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Neuroscience

विवो में त्रि-आयामी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके ज़ेब्राफिश लार्वा की संपूर्ण मस्तिष्क इमेजिंग

Published: April 28, 2023 doi: 10.3791/65218
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1,3
1School of Electrical Engineering, KAIST, 2Department of Biology, Chungnam National University, 3KAIST Institute for Health Science and Technology

Summary

यहां प्रस्तुत किया गया है तीन आयामी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लार्वा ज़ेबराफिश के विवो पूरे मस्तिष्क इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल है। प्रयोगात्मक प्रक्रिया में नमूना तैयारी, छवि अधिग्रहण और विज़ुअलाइज़ेशन शामिल हैं।

Abstract

एक कशेरुक मॉडल जानवर के रूप में, लार्वा ज़ेबराफ़िश का व्यापक रूप से तंत्रिका विज्ञान में उपयोग किया जाता है और सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर पूरे मस्तिष्क की गतिविधि की निगरानी करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। यहां, हम तीन-आयामी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लार्वा ज़ेब्राफिश के पूरे मस्तिष्क इमेजिंग करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जिसमें नमूना तैयारी और स्थिरीकरण, नमूना एम्बेडिंग, छवि अधिग्रहण और इमेजिंग के बाद विज़ुअलाइज़ेशन शामिल है। वर्तमान प्रोटोकॉल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और कस्टम-डिज़ाइन किए गए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके 1 घंटे से अधिक समय तक सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर लार्वा ज़ेब्राफिश मस्तिष्क की संरचना और न्यूरोनल गतिविधि की विवो इमेजिंग में सक्षम बनाता है। प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों पर भी चर्चा की गई है, जिसमें नमूना चढ़ाना और स्थिति, अगारोस जेल में बुलबुला गठन और धूल को रोकना, और अगारोस जेल के अपूर्ण जमने और मछली के लकवाकरण के कारण छवियों में गति से बचना शामिल है। प्रोटोकॉल को कई सेटिंग्स में मान्य और पुष्टि की गई है। इस प्रोटोकॉल को लार्वा ज़ेबराफिश के अन्य अंगों की इमेजिंग के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

लार्वा चरण में इसकी ऑप्टिकल पारदर्शिता, इसके तेजी से विकास, इसकी कम रखरखाव लागत और विविध आनुवंशिक उपकरणों की उपलब्धता 1,2,3,4 के कारण जेब्राफिश (डेनियो रेरियो) को व्यापक रूप से तंत्रिका विज्ञान में एक मॉडल कशेरुक जानवर के रूप में अपनाया गया है। विशेष रूप से,जैविक घटनाओं 5,6,7,8,9 के आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के साथ संयुक्त लार्वा की ऑप्टिकल पारदर्शिता पूरे मस्तिष्क स्तर 10,11,12,13,14 पर न्यूरोनल गतिविधि और संरचना दोनों को चित्रित करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करती है।. हालांकि, सेलुलर रिज़ॉल्यूशन का समर्थन करने वाले माइक्रोस्कोप के साथ भी, अधिग्रहित छवियां आवश्यक रूप से एकल-सेल स्तर पर जानकारी को बनाए नहीं रखती हैं; नमूना माउंटिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले अगारोस जेल द्वारा पेश किए गए विचलन के कारण ऑप्टिकल छवि की गुणवत्ता खराब हो सकती है, मछली को एक कोण पर रखा जा सकता है, इस प्रकार रुचि के क्षेत्र माइक्रोस्कोप के दृश्य के क्षेत्र में पूरी तरह से निहित नहीं हैं, और मछली रिकॉर्डिंग के दौरान आगे बढ़ सकती है, जिससे छवियों में गति कलाकृतियां हो सकती हैं या छवियों से सटीक संकेत निष्कर्षण में बाधा उत्पन्न हो सकती है।

इस प्रकार, न्यूनतम शोर और गति के साथ उच्च गुणवत्ता वाले छवि डेटा प्राप्त करने के लिए एक प्रभावी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। दुर्भाग्य से, विवो 15,16,17,18,19 में लार्वा ज़ेबराफिश के पूरे मस्तिष्क की इमेजिंग के लिए सार्वजनिक रूप से उपलब्ध प्रोटोकॉल केवल संक्षेप में प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, विवरण के पर्याप्त हिस्से छोड़ते हैं, जैसे कि अगारोस ठोसकरण, सटीक माउंटिंग तकनीक, और प्रत्येक प्रयोगवादी तक बल का उपयोग करके नमूना स्थिति। इसके अलावा, अगारोस एकाग्रता और स्थिरीकरण विधियों 10,11,14,15,16,17,18,19 में विसंगतियां इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान मछली आंदोलन से उत्पन्न चुनौतियों का कारण बन सकती हैं।

यहां, त्रि-आयामी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लार्वा ज़ेब्राफिश के पूरे मस्तिष्क इमेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। चित्रा 1 प्रोटोकॉल का एक ग्राफिकल अवलोकन प्रदान करता है: नमूना तैयारी और स्थिरीकरण, नमूना एम्बेडिंग, छवि अधिग्रहण और इमेजिंग के बाद विज़ुअलाइज़ेशन। विवो में लार्वा ज़ेब्राफिश मस्तिष्क की संरचनात्मक और कार्यात्मक इमेजिंग एक वाणिज्यिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और एक कस्टम-डिज़ाइन किए गए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रदर्शित की जाती है। यह प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक आवश्यकताओं और डिजाइन के आधार पर कुछ संवेदी उत्तेजनाओं या व्यवहार संदर्भों के साथ मस्तिष्क इमेजिंग के लिए चिकित्सकों द्वारा तैयार किया जा सकता है।

Protocol

सभी जेब्राफिश प्रयोगों को केएआईएसटी (केए 2021-125) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। कैल्शियम संकेतक GCaMP7a [Tg(huc:GAL4) के पैन-न्यूरोनल अभिव्यक्ति के साथ कुल 12 वयस्क ज़ेबराफ़िश; प्रजनन के लिए एक कैस्पर [mitfa(w2/w2); mpv17(a9/a9)] पृष्ठभूमि पर Tg (UAS: GCaMP7a)] का उपयोग किया गया था। इस समूह में आठ महिलाएं और चार पुरुष शामिल थे, जिनकी उम्र 3 से 12 महीने तक भिन्न थी। निषेचन (डी.पी.एफ.) के 3-4 दिनों के बाद लार्वा जेब्राफिश पर इमेजिंग प्रयोग किए गए थे, एक चरण जिसके दौरान उनका लिंग निर्धारित नहीं किया जा सकता है।

1. जेब्राफिश नमूना तैयारी

  1. वांछित ट्रांसजेनिक लाइन की वयस्क मछली के प्रजनन के बाद भ्रूण एकत्र करें, जैसे कि टीजी (एचयूसी: जीएएल 4); टीजी (यूएएस: जीसीएएमपी 7 ए) 20,21,22, अंडे के पानी से भरे पेट्री डिश में (सामग्री की तालिका देखें)। भ्रूण को 28 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखें और उन्हें 3-4 डी.पी.एफ. लार्वा23,24,25 तक बढ़ाएं।
    1. यदि जेब्राफिश पृष्ठभूमि अल्बिनो नहीं है, तो रंजकता के गठन को रोकने के लिए, भ्रूण को 24 घंटे बाद निषेचन (एचपीएफ) पर अंडे के पानी से भरे पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें 200 μM 1-फिनाइल 2-थियोयूरिया (पीटीयू; सामग्री की तालिका देखें) 25,26 है। हर 24 घंटे में, मछली को ताजे अंडे के पानी के साथ एक नए पकवान में स्थानांतरित करें जिसमें 200 μM PTU होता है।
      नोट: जेब्राफिश को 28 डिग्री सेल्सियस और 14:10 घंटे प्रकाश: अंधेरे चक्र पर मानक परिस्थितियों में बनाए रखा जाता है। पीटीयू उपचार लार्वा ज़ेबराफिश27,28 के व्यवहार और थायरॉयड फ़ंक्शन को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है। इसलिए, सावधानी के साथ पीटीयू का उपयोग करना और किसी भी प्रयोग ों में संभावित भ्रामक कारकों को सावधानीपूर्वक नियंत्रित करना महत्वपूर्ण है।
  2. रुचि के फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, पैन-न्यूरोनल जीसीएएमपी 7 ए) को व्यक्त करने वाले नमूने को खोजने के लिए, एक एपि-फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत नमूना स्क्रीन करें और उज्ज्वल अभिव्यक्ति के साथ एक नमूना चुनें।
  3. अंडे के पानी से भरे पेट्री डिश में चयनित 3-4 डी.पी.एफ. ज़ेबराफिश का नमूना तैयार करें (चित्रा 2 ए)।
    नोट: सहज न्यूरोनल गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए, 80-100 h.p.f. के बीच आयु वर्ग के नमूनों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि सहज गतिविधि का स्तर 80 h.p.f. से पहले कम होता है और पिग्मेंटेशन विकास, यहां तक कि कैस्पर पृष्ठभूमि के साथ, 100 h.p.f के बाद छवि की गुणवत्ता को कम कर सकता है।
  4. अंडे के पानी के 10 मिलीलीटर में 2.5 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान (सामग्री की तालिका देखें) के 1 मिलीलीटर को जोड़कर 0.25 मिलीग्राम / एमएल पैंक्यूरोनियम ब्रोमाइड समाधान 14,19,29,30,31 तैयार करें। 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में पैंक्यूरोनियम ब्रोमाइड समाधान को एलिकोट करें।
  5. ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके प्री-स्क्रीन किए गए नमूने को पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
    नोट: नमूने के साथ अंडे के पानी की न्यूनतम मात्रा में ले जाने का प्रयास करें।
  6. पैरालिज़ेशन के लिए पेट्री डिश में पैंक्यूरोनियम ब्रोमाइड घोल के 0.1 एमएल को स्थानांतरित करें।
    नोट: पैंक्यूरोनियम ब्रोमाइड का लार्वा ज़ेबराफिश32 में तंत्रिका गतिविधि पर संभावित प्रभाव पड़ता है। पैंक्यूरोनियम ब्रोमाइड के संपर्क में आने की एकाग्रता और अवधि पर सावधानीपूर्वक विचार करना आवश्यक है।

2. 2% (डब्ल्यूटी / वॉल्यूम) एगारोस जेल तैयारी

  1. एक हीट ब्लॉक चालू करें और लक्ष्य तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। यूनिट के गर्म होने की प्रतीक्षा करें और निर्धारित तापमान पर संतुलन करें।
  2. अंडे के पानी के 10 मिलीलीटर में 0.2 ग्राम कम गलनांक अगारोस पाउडर ( सामग्री की तालिका देखें) घोलें।
  3. एक माइक्रोवेव में अगारोस के घोल को गर्म करें और इसे हिलाकर और भंवर करके मिलाएं जब तक कि अगारोस पूरी तरह से घुल न जाए।
  4. अगारोस जेल को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में विभाजित करें और हीट ब्लॉक (चित्रा 2 बी) पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को स्टोर करें।
    नोट: जांचें कि क्या अगारोस जेल में बुलबुले गायब हो गए हैं।

3. नमूना माउंटिंग और पोजिशनिंग

  1. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत नमूने की जांच करें ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि लार्वा आंदोलन बंद हो गया है और नमूने के दिल की धड़कन की जांच करके नमूने के स्वास्थ्य का मूल्यांकन करें (चित्रा 2 सी)। यदि दिल की धड़कन बहुत धीमी है, तो नमूने को छोड़ दें।
    नोट: यदि छवि बनाई जा रही मछली के दिल की धड़कन बहुत धीमी है (उदाहरण के लिए, 60 बीट प्रति मिनट से नीचे), तो दीर्घकालिक इमेजिंग करना संभव नहीं हो सकता है। मछली के कल्याण का आकलन करने के लिए, हृदय गति को उसी पेट्री डिश में अन्य मछलियों से तुलना करके नेत्रहीन रूप से जांचा जा सकता है। यह सुनिश्चित करने में मदद करेगा कि इमेजिंग प्रक्रिया के लिए छवि बनाई जा रही मछली स्वस्थ और स्थिर है।
  2. स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके, 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (चित्रा 2 डी) में अगारोस जेल में एक एकल लार्वा ज़ेबराफिश रखें।
    नोट: नमूना स्थानांतरित करने के बाद पिपेट को छोड़ना सुनिश्चित करें।
  3. 1-2 मिमी कोट बनाने के लिए पेट्री डिश में अगारोस जेल डालें। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में नमूने को ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, ताकि लार्वा को डिश के केंद्र में रखा जाए।
    नोट: यदि अगारोस जेल में धूल और बुलबुले हैं, तो उन्हें ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके हटा दें।
  4. वांछित अभिविन्यास में नमूने को रखने के लिए बल का उपयोग करें ताकि सिर और पूंछ सपाट हों (चित्रा 2 ई)।
  5. बल का उपयोग करके नमूने को घुमाएं ताकि दोनों आंखें समतल हों (चित्रा 2 एफ)।
    नोट: एगारोस जेल के जमने से पहले संरेखण प्रक्रियाओं (स्थिति और रोटेशन) को पूरा किया जाना चाहिए।
  6. संरेखण के बाद, तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि अगारोस जेल जम न जाए (चित्रा 2 जी, एच)।
    नोट: जेल की मात्रा और आकार के आधार पर एगारोस जेल को जमने के लिए प्रतीक्षा समय 5-10 मिनट तक हो सकता है।
  7. अगारोस जेल के जमने के बाद, पेट्री डिश को अंडे के पानी से भरें और पेट्री डिश को माइक्रोस्कोप चरण (चित्रा 2 आई) पर एम्बेडेड नमूने के साथ रखें।

4. छवि अधिग्रहण

  1. माइक्रोस्कोप सिस्टम (जैसे, लेजर, कॉन्फोकल नियंत्रक, माइक्रोस्कोप और कंप्यूटर; सामग्री की तालिका देखें) को चालू करें और सत्यापित करें कि पूरा सिस्टम काम कर रहा है।
  2. कम-आवर्धन उद्देश्य लेंस का चयन करें और दृश्य क्षेत्र के केंद्र में नमूना ढूंढें।
  3. उचित आवर्धन के साथ एक जल-विसर्जन या वाटर-डिपिंग ऑब्जेक्टिव लेंस का चयन करें (उदाहरण के लिए, 16x 0.8 संख्यात्मक एपर्चर (एनए) वाटर-डिपिंग लेंस; सामग्री की तालिका देखें)। दृश्य के क्षेत्र में अच्छा समायोजन करें।
  4. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके इमेजिंग पैरामीटर (जैसे, छवि आकार, लेजर पावर, एक्सपोज़र समय, फ्रेम की संख्या) सेट करें।
    नोट: विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए सर्वोत्तम संभव परिणाम प्राप्त करने के लिए इमेजिंग पैरामीटर सेट करें (प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में छवि अधिग्रहण के लिए सेटअप देखें)। यदि छवि संतृप्त है, तो लेजर शक्ति कम करें।
  5. चरण को स्थानांतरित करके नमूने के मस्तिष्क का पता लगाएं और फोकल विमानों को मैन्युअल रूप से ऊपर और नीचे बदलकर सॉफ्टवेयर में लाइव व्यू मोड का उपयोग करके इसकी मोटाई निर्धारित करें। वॉल्यूम की निचली और ऊपरी सीमाएँ सेट करें.
    नोट: सुनिश्चित करें कि पूरा मस्तिष्क पार्श्व और अक्षीय दोनों दिशाओं के साथ दृश्य के क्षेत्र में निहित है।
  6. माइक्रोस्कोप के अक्षीय रिज़ॉल्यूशन पर विचार करते हुए एक जेड-चरण आकार सेट करें।
    नोट: लार्वा ज़ेब्राफिश मस्तिष्क की इमेजिंग के लिए इष्टतम जेड-चरण आकार इमेजिंग साधन और माइक्रोस्कोप के रिज़ॉल्यूशन पर निर्भर करता है। एक उदाहरण के रूप में, प्रकाश शीट की मोटाई और सेल निकायों के औसत व्यास10 को देखते हुए 5 μm के z-step आकार का उपयोग किया गया था।
  7. दृश्य के सेट फ़ील्ड के लिए छवि अधिग्रहण के साथ आगे बढ़ें।
    1. वॉल्यूमेट्रिक संरचनात्मक इमेजिंग के लिए, फोकल विमानों को बदलकर और प्रत्येक जेड-प्लेन की 2-डी छवियों को क्रमिक रूप से प्राप्त करके पूरे मस्तिष्क की 3-डी छवि (एक्स, वाई, जेड) प्राप्त करें।
    2. एकल जेड-प्लेन की कार्यात्मक इमेजिंग के लिए, एक निश्चित गहराई पर मस्तिष्क की न्यूरोनल गतिविधि की समय-श्रृंखला छवियां (एक्स, वाई, टी) प्राप्त करें।
    3. वॉल्यूमेट्रिक कार्यात्मक इमेजिंग के लिए, क्रमिक रूप से 3-डी छवियों को प्राप्त करके पूरे मस्तिष्क में न्यूरोनल गतिविधि की 4-डी छवि (एक्स, वाई, जेड, टी) प्राप्त करें।
      नोट: कंप्यूटर के उपलब्ध स्मृति आकार पर विचार करते हुए फ़्रेम की संख्या सेट करें। पैंक्यूरोनियम ब्रोमाइड के प्रभाव की अवधि के कारण 1 घंटे से कम के अधिग्रहण समय की सिफारिश की जाती है।
  8. छवियों को प्राप्त करने के बाद, परिणामों को सहेजें और छवि विश्लेषण के लिए इमेजिंग पैरामीटर (जैसे, पिक्सेल आकार, जेड-चरण आकार, फ्रेम दर, लेजर पावर) रिकॉर्ड करें।
  9. डेटा रेंडरिंग और छवि विश्लेषण के लिए छवियों को उपयुक्त प्रारूप में निर्यात करें।
    नोट: टैग की गई छवि फ़ाइल (TIF) स्वरूप स्वरूप में छवियों को निर्यात करने की अनुशंसा की जाती है। टीआईएफ हानिरहित छवि संपीड़न का समर्थन करता है और अधिकांश छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर और प्रोग्रामिंग भाषाओं के साथ संगत है। इसके अतिरिक्त, TIF स्वरूप मेटाडेटा को शामिल करने का समर्थन करता है, जैसे अधिग्रहण पैरामीटर, छवि रिज़ॉल्यूशन और अन्य प्रासंगिक जानकारी जो डेटा व्याख्या और प्रजनन क्षमता में सहायता कर सकती है।

5. नापारी का उपयोग कर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए सेटअप

नोट: नापारी ग्राफिक्स प्रोसेसिंग यूनिट (जीपीयू) आधारित रेंडरिंग33 के साथ पायथन वातावरण में एक ओपन-सोर्स बहु-आयामी छवि दर्शक है। नापारी-एनीमेशन प्लगइन फिल्मों का एक प्रोग्रामेटिक निर्माण प्रदान करता है। फिजी का उपयोग करना, एक ओपन-सोर्स इमेज प्रोसेसिंग प्रोग्राम, सामान्य उद्देश्य छवि प्रसंस्करण के लिए अनुशंसित है, जैसे फ़िल्टरिंग और ज्यामितीय परिवर्तन ( सामग्री की तालिका देखें)। नापारी का उपयोग कर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए उपयोग किया जाने वाला स्रोत कोड GitHub (https://github.com/NICALab/Zebrafish-brain-visualization) पर उपलब्ध है।

  1. पिप या कोंडा का उपयोग करके नापारी और नापरी-एनीमेशन स्थापित करें। स्थापना के बाद, एक नई जुपिटर नोटबुक फ़ाइल बनाएँ।
    नोट: जुपिटर नोटबुक के साथ चलना, जो पायथन के लिए एक इंटरैक्टिव टूल है, पायथन स्क्रिप्ट पर अनुशंसित है।
  2. नापारी और नापरी-एनीमेशन आयात करें।

6. नापारी का उपयोग करके संरचनाओं की कल्पना करना

  1. छवियों की कल्पना करने और प्रस्तुत ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क की फिल्में बनाने के लिए, 3-डी छवि (एक्स, वाई, जेड) लोड करें और नापारी विंडो खोलें। नापारी-एनीमेशन प्लगइन कनेक्ट करें (चित्रा 3 ए)।
  2. परत नियंत्रण में वोक्सेल आकार, रंगमानचित्र और कंट्रास्ट सीमा जैसे पैरामीटर सेट करें।
  3. कैनवास में दर्शक सेटिंग्स (जैसे, परिप्रेक्ष्य, कोण) समायोजित करें।
  4. रेंडर की गई छवि को कैप्चर करने के लिए, ऐनिमेशन विज़ार्ड में कैप्चर बटन दबाएँ.
  5. रेंडर किए गए वॉल्यूम की फिल्में उत्पन्न करने के लिए, दर्शक सेटिंग्स को संशोधित करें और कुंजी फ़्रेम जोड़ें (चित्रा 3 बी)।
  6. कुंजी फ़्रेम जोड़ने के बाद, ऐनिमेशन विज़ार्ड में कुंजी फ़्रेम के बीच फ़्रेम (चरण) की संख्या सेट करें. रेंडर किए गए ऐनिमेशन को सहेजें.

7. नापारी का उपयोग करके न्यूरोनल गतिविधि की छवि प्रसंस्करण और कल्पना करना।

नोट: न्यूरोनल गतिविधि की समय-श्रृंखला छवियों को एक स्थिर पृष्ठभूमि और गतिविधि की ओवरलेडेड छवियों के रूप में देखने के लिए, कच्ची छवियों पर एक अपघटन एल्गोरिदम लागू किया जाना चाहिए। बेयर24 नामक अपघटन एल्गोरिथ्म के MATLAB कार्यान्वयन का उपयोग करें। BEAR का MATLAB संस्करण GitHub (https://github.com/NICALab/BEAR) पर उपलब्ध है।

  1. स्थैतिक पृष्ठभूमि और न्यूरोनल गतिविधि को विघटित करने के लिए, कच्चे समय-श्रृंखला छवियों (एक्स, वाई, टी या एक्स, वाई, जेड, टी) पर भालू लागू करें। अपघटन के बाद, पृष्ठभूमि और न्यूरोनल गतिविधि की छवियों को टीआईएफ फाइलों (चित्रा 3 सी) के रूप में सहेजें।
  2. पृष्ठभूमि और न्यूरोनल गतिविधि छवियों को लोड करें और नापारी विंडो खोलें। नापारी-एनीमेशन प्लगइन कनेक्ट करें.
  3. पृष्ठभूमि छवियों के लिए एक ग्रे रंग मानचित्र और न्यूरोनल गतिविधि छवियों (चित्रा 3 सी) के लिए एक गर्म रंगमानचित्र का उपयोग करें।
  4. परत नियंत्रण में अस्पष्टता और कंट्रास्ट सीमा जैसे पैरामीटर सेट करें।
  5. न्यूरोनल गतिविधि की फिल्में उत्पन्न करने के लिए, दर्शक सेटिंग्स को संशोधित करें और एनीमेशन को प्रस्तुत करने के लिए कुंजी फ्रेम जोड़ें।
  6. कुंजी फ़्रेम जोड़ने के बाद, ऐनिमेशन विज़ार्ड में कुंजी फ़्रेम के बीच फ़्रेम (चरण) की संख्या सेट करें. रेंडर किए गए ऐनिमेशन को सहेजें.

Representative Results

लार्वा ज़ेब्राफिश दिमाग की संरचना और न्यूरोनल गतिविधि कैल्शियम संकेतक पैन-न्यूरोनल जीसीएएमपी 7 ए (टीजी (एचयूसी: जीएएल 4) व्यक्त करती है; Tg (UAS: GCaMP7a))20,21,22 एक कैस्पर (mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9)34 पृष्ठभूमि के साथ वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करके 3-4 d.p.f. पर चित्रित किया गया था।

वॉल्यूमेट्रिक संरचनात्मक इमेजिंग के लिए, नमूना को 16x 0.8 एनए वाटर डिपिंग ऑब्जेक्टिव लेंस से लैस एक वाणिज्यिक बिंदु-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सिस्टम का उपयोग करके चित्रित किया गया था। संरचनात्मक और कार्यात्मक इमेजिंग दोनों के लिए एक 488 एनएम उत्तेजना लेजर का उपयोग किया गया था। फ्रेम दर, छवि रिज़ॉल्यूशन, पिक्सेल आकार और अक्षीय चरण आकार क्रमशः 0.25 हर्ट्ज, 2048 x 2048, 0.34 μm, और 1.225 μm थे। छवि अधिग्रहण में लगभग 1 घंटे और 20 मिनट लगे। अधिग्रहित छवि के वॉल्यूमेट्रिक क्षेत्र ने अग्रमस्तिष्क, मध्यमस्तिष्क और हिंडब्रेन के मस्तिष्क क्षेत्रों को कवर किया (चित्रा 4 ए)। 4 डी.पी.एफ. लार्वा जेब्राफिश के पूरे मस्तिष्क में मेडुला ओबोंगाटा, अनुमस्तिष्क प्लेट, ऑप्टिक टेक्टम, हैबेनुला और पृष्ठीय टेलेन्सेफ्लोन के न्यूरोनल सेल शरीर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों (चित्रा 4 बी) में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे। उपरोक्त प्रोटोकॉल (चित्रा 4 सी और वीडियो 1) का पालन करके नापारी27 का उपयोग करके कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों का 3-डी प्रतिपादन किया गया था।

2-डी में कार्यात्मक इमेजिंग के लिए, नमूना को उसी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सिस्टम का उपयोग करके चित्रित किया गया था, जो 16x 0.8 एनए वाटर डिपिंग ऑब्जेक्टिव लेंस से लैस था। फ्रेम दर, छवि रिज़ॉल्यूशन और पिक्सेल आकार क्रमशः 2 हर्ट्ज, 512 x 256 और 1.5 μm थे। न्यूरोनल सेल बॉडी पृष्ठभूमि और सुपरइम्पोज्ड न्यूरोनल गतिविधि (चित्रा 5 ए, बी) दोनों में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे।

3-डी कार्यात्मक इमेजिंग के लिए, एक कस्टम-डिज़ाइन 3-डी माइक्रोस्कोपी सिस्टम18 का उपयोग किया गया था, जो विवो इमेजिंग में 1,040 μm × 400 μm × 235 μm और 1.7 μm और 5.4 μm के पार्श्व और अक्षीय रिज़ॉल्यूशन के क्षेत्र के साथ पूरे लार्वा ज़ेबराफिश मस्तिष्क की न्यूरोनल गतिविधि को प्रदर्शित करने में सक्षम था। इमेजिंग दर 4.2 वॉल्यूम प्रति सेकंड तक थी। संरचनात्मक इमेजिंग डेटा प्रस्तुत करने के समान, नापारी का उपयोग पूरे मस्तिष्क कैल्शियम इमेजिंग डेटा (चित्रा 5 सी और वीडियो 2) के 3-डी प्रतिपादन के लिए किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक प्रक्रिया का अवलोकन। ज़ेबराफ़िश नमूना तैयारी और पक्षाघात (चरण 1)। 2% (wt / vol) Agarose जेल तैयारी (चरण 2)। नमूना माउंटिंग और पोजिशनिंग (चरण 3)। छवि अधिग्रहण (चरण 4)। छवि प्रसंस्करण और संरचना और न्यूरोनल गतिविधि की कल्पना (चरण 5-7)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पूरे मस्तिष्क इमेजिंग तैयार करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया । (ए) अंडे के पानी से भरे पेट्री डिश में पैन-न्यूरोनल जीसीएएमपी 7 ए व्यक्त करने वाले ज़ेब्राफिश के नमूने की जांच की गई। (बी) नमूना माउंटिंग और पोजिशनिंग के लिए आवश्यक उपकरण और सामग्री। (1) 37 डिग्री सेल्सियस पर हीट ब्लॉक; (2) 2% (डब्ल्यूटी / वॉल्यूम) एगारोस जेल; (3) 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब; (4) अंडे का पानी; (5) 0.25 मिलीग्राम / एमएल पैंक्यूरोनियम ब्रोमाइड समाधान; (6) पेट्री डिश; (7) बल; (8) स्थानांतरण पिपेट। (सी) लकवाग्रस्त नमूने की स्टीरियोमाइक्रोस्कोप छवि। काला तीर नमूने के दिल को इंगित करता है। (डी) 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में नमूना एक पिपेट का उपयोग करके स्थानांतरित किया जाता है। इनसेट बॉक्स किए गए क्षेत्र का एक बढ़ा हुआ दृश्य दिखाता है। (ई) नमूना (काला तीर) को पेट्री डिश के केंद्र में बल का उपयोग करके रखा जाता है। (एफ) नमूना बल का उपयोग करके संरेखित किया गया है। (जी) एक गलत संरेखित एम्बेडेड नमूने का एक उदाहरण। (एच) एक संरेखित एम्बेडेड नमूने का एक उदाहरण। (I) नमूना छवि अधिग्रहण के लिए उद्देश्य लेंस के तहत एक माइक्रोस्कोप चरण पर रखा गया है। स्केल बार: 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: लार्वा ज़ेबराफिश मस्तिष्क छवियों का दृश्य। (ए) पैन-न्यूरोनल जीसीएएमपी 7 ए को व्यक्त करने वाले लार्वा जेब्राफिश (4 डीपीएफ) मस्तिष्क की एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवि का 3-डी प्रतिपादन। नापारी, एक पायथन वातावरण में एक ओपन-सोर्स बहु-आयामी छवि दर्शक, प्रतिपादन के लिए उपयोग किया गया था। नापारी विंडो में परत नियंत्रण (लाल बॉक्स), एक परत सूची (पीला बॉक्स), एक कैनवास (नीला बॉक्स), और एक एनीमेशन विज़ार्ड (हरा बॉक्स) शामिल है। (बी) एनीमेशन प्रस्तुत करने के लिए कई दर्शक सेटिंग्स वाले कुंजी फ्रेम जोड़े जाते हैं। (सी) लार्वा ज़ेब्राफिश मस्तिष्क में न्यूरोनल गतिविधि की 2-डी टाइम-लैप्स इमेजिंग की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवि। छवि को पृष्ठभूमि (बाएं) और न्यूरोनल गतिविधि (मध्य) में विघटित किया जाता है, फिर ओवरलेड (दाएं)। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: लार्वा ज़ेब्राफिश मस्तिष्क की इमेजिंग संरचना। (ए) पैन-न्यूरोनल जीसीएएमपी 7 ए को व्यक्त करने वाले लार्वा जेब्राफिश (4 डीपीएफ) मस्तिष्क की एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवि का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (एमआईपी)। शीर्ष: पार्श्व एमआईपी। नीचे: अक्षीय एमआईपी। प्रत्येक सीमा में फोरब्रेन (लाल), मिडब्रेन (पीला), और हिंडब्रेन (नीला) होता है। (बी) मस्तिष्क की वॉल्यूमेट्रिक छवि से कई गहराई पर कुल 10 अक्षीय स्लाइस (z = 25 μm, 50 μm, 75 μm, 100 μm, 125 μm, 150 μm, 175 μm, 200 μm, 225 μm, 250 μm, ऊपर से नीचे तक गिना जाता है; z = 0 μm मस्तिष्क की ऊपरी सतह को इंगित करता है)। प्रत्येक सफेद बॉक्स मस्तिष्क के क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है (मेडुला ओबोंगाटा, अनुमस्तिष्क प्लेट, ऑप्टिक टेक्टम, हेबेनुला और पृष्ठीय टेलेसेफ्लोन)। (सी) नापारी का उपयोग करके पूरा मस्तिष्क प्रदान किया गया। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: लार्वा ज़ेबराफिश मस्तिष्क की इमेजिंग न्यूरोनल गतिविधि। (ए) एक लार्वा ज़ेबराफिश (4 डी.पी.एफ.) मस्तिष्क में न्यूरोनल गतिविधि की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवि पैन-न्यूरोनल जीसीएएमपी 7 ए व्यक्त करती है। स्केल बार: 100 μm. (B) A में बॉक्स किए गए क्षेत्र का बढ़ा हुआ दृश्य कई समय बिंदुओं पर ऑप्टिक टेक्टम में न्यूरोनल गतिविधि को दर्शाता है। (सी) लार्वा ज़ेब्राफिश मस्तिष्क में पूरे मस्तिष्क की न्यूरोनल गतिविधि का 3-डी प्रतिपादन एक कस्टम-डिज़ाइन किए गए माइक्रोस्कोप (बाएं: टी = 133 एस; दाएं: टी = 901 एस) का उपयोग करके प्राप्त किया गया है। न्यूरोनल गतिविधि को स्थैतिक पृष्ठभूमि पर सुपरइम्पोज किया जाता है। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: नमूना बहाव के साथ और बिना टाइम-लैप्स इमेजिंग। (ए) नमूना बहाव के साथ पैन-न्यूरोनल जीसीएएमपी 7 ए को व्यक्त करने वाले लार्वा जेब्राफिश मस्तिष्क की टाइम-लैप्स इमेजिंग। अगारोस जेल (चरण 3.6-3.7) के जमने से पहले अंडे का पानी नमूने में जोड़ा गया था। मछली पार्श्व और अक्षीय दिशाओं में चली गई। (बी) नमूना बहाव के बिना लार्वा ज़ेब्राफिश मस्तिष्क की टाइम-लैप्स इमेजिंग। अगारोस जेल (चरण 3.6-3.7) के जमने के बाद अंडे का पानी नमूने में जोड़ा गया था। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1: पैन-न्यूरोनल जीसीएएमपी 7 ए को व्यक्त करने वाले लार्वा जेब्राफिश (4 डी.पी.एफ.) मस्तिष्क की संपूर्ण मस्तिष्क संरचना का 3-डी प्रतिपादन। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

वीडियो 2: पैन-न्यूरोनल जीसीएएमपी 7 ए को व्यक्त करने वाले लार्वा ज़ेबराफिश (4 डी.पी.एफ.) मस्तिष्क में पूरे मस्तिष्क की न्यूरोनल गतिविधि का 3-डी प्रतिपादन। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल एक विस्तारित अवधि (जैसे, 1 घंटे से अधिक) में लार्वा ज़ेब्राफिश के विवो पूरे मस्तिष्क इमेजिंग और अधिग्रहित संरचनात्मक और कार्यात्मक इमेजिंग डेटा के विज़ुअलाइज़ेशन में सक्षम बनाता है।

सबसे महत्वपूर्ण कदम नमूना माउंटिंग और पोजिशनिंग हैं। नमूना एम्बेडिंग के दौरान, बुलबुला गठन को रोकना और एगारोस जेल में धूल से बचना महत्वपूर्ण है। यदि जेल में हवा के बुलबुले और धूल होती है, तो छवि की गुणवत्ता गंभीर रूप से खराब हो सकती है। फोर्सप्स का उपयोग करके नमूने की स्थिति रखते समय, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि नमूना क्षैतिज और लंबवत दोनों स्तर पर है। अन्यथा, माइक्रोस्कोप के दृश्य के क्षेत्र के भीतर रुचि के क्षेत्र शामिल नहीं हो सकते हैं। इसके अलावा, इस पोजिशनिंग को इसकी सतह को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए अगारोस जेल के जमने से पहले थोड़े समय की खिड़की के भीतर किया जाना चाहिए, क्योंकि इस तरह की क्षति छवि की गुणवत्ता से समझौता करती है।

एक और बड़ी चुनौती उन छवियों में गति से बचना है जो अगारोस जेल (चित्रा 6) के अधूरे जमने और ज़ेबराफिश के लकवाकरण से आते हैं। जब अंडे के पानी को एगोर्से जेल के पूर्ण जमने से पहले नमूने में जोड़ा जाता है, तो मछली धीरे-धीरे पार्श्व और अक्षीय दोनों रूप से चलती है, जो समय-श्रृंखला छवियों में नमूना बहाव के रूप में प्रकट होती है (चित्रा 6 ए)। यदि पक्षाघात की खुराक अपर्याप्त है या प्रभाव की अवधि समाप्त हो जाती है, तो नमूना स्थानांतरित करने का प्रयास कर सकता है, जो समय-चूक छवियों में तेजी से हिलने के रूप में दिखाई देता है।

गति कलाकृतियों के बिना उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए उपरोक्त चरणों के महत्व के बावजूद, सार्वजनिक रूप से उपलब्ध प्रोटोकॉल 15,16,17,18,19 प्रयोगात्मक प्रक्रिया का केवल एक संक्षिप्त अवलोकन प्रदान करते हैं, जिसमें इन विवरणों की कमी है। उदाहरण के लिए, स्थिरीकरण प्रोटोकॉल11 के बिना अधिग्रहित छवियां पर्याप्त गति कलाकृतियों से ग्रस्त हैं जो डाउनस्ट्रीम छवि विश्लेषण को चुनौतीपूर्ण बनाती हैं। आवश्यक घटकों को एकीकृत करके, जैसे कि एगारोस जेल ठोसकरण और नमूना पैरालिज़ेशन, हमारा प्रोटोकॉल गति कलाकृतियों को कम करते हुए अधिग्रहित छवियों की गुणवत्ता में स्थिरता को काफी बढ़ाता है।

सारांश में, लार्वा ज़ेबराफिश मस्तिष्क के विवो इमेजिंग में एक अनुकूलित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। मस्तिष्क गतिविधि और संरचना के विवो इमेजिंग में इस प्रोटोकॉल की वैधता और प्रजनन क्षमता की पुष्टि कई सेटिंग्स 14,18,29,30,31 में की गई है। वर्तमान वर्कफ़्लो लार्वा ज़ेबराफ़िश के पूरे मस्तिष्क इमेजिंग पर केंद्रित है, लेकिन इसे आसानी से लार्वा ज़ेबराफ़िश35,36 के अन्य अंगों की इमेजिंग के लिए लागू किया जा सकता है।

Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

कैल्शियम इमेजिंग के लिए उपयोग की जाने वाली ज़ेबराफ़िश लाइनें ज़ेबराफ़िश सेंटर फॉर डिजीज मॉडलिंग (जेडसीडीएम), कोरिया द्वारा प्रदान की गई थीं। इस शोध को नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (2020R1C1C1009869, NRF2021R1A4A102159411, RS-2023-00209473) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube SciLab SL.Tub3513 To aliquot agarose gel and pancuronium bromide solution
15 mL Falcon tubes Falcon 352096 To prepare agarose gel and pancuronium bromide solution
16× 0.8NA water dipping objective lens Nikon CFI75 LWD 16×W Objective lens for whole-brain imaging
1-phenyl 2-thiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-10G 200 μM of 1-phenyl 2-thiourea (PTU)
50 mL Falcon tubes Falcon 352070 To prepare egg water
Disposable transfer pipette SciLab SL.Pip3032 To transfer zebrafish larvae
Egg water N/A N/A 0.6 g sea salt in 10 L deionized water
Forceps Karl Hammacher GmbH HSO 010-10 Forceps used for sample positioning
Low melting point agarose Thermo Scientific R0801 2% (wt/vol) agarose gel
Napari Napari N/A To visualize microscopy images in 3-D
NIS-Elements C Nikon N/A Imaging software for confocal microscope
Pancuronium bromide Sigma-Aldrich P1918-10MG 0.25 mg/mL of pancuronium bromide solution
Petri dish, 35 mm SPL Life Sciences 11035 Petri dish used for sample embedding
Petri dish, 55 mm SPL Life Sciences 11050 To prepare zebrafish larvae after screening
Point-scanning confocal microscopy system (C2 Plus) Nikon N/A Confocal microscope for whole-brain imaging
Sea salt  Sigma-Aldrich S9883-500G Sea salt used for preparing egg water

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तंत्रिका विज्ञान अंक 194
<em>विवो में</em> त्रि-आयामी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके ज़ेब्राफिश लार्वा की संपूर्ण मस्तिष्क इमेजिंग
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Cho, E. S., Han, S., Kim, G., Eom,… More

Cho, E. S., Han, S., Kim, G., Eom, M., Lee, K. H., Kim, C. H., Yoon, Y. G. In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (194), e65218, doi:10.3791/65218 (2023).

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