशनिंग हैं। नमूना एम्बेडिंग के दौरान, बुलबुला गठन को रोकना और एगारोस जेल में धूल से बचना महत्वपूर्ण है। यदि जेल में हवा के बुलबुले और धूल होती है, तो छवि की गुणवत्ता गंभीर रूप से खराब हो सकती है। फोर्सप्स का उपयोग करके नमूने की स्थिति रखते समय, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि नमूना क्षैतिज और लंबवत दोनों स्तर पर है। अन्यथा, माइक्रोस्कोप के दृश्य के क्षेत्र के भीतर रुचि के क्षेत्र शामिल नहीं हो सकते हैं। इसके अलावा, इस पोजिशनिंग को इसकी सतह को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए अगारोस जेल के जमने से पहले थोड़े समय की खिड़की के भीतर किया जाना चाहिए, क्योंकि इस तरह की क्षति छवि की गुणवत्ता से समझौता करती है।
एक और बड़ी चुनौती उन छवियों में गति से बचना है जो अगारोस जेल (चित्रा 6) के अधूरे जमने और ज़ेबराफिश के लकवाकरण से आते हैं। जब अंडे के पानी को एगोर्से जेल के पूर्ण जमने से पहले नमूने में जोड़ा जाता है, तो मछली धीरे-धीरे पार्श्व और अक्षीय दोनों रूप से चलती है, जो समय-श्रृंखला छवियों में नमूना बहाव के रूप में प्रकट होती है (चित्रा 6 ए)। यदि पक्षाघात की खुराक अपर्याप्त है या प्रभाव की अवधि समाप्त हो जाती है, तो नमूना स्थानांतरित करने का प्रयास कर सकता है, जो समय-चूक छवियों में तेजी से हिलने के रूप में दिखाई देता है।
गति कलाकृतियों के बिना उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए उपरोक्त चरणों के महत्व के बावजूद, सार्वजनिक रूप से उपलब्ध प्रोटोकॉल 15,16,17,18,19 प्रयोगात्मक प्रक्रिया का केवल एक संक्षिप्त अवलोकन प्रदान करते हैं, जिसमें इन विवरणों की कमी है। उदाहरण के लिए, स्थिरीकरण प्रोटोकॉल11 के बिना अधिग्रहित छवियां पर्याप्त गति कलाकृतियों से ग्रस्त हैं जो डाउनस्ट्रीम छवि विश्लेषण को चुनौतीपूर्ण बनाती हैं। आवश्यक घटकों को एकीकृत करके, जैसे कि एगारोस जेल ठोसकरण और नमूना पैरालिज़ेशन, हमारा प्रोटोकॉल गति कलाकृतियों को कम करते हुए अधिग्रहित छवियों की गुणवत्ता में स्थिरता को काफी बढ़ाता है।
सारांश में, लार्वा ज़ेबराफिश मस्तिष्क के विवो इमेजिंग में एक अनुकूलित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। मस्तिष्क गतिविधि और संरचना के विवो इमेजिंग में इस प्रोटोकॉल की वैधता और प्रजनन क्षमता की पुष्टि कई सेटिंग्स 14,18,29,30,31 में की गई है। वर्तमान वर्कफ़्लो लार्वा ज़ेबराफ़िश के पूरे मस्तिष्क इमेजिंग पर केंद्रित है, लेकिन इसे आसानी से लार्वा ज़ेबराफ़िश35,36 के अन्य अंगों की इमेजिंग के लिए लागू किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
कैल्शियम इमेजिंग के लिए उपयोग की जाने वाली ज़ेबराफ़िश लाइनें ज़ेबराफ़िश सेंटर फॉर डिजीज मॉडलिंग (जेडसीडीएम), कोरिया द्वारा प्रदान की गई थीं। इस शोध को नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (2020R1C1C1009869, NRF2021R1A4A102159411, RS-2023-00209473) द्वारा समर्थित किया गया था।
1.5 mL microcentrifuge tube | SciLab | SL.Tub3513 | To aliquot agarose gel and pancuronium bromide solution |
15 mL Falcon tubes | Falcon | 352096 | To prepare agarose gel and pancuronium bromide solution |
16× 0.8NA water dipping objective lens | Nikon | CFI75 LWD 16×W | Objective lens for whole-brain imaging |
1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | 200 μM of 1-phenyl 2-thiourea (PTU) |
50 mL Falcon tubes | Falcon | 352070 | To prepare egg water |
Disposable transfer pipette | SciLab | SL.Pip3032 | To transfer zebrafish larvae |
Egg water | N/A | N/A | 0.6 g sea salt in 10 L deionized water |
Forceps | Karl Hammacher GmbH | HSO 010-10 | Forceps used for sample positioning |
Low melting point agarose | Thermo Scientific | R0801 | 2% (wt/vol) agarose gel |
Napari | Napari | N/A | To visualize microscopy images in 3-D |
NIS-Elements C | Nikon | N/A | Imaging software for confocal microscope |
Pancuronium bromide | Sigma-Aldrich | P1918-10MG | 0.25 mg/mL of pancuronium bromide solution |
Petri dish, 35 mm | SPL Life Sciences | 11035 | Petri dish used for sample embedding |
Petri dish, 55 mm | SPL Life Sciences | 11050 | To prepare zebrafish larvae after screening |
Point-scanning confocal microscopy system (C2 Plus) | Nikon | N/A | Confocal microscope for whole-brain imaging |
Sea salt | Sigma-Aldrich | S9883-500G | Sea salt used for preparing egg water |