Summary
I denna artikel beskrivs ett protokoll för manuell tyramidsignalförstärkning (TSA) multiplex immunofluorescens (mIF) kombinerat med bildanalys och rumslig analys. Detta protokoll kan användas med formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) sektioner för färgning av två till sex antigener per glas beroende på vilken glidskanner som finns i laboratoriet.
Abstract
Tumörmikromiljön (TME) består av en uppsjö av olika celltyper, såsom cytotoxiska immunceller och immunmodulerande celler. Beroende på dess sammansättning och interaktionerna mellan cancerceller och peritumörceller kan TME påverka cancerprogressionen. Karakteriseringen av tumörer och deras komplexa mikromiljö kan förbättra förståelsen för cancersjukdomar och kan hjälpa forskare och kliniker att upptäcka nya biomarkörer.
Vi utvecklade nyligen flera multiplex immunofluorescenspaneler (mIF) baserade på tyramidsignalamplifiering (TSA) för karakterisering av TME i kolorektal cancer, skivepitelcancer i huvud och hals, melanom och lungcancer. När färgningen och skanningen av motsvarande paneler är klar analyseras proverna på en bildanalysprogramvara. Den rumsliga positionen och färgningen av varje cell exporteras sedan från denna kvantifieringsprogramvara till R. Vi utvecklade R-skript som gör det möjligt för oss att inte bara analysera densiteten hos varje celltyp i flera tumörkompartment (t.ex. tumörens centrum, tumörens marginal och stroma) utan också att utföra avståndsbaserade analyser mellan olika celltyper.
Detta speciella arbetsflöde lägger till en rumslig dimension till den klassiska densitetsanalysen som redan rutinmässigt utförs för flera markörer. mIF-analys kan göra det möjligt för forskare att få en bättre förståelse för den komplexa interaktionen mellan cancerceller och TME och att upptäcka nya prediktiva biomarkörer för svar på behandlingar, såsom immuncheckpointhämmare och riktade terapier.
Introduction
Med utvecklingen av riktade terapier och immuncheckpointhämmare har det blivit av yttersta vikt att bättre karakterisera interaktionerna mellan cancerceller och deras tumörmikromiljö, och detta är för närvarande ett viktigt område för translationell forskning. TME består av en uppsjö av olika celltyper, med en balans av immuncytotoxiska celler riktade mot cancercellerna och immunmodulerande celler som kan gynna tumörtillväxt och invasivitet 1,2,3,4. Karakteriseringen av denna komplexa miljö kan förbättra förståelsen av cancersjukdomar och kan hjälpa forskare och kliniker att upptäcka nya prediktiva och prognostiska biomarkörer för att bättre välja patienter för framtida behandling 5,6. Till exempel utvecklade Galon och hans team Immunoscore, som är en reproducerbar poängmetod som kan användas som en prediktiv biomarkör. Immunoscore beräknas med hjälp av densiteten hos CD3 + och CD8 + T-celler i den invasiva marginalen och i mitten av tumören 7,8.
Under de senaste decennierna har kommersiella lösningar för mIF utvecklats, men dessa är ofta dyra och utformade för specifika paneler av antigener. För att övervinna behovet av specifika paneler av antigener i akademisk och translationell forskning utvecklade vi en kostnadseffektiv metod för att utföra mIF på FFPE-tumörsektioner, vilket möjliggör färgning av två till sex antigener tillsatta till cellkärnorna motfärgning på humana och musprover.
När hela vävnadssnittet är färgat och skannat med en fluorescensbildskanner kan proverna analyseras av flera bildanalysprogram som stöder stora pyramidala dataset. Slutligen kan rådata användas i en miljö för statistisk databehandling och grafik som R-programvaran (v.4.0.2) för att utföra densitets- och rumsbaserade analyser.
Ett protokoll optimerat för färgning med fem markörer, samt knep och tips för att optimera nya paneler, presenteras i detta manuskript. Dessutom förklaras detaljerade steg i bildanalysen och R-funktionerna som används för den statistiska och rumsliga analysen.
Protocol
Alla prover som används i detta protokoll kommer från en studie som godkänts av de lokala etiska kommittéerna och godkänts av den behöriga myndigheten. Alla deltagare i studien gav skriftligt informerat samtycke. Studien är registrerad hos ClinicalTrials.gov (NCT03608046).
1. Multiplex immunofluorescens
- FFPE sektionering
- Fixa vävnaden i 4% paraformaldehyd och bädda in den fasta vävnaden i paraffin.
- Skär 5 μm sektioner och placera dem på självhäftande mikroskopglas.
- Torka glasen över natten vid rumstemperatur (RT).
- Deparaffinisering och hämning av endogena peroxidaser
- Avvaxa vävnaderna genom att sänka ner objektglasen i toluen (3x i 5 min vardera) och metanol (3x i 5 min vardera) under ett dragskåp.
- Hämma de endogena peroxidaserna genom att sänka ner objektglasen i 3% väteperoxid utspädd i metanol i 20 minuter under en dragskåp.
- Skölj glasen i destillerat (d)H2O(1x i 3 min).
- Multiplex immunofluorescensfärgning
- Sänk ner objektglasen i en 300 ml färgningsburk innehållande 10 mM citrat (pH 6) eller EDTA (pH 9) buffert kompletterad med 0,1% TritonX-100.
Anmärkning: Vilken buffert som används (pH 6 eller pH 9) beror på det färgade antigenet (se tabell 1). - Placera färgningsburken med locket stängt i en mikrovågsugn i 3-5 minuter med maximal effekt (t.ex. 900 W) tills bufferten börjar koka.
OBS: Den optimala tiden för kokning beror på mikrovågsugnen och buffertens volym. Justeringar kan vara nödvändiga för att hitta den perfekta tidpunkten. För vissa ömtåliga antigener eller ömtåliga och mindre vidhäftande prover (t.ex. organoider och sfäroider) kan mikrovågskokning vara för hård. I detta fall kan en tryckkokare användas istället. - Håll bufferten vid nära koktemperatur genom att placera den stängda färgningsburken i mikrovågsugnen på låg effekt (t.ex. 90 W) i 15 minuter.
- Utför det sista steget av uppvärmning genom att sätta mikrovågsugnen på maximal effekt i 90 sekunder.
- Ta ut burken ur mikrovågsugnen och låt bufferten svalna i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Skölj objektglasen 3x i 5 minuter vardera i dH2Ooch 1x i 5 min i trisbuffrad saltlösning innehållande 0,1% Tween 20 (TBS-T).
- Ta bort TBS-T genom att blotta bilderna på en pappershandduk
- Placera objektglasen (platta) på en färgningskammare eller mikroskoplåda (se Materialförteckning).
- Omsluta vävnaden med en hydrofob penna.
- Blockera de ospecifika bindningsställena genom att täcka vävnaden med 5 % bovint serumalbumin (BSA) upplöst i TBS-T i 30 minuter.
- Ta bort blockeringsbufferten genom att blotta bilderna på en pappershandduk.
OBS: Skölj inte glasen efter blockeringssteget. - Inkubera vävnaden i 60 minuter med den primära antikroppen (se tabell 1) utspädd i 1 % BSA TBS-T genom att täcka vävnaden med cirka 300 μl av lösningen.
- Skölj objektglasen 3x i 3 minuter vardera med TBS-T.
- Inkubera vävnaden i 40 minuter med poly-HRP sekundär antikropp (se tabell 1) genom att täcka vävnaden med cirka 300 μl av lösningen.
- Skölj glasen 3x i 3 min med TBS-T.
- Inkubera vävnaden i 10 minuter med fluorkrom-tyramidreagens (se tabell 1) utspätt 200 gånger i boratbuffert (0,1 M borat, pH 7,8, 3 M NaCl) extemporekompletterat med 0,003 %H2O2genom att täcka vävnaden med cirka 300 μl av lösningen.
- Skölj glasen 3x i 3 min med TBS-T.
- Upprepa steg 1.3.1-1.3.16 tills all TSA-färgning har utförts.
- Inkubera vävnaden över natten vid 4 °C med den sista primära antikroppen (se tabell 1) utspädd i 1 % BSA TBS-T.
OBS: Eftersom inkubationen är över natten är det viktigt att täcka färgningskammarbrickan eller mikroskopglidboxen och att tillsätta dH2O på en pappershandduk i botten av lådan (under glasen) för att se till att vävnaderna inte torkar under inkubationen. - Skölj vävnaden 3x i 5 minuter vardera med TBS-T.
- Inkubera vävnaden i 120 minuter med den sekundära antikroppen (direkt kopplad till fluorokrom) utspädd 200 gånger i 1% BSA TBS-T.
- Skölj vävnaden 3x i 5 minuter vardera med TBS-T.
- Färga kärnorna genom att inkubera vävnaden i 5 minuter i bisbensimid (20 mM) utspädd 1 000 gånger i 10% BSA TBS-T.
OBS: Bisbensimid kan ersättas med DAPI, men den senare är giftigare och måste hanteras försiktigt under en dragskåp. - Skölj vävnaden 3x i 3 min vardera i dH2O.
- Montera objektglasen med hjälp av ett fluorescensmonteringsmedium och borosilikatskyddsglas.
- Sänk ner objektglasen i en 300 ml färgningsburk innehållande 10 mM citrat (pH 6) eller EDTA (pH 9) buffert kompletterad med 0,1% TritonX-100.
2. Bildskanning
- Digitalisera objektglasen genom att skanna dem på en fluorescensskanner med 20x förstoring (detaljer om bildskannern finns i materialförteckningen).
OBS: En representativ skanning av en optimal multiplex visas i figur 1.
3. Bildanalys
- Importera skanningarna till ett bildanalysprogram (File > Open Image).
- Gå till fliken Klassificerare och välj plugin-programmet DenseNet AI V2 .
- Träna DenseNet AI V2-plugin-programmet att känna igen kärnor genom att omge cirka 500 kärnor i en bild.
- Träna AI på flera andra bilder från samma sats och olika satser av mIF-färgning genom att omge flera kärnor (50) på flera bilder (cirka 10).
OBS: Detaljerade instruktioner om hur du använder AI-plugin finns i programvaruhandboken. Att använda AI för kärndetektering är valfritt. Andra metoder för att detektera kärnor är tillgängliga beroende på vilken bildanalysprogramvara som används. - Spara den tränade AI:n (klassificeraråtgärder > spara).
- Gå till fliken Anteckningar och skapa en anteckning för varje region av intresse (ROI), till exempel tumörens centrum och tumörens marginal, med hjälp av pennanteckningsverktyget.
- Om det behövs tar du bort områden med veck och områden som ser suddiga ut med verktyget för uteslutningsanteckningar.
OBS: Hematoxylin-eosinfärgning av en sektion intill den som används för mIF kan utföras före mIF-färgningen för att säkerställa att tumörceller finns i provet och för att hjälpa anatomiska patologer att bestämma avkastningen. - Gå till fliken Analys och välj HighPlex FL-algoritmen (Inställningar Åtgärder > Läs in > HighPlex FL).
- Välj fliken Färgval och välj den färgfärg du är intresserad av.
- På fliken Nukleär identifiering går du till Kärnsegmenteringstyp och väljer Anpassad AI.
- I Nuclear Segmentation Classifier väljer du den AI som sparades i steg 3.5.
- På fliken Membran- och cytoplasmadetektering valde du den maximala cytoplasmaradien (i denna studie användes 1,5) och antalet membranfärgämnen.
- För varje färgämne väljer du kärnans positiva tröskel, cytoplasmans positiva tröskel och membranets positiva tröskel.
Anmärkning: Tröskeln är olika för varje färgning och bör justeras för varje parti glas och varje antigenfärgning. Med hjälp av verktyget Visa inställningar (Visa > Visa inställningar) kan du välja ett lämpligt tröskelvärde genom att använda intensitetsvärdet i slutet av intensitetstoppen (till höger). - För varje färgämne väljer du kärnan, membranet och cytoplasmaprocenten för fullständighetsvärden.
OBS: Denna parameter är viktig för att undvika falsk positiv detektion när två celler med olika färgning ligger nära varandra (figur 2). - Spara algoritmen (Inställningar Åtgärder > Spara).
- Analysera avkastningen (analysera > anteckningslager).
- Gå till fliken Resultat och välj alla data i objektdata (ctrl + A).
- Exportera data i .csv format (Högerklicka > Exportera > objektdata . Csv).
OBS: Denna tabell innehåller positionen (Xmin, Xmax; Ymin, Ymax) och positiviteten hos varje markör för varje analyserad cell.
4. Bioinformatik med R
Ett R-skript med mer information om följande steg finns på GitHub (benidovskaya/Ring: Pipeline för analys av multiplexa immunofluorescensfärgningar. [github.com])
- Använd den exporterade tabellen och definiera först de olika celltyperna baserat på samlokaliseringsfärgningarna. Definiera till exempel cytotoxiska T-celler med dubbelpositiva CD3 + / CD8 + -celler.
- Rekonstruera sedan en förenklad bild av bilden i ett punktdiagram med hjälp av koordinaterna som exporterats från bildanalysprogrammet och ggplot2 (Figur 3). Med hjälp av dessa data kan flera typer av analyser utföras:
- Densitet analys
OBS: Den enklaste analysen är en densitetsanalys.- Utför en densitetsanalys för alla celltyper med hela bilden för biopsier eller något specifikt område av vävnaden. Beräkna till exempel densiteten hos CD3 + och CD8 + T-celler i mitten av tumören och tumörens marginal (figur 4A-C).
- För att beräkna dessa densiteter, använd bildanalysprogramvara för att producera en specifik dataram per prov med fenotypen och koordinaterna för varje cell. Genom en klustringsfunktion (k-närmaste granne) på R, skapa ett polygonobjekt med hjälp av gränserna för den studerade biopsin och beräkna densiteten hos celltyperna av intresse inuti den.
OBS: Detta gör det möjligt att jämföra densiteterna hos olika celltyper mellan olika tillstånd (såsom olika tidpunkter, behandlingstyper, vävnadstyper och svar på behandlingen) och lokaliseringar (tumörens centrum, tumörens marginal, stromafibros och nekrosområde) beroende på den biologiska hypotesen. På grund av den höga närheten mellan cancerceller, peritumörceller och tumörinfiltrerande celler kan bildanalysprogramvaran upptäcka dubbelpositiva celler som immun- och cancerceller samtidigt. I så fall måste man bioinformatiskt korrigera denna fråga genom att nämna vad dessa dubbelpositiva celler är. I detta fall märktes CD3 + CD8 + cytokeratin + celler som cytotoxiska celler eftersom cytokeratinpositiviteten berodde på tumörcellerna som omger de infiltrerande lymfocyterna.
- Värmekartor
- Använd densiteten för varje celltyp från olika paneler och genom att tillämpa en normalisering (t.ex. skalningscentrering), rita värmekartor (figur 5) som representerar cellens överflöd i provpopulationen.
- Genom att använda hierarkisk oövervakad klustring baserad på celldensitet klusterpatienter med liknande TME-sammansättningar och korrelera dessa kluster med kliniska parametrar som behandlingssvar och överlevnad.
OBS: Värmekartor och klustring kan enkelt utföras med R ComplexHeatmap-paketet9.
- Fördelning av rumsliga celler
- Beräkna bioinformatiskt avstånden mellan cellerna (t.ex. immun- och tumörceller; Figur 6A, B) baserat på cellkoordinaterna från bildanalysen. Använd median- och medelavstånden mellan de intressanta celltyperna för att jämföra cellnärheten över alla prover i en kohort.
- Rumsliga beskrivande funktioner
- Använd korsfunktionen för närmaste granne G-kors, tillgänglig via R-spatstatpaketet10, för att bestämma sannolikheten för att en cell av intresse, X (t.ex. en tumörcell), möter närmaste cell, Y (t.ex. en T-cell), inom en viss radie runt cell X.
- Beräkna arean under den empiriska kurvan för att erhålla ett numeriskt värde som representerar tumörinfiltrationen av CD3+ T-celler runt tumörcellerna11 (Figur 6C). Använd andra rumsliga beskrivande funktioner som F-funktionen eller J-funktionen12.
- Immunoscore-analys
- Beräkna Immunoscore (I), utvecklad av teamet Galon7,8, genom att använda densiteten hos CD3 + och CD8 + T-celler i mitten av tumören och tumörens invasiva marginal.
OBS: Poängen varierar från I0 till I4. En låg densitet av både CD3 + och CD8 + T-celler i mitten och tumörens marginal är associerad med en poäng av I0, medan en hög densitet av CD3 + och CD8 + T-celler i båda regionerna är associerad med en poäng av I4. Nyligen validerades den prognostiska effekten av Immunocore i en studie med prover från 2 681 stadium I-III koloncancerpatienter från 14 centra i 13 länder7. Men för att beräknas kräver Immunoscore ett kirurgiskt resekterat prov som innehåller både tumörens centrum och marginal. För biopsier, som vanligtvis saknar marginal, har en biopsianpassad Immunoscore nyligen utvecklats13. - För att beräkna den biopsianpassade Immunoscore, konvertera värdet på CD3 + och CD8 + T-celldensiteten till en percentil och använd sedan den genomsnittliga percentilen för CD3 + och CD8 + T-celler för poäng i en av tre kategorier (dvs. låg, mellanliggande och hög)13.
- Beräkna Immunoscore (I), utvecklad av teamet Galon7,8, genom att använda densiteten hos CD3 + och CD8 + T-celler i mitten av tumören och tumörens invasiva marginal.
- Analys av hotspots
- Använd hotspot-analys genom att använda quadratcount-funktionen (spatstat)10 för att jämföra densiteterna hos olika celltyper i det mest infiltrerade området av vävnaden. Det är till exempel möjligt att beräkna en "Immunoscore-liknande" poäng med hjälp av värdet på CD3- och CD8 T-celldensiteten för de mest infiltrerade kvadraterna i vävnaden (figur 7). Tillämpa denna metod för analys av vilken celltyp som helst med en icke-homogen fördelning över vävnaden.
- Densitet analys
Representative Results
Efter detta protokoll bör flera parametrar undersökas för att säkerställa att vävnaden är korrekt färgad. För det första bör TSA-färgningen visa ett bra dynamiskt omfång när du använder låga exponeringstider (vanligtvis 2-100 ms) under skanningsprocessen. En låg exponeringstid innebär att förstärkningen har gjorts korrekt under reaktionen med HRP. För antigener färgade med den sekundära antikroppen direkt kopplad till fluorokrom kan exponeringstiden vara mycket längre, vilket kan leda till fotoblekning (en minskning av signalintensiteten på grund av en lång exponeringstid). För det andra är det viktigt att kontrollera att varje färgning visar en hög SNR. En hög bakgrundssignal med låg antigensignal kan vara en indikation på att den primära antikroppen inte är tillräckligt specifik, att de endogena peroxidaserna inte inaktiverades korrekt eller att ett steg i protokollet inte gjordes tillräckligt. För det tredje, beroende på bildskannern och filteruppsättningarna som används för skanningen, är det möjligt att se överlappningar mellan två färger (t.ex. AF555, AF594 och AF647). Att välja rätt filteruppsättningar på skannern och rätt primär antikroppsutspädning är avgörande för att undvika eventuella korsdetektioner. Kvalitetskontroll består av detektering av enstaka färgade celler för varje markör på den skannade filen. Slutligen är det också viktigt att lägga till en positiv och negativ kontroll för varje sats färgning. För immunceller är tonsillen en bra positiv kontroll. Ett representativt resultat av optimal färgning visas i figur 1.
Figur 1: Lokalt avancerad rektalcancer färgad av multiplex immunofluorescens. Förkortningar: PD-1 = programmerat celldödsprotein 1; PD-L1 = Programmerad dödsligand 1; ROR-γ = RAR-relaterad gamma för särläkemedelsreceptorn; CD3 = kluster av differentiering 3; hPanCK = humant pan-cytokeratin. Varje antigenfärgning skannas i gråskala, och färgerna som presenteras i figuren är pseudofärger. Skalstång låg förstoring: 200 μm; Skalstapel hög förstoring: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kärnor och färgningsdetektion av en lokalt avancerad rektalcancer med hjälp av en bildanalysprogramvara. Utan procentandelen fullständighetsparameter korrekt inställd upptäcker programvaran två CD8 + -celler (grön cirkel) eftersom de ligger nära varandra, men endast en cell är färgad. Att använda 70% fullständighet hjälper till att undvika denna falska positiva upptäckt. Grön = hPanCK; Gul = CD3; Orange = CD8. Skalstapel: 100 μm Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Bildanalys och R-punktplottberedning av en leverkolorektal cancermetastas. På multiplexfärgningen (vänster) är humant pan-cytokeratin i gult, CD3 är i grönt, CD8 är i ljusblått och IDO är i orange. På punktdiagrammet (höger) är humana pan-cytokeratin + -celler i gult, CD3 + CD8 − celler är i grönt, CD3 + CD8 + -celler är i blått och IDO + -celler är i orange. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Analys av en kirurgisk del av en HNSCC. (A) En kirurgisk sektion av en HNSCC. Cancerceller är synliga i grönt. Peritumörala celler visualiseras runt tumöröarna (CD3 i gult och CD8 i lila). (B) Tumörens centrum (i gult med en svart kant) beräknas bioinformatiskt av k-närmaste-grannalgoritmen baserat på avståndet mellan tumöröarna från ett enda område. Runt detta område beräknas en invasiv marginal (ljusgul med grå kant) på godtycklig basis på 500 μm. (C) Invasiva T-celler markeras med svarta prickar i mitten av tumören och grå prickar i den invasiva marginalen. Andra T-celler markeras med ljusgröna prickar. Skalstång: 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Värmekarta över densiteten hos olika celltyper av lokalt avancerade rektala cancerbiopsier. Värmekartan ritades med hjälp av oövervakad klustring av densiteterna hos olika celltyper från olika multiplexpaneler med ComplexHeatmap-paketet. Skalning och centrering användes för normalisering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Avståndet mellan CD4 + och CD8 + -cellerna till varje IDO + eller tumörcell. Humana pan-cytokeratin + -celler är i gult, CD3 + CD8 − celler är i grönt, CD3 + CD8 + -celler är i blått och IDO + -celler är i orange. (A) Det närmaste avståndet mellan tumörceller och varje CD8 + T-cell. (B) Diagram över avstånden mellan IDO+-celler och varje CD8+ T-cell (blå) eller CD4+ T-cell (grön). (C) Exempel på ett prov som analyserats med G-korsfunktionen. Y-axeln visar sannolikheten för att en tumörcell möter en CD3 + lymfocyt i en radie som sträcker sig från 0-200 μm runt tumörcellen. Tre kurvor visas; den teoretiska kurvan är i prickad grön (Poissonfördelning), den korrigerade empiriska kurvan med km-korrigering är i svart och den korrigerade empiriska kurvan med kantkorrigering är i prickad röd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Illustration av en fyrkanträkning. Gränsberäkning och quadratcount utfördes med hjälp av spatstats-paketet. De mest infiltrerade rutorna (hotspots) kan användas för nedströmsstatistik. CD4 är i grönt, CD8 är i rött och tumörceller är i gult. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Utspädning av antikroppar och optimering av antigenhämtning. Kromogen detektion av PD-1 med tre olika utspädningar och två olika antigenlösningar av den primära antikroppen (citrat pH 6 och EDTA pH 9). Skalstapel: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Primär antikropp | Utspädning | Hämtning av antigen | Sekundär antikropp | Fluorokrom | Position |
| PD-1 | 1/100 | EDTA (pH 9) | Anti-kanin | AF647 | 1 |
| PD-L1 | 1/1000 | EDTA (pH 9) | Anti-kanin | AF488 | 2 |
| ROR-γ | 1/200 | EDTA (pH 9) | Anti-mus | ATT0-425 | 3 |
| CD3 | 1/100 | Citrat (pH 6) | Anti-kanin | AF555 | 4 |
| hPanCK | 1/50 | Citrat (pH 6) | Anti-mus i kombination med AF750 | 5 | |
Tabell 1: Exempel på en optimerad multiplexpanel. Förkortningar: PD-1 = programmerat celldödsprotein 1; PD-L1 = Programmerad dödsligand 1; ROR-γ = RAR-relaterad gamma för särläkemedelsreceptorn; CD3 = kluster av differentiering 3; hPanCK = humant pan-cytokeratin; AF = AlexaFluor; EDTA = etylendiamintetraättiksyra. CD3 används för att detektera T-lymfocyter; PD-1 används för att detektera utmattade lymfocyter; ROR-γ används för att detektera Th-17; och hPanCK används för att detektera tumörceller. Positionskolumnen anger i vilken ordning den sekventiella multiplexen måste utföras.
Discussion
De viktigaste parametrarna att ta hänsyn till för att optimera multiplexfärgning är utspädningen, specificiteten och antigenhämtningen som används för varje primär antikropp. Innan ett multiplexprotokoll påbörjas måste varje primär antikropps optimala utspädning och optimala epitophämtning (pH 6 eller pH 9) testas med kromogen färgning (DAB). Vi rekommenderar att du testar tre utspädningar för varje antigenhämtningsbuffert: den utspädning som vanligtvis specificeras av varumärket som kommersialiserar antikroppen, samma utspädning uppdelad två gånger och samma utspädning multiplicerad tvåfaldig (figur 8). Att välja rätt utspädning är ett mycket viktigt steg för att verifiera antikroppsspecificiteten och optimera signal-brusförhållandet (SNR) för färgningen. Efter att ha valt rätt utspädning i DAB bör samma utspädning testas för varje primär antikropp med uniplex TSA. När utspädnings- och epitophämtningsbufferten har valts för varje antigenfärgning är det också viktigt att ställa in multiplexsekvensen korrekt. Specifikt är vissa antigener bättre färgade vid första positionen och andra vid den sista positionen. Vi rekommenderar att du testar multiplexmärkningen med alla möjliga ordningspermutationer för att välja vilken antigenfärgning som ska komma först, andra etc. Detta är också ett mycket viktigt steg eftersom vissa ömtåliga antigener kan brytas ned efter flera omgångar av epitophämtning, och vissa antigener färgas bättre efter flera omgångar av epitophämtning. Till exempel är SNR alltid högre i den sista positionen för CD3 och i den första positionen för PD-1-färgning. Dessutom kan färgningen av flera samlokaliserade antigener hindras av en paraplyeffekt (mättnaden av tyramidreaktiva platser). Detta kan dämpas genom att minska tyramidkoncentrationen. När uttrycket av ett antigen är betingat av uttrycket av ett annat (CD8 endast närvarande på CD3-uttryckande T-celler), rekommenderar vi att färga antigenet med det bredaste uttrycket (CD3 i detta fall) efter det andra. Slutligen är det också ett viktigt steg att välja rätt fluorokrom för varje antigenfärgning enligt skannerns specificiteter för att undvika korsdetektion.
De stora fördelarna med denna teknik är förstärkningen och signal-brusförhållandet som erhålls. Denna teknik har emellertid en begränsning, vilket är att färgningen är sekventiell och fluorokromerna är kovalent bundna till vävnaden. Men efter att ha utfört alla tyramidsignalförstärkningsrundor är det också möjligt att lägga till en sista färgning med en sekundär antikropp direkt kopplad till en fluorokrom (ingen TSA). I vissa paneler använde vi den här metoden för att lägga till färgning i 750-kanalen. Detta var nödvändigt eftersom ingen tyramid-AF750 var kommersiellt tillgänglig vid den tiden. Observera att exponeringstiden (under skanningen) av antigenet färgat med AF750 kommer att vara mycket längre än för de andra antigenerna färgade med TSA. I så fall rekommenderar vi färgning av ett högt uttryckt protein som cytokeratin eller ökning av koncentrationen av den primära antikroppen. Genom att göra det är det möjligt att färga högst fem till sex antigener per glas i en sats beroende på fluorescensskannern.
I motsats använder flera kommersiellt tillgängliga tekniker seriell färgning med flera omgångar av färgning, skanning och strippning eller fotoblekning för att förbättra antalet antigener som kan färgas på en enda vävnadssektion. Dessa tekniker är emellertid ofta tidskrävande, dyra, har ingen signalförstärkning, kräver avancerade beräkningssteg för att slå samman seriella skanningar korrekt och kan enligt vår erfarenhet orsaka irreversibel vävnadsskada på grund av de många procedurstegen. Det har dock rapporterats att upp till 30 antigener skulle kunna färgas på en enda vävnad med denna metod14.
Sammanfattningsvis är vår metod en robust, reproducerbar, lättanvänd och kostnadseffektiv immunohistofluorescensteknik som kan användas i alla laboratorier som har en fluorescensbildskanner. Alla kommersialiserade primära antikroppar som är lämpliga för IHC kan användas, och panelerna är inte specifika för några kommersiella kit. Bildanalysen kan göras på flera olika program, inklusive program med öppen källkod som QuPath och R. Vi tror dock att denna metod till och med kan förbättras i framtiden för stora antigenpaneler, vilket möjliggör seriefärgning / skanning av samma glas med olika paneler av antigener och med fördelen av signalförstärkning.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr. Derouane F för hennes hjälp och stöd. Nicolas Huyghe är forskare med stöd av ett bidrag från den belgiska nationella fonden för vetenskaplig forskning (Télévie/FNRS 7460918F).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD3 primary antibody | Abcam | ab16669 | rabbit monocolonal |
| anti-CD8 primary antibody | DAKO | M710301 | mouse monoclonal |
| anti-hPanCK primary antibody | DAKO | M3515 | mouse monoclonal |
| anti-PD-1 primary antibody | Cell Signalling | D4W2J | rabbit monocolonal |
| anti-PD-L1 primary antibody | Cell Signalling | 13684 | rabbit monocolonal |
| anti-RORC primary antibody | Sigma | MABF81 | mouse monoclonal |
| ATTO-425 | ATTOtec | ||
| Axioscan Z1 | Zeiss | Light source: Colibri 7 (385, 430, 475, 555, 590, 630, 735 nm) Filtersets: Excitation 379/34 – beam splitter 409 – emission 440/40; Excitation 438/24 – beam splitter 458 – emission 483/32; Excitation 490/20 – beam splitter 505 – emission 525/20; Excitation 546/10 – beam splitter 556 – emission 572/23; Excitation 592/21 – beam splitter 610 – emission 630/30; Excitation 635/18 – beam splitter 652 – emission 680/42; Excitation 735/40 – beam splitter QBS 405 + 493 + 611 + 762 - emission QBP 425/30 + 524/51 + 634/38 + 785/38; Objective: Plan-Apochromat 20x/0.8; Camera : Orca Flash 4.0 V3 | |
| Borosilicate Cover Glass | VWR | 631-0146 | |
| Envision+ anti-mouse | DAKO | K4001 | |
| Envision+ anti-rabbit | DAKO | K4003 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 750 | ThermoFischer | A-21037 | |
| HALO software | Indicalabs | ||
| Hoescht | Sigma | 14533 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisherscientific/Epredia | 10149870 | |
| Tyramide-AF488 | ThermoFischer | B40953 | |
| Tyramide-AF555 | ThermoFischer | B04955 | |
| Tyramide-AF647 | ThermoFischer | B04958 |
References
- Ge, P., et al. Profiles of immune cell infiltration and immune-related genes in the tumor microenvironment of colorectal cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109228 (2019).
- Fridman, W. H. The immune microenvironment as a guide for cancer therapies. Oncoimmunology. 1 (3), 261-262 (2012).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: Impact on clinical outcome. in Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Calu, V., et al. Key biomarkers within the colorectal cancer related inflammatory microenvironment. Scientific Reports. 11 (1), 7940 (2021).
- Havel, J. J., Chowell, D., Chan, T. A. The evolving landscape of biomarkers for checkpoint inhibitor immunotherapy. Nature Reviews. Cancer. 19 (3), 133-150 (2019).
- Pages, F., et al. International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study. Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).
- Mlecnik, B., et al. Integrative analyses of colorectal cancer show immunoscore is a stronger predictor of patient survival than microsatellite instability. Immunity. 44 (3), 698-711 (2016).
- Gu, Z., Eils, R., Schlesner, M. Complex heatmaps reveal patterns and correlations in multidimensional genomic data. Bioinformatics. 32 (18), 2847-2849 (2016).
- Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. Spatial Point Patterns: Methodology and Applications with R. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2022).
- Barua, S., et al. Spatial interaction of tumor cells and regulatory T cells correlates with survival in non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 117, 73-79 (2018).
- Parra, E. R. Methods to determine and analyze the cellular spatial distribution extracted from multiplex immunofluorescence data to understand the tumor microenvironment. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 668340 (2021).
- El Sissy, C., et al. A diagnostic biopsy-adapted immunoscore predicts response to neoadjuvant treatment and selects patients with rectal cancer eligible for a watch-and-wait strategy. Clinical Cancer Research. 26 (19), 5198-5207 (2020).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex staining by sequential immunostaining and antibody removal on routine tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
