Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Levedyktighetsanalyse av Trichoderma stromaticum Conidia i humant perifert blod mononukleære makrofager

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65231
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Laboratory of Immunobiology - Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Università Degli Studi di Genova
* These authors contributed equally

Summary

Teknikken som involverer fagocytose av soppkonidier av makrofager, er mye brukt til studier som evaluerer moduleringen av immunresponsene mot sopp. Formålet med dette manuskriptet er å presentere en metode for å evaluere fagocytose- og clearanceevnen til mononukleære makrofager fra humant perifert blod stimulert med Trichoderma stromaticum conidia.

Abstract

Makrofager representerer en avgjørende forsvarslinje og er ansvarlige for å forhindre vekst og kolonisering av patogener i forskjellige vev. Conidial fagocytose er en nøkkelprosess som muliggjør undersøkelse av cytoplasmatiske og molekylære hendelser involvert i makrofag-patogen-interaksjoner, samt for bestemmelse av dødstidspunktet for internaliserte konidier. Teknikken som involverer fagocytose av soppkonidier av makrofager, er mye brukt til studier som evaluerer moduleringen av immunresponsene mot sopp. Unnvikelsen av fagocytose og rømning av fagosomer er mekanismer for soppvirulens. Her rapporterer vi metodene som kan brukes til analyse av fagocytose, clearance og levedyktighet av T. stromaticum conidia, en sopp som brukes som biokontroll- og biogjødselmiddel og er i stand til å indusere menneskelige infeksjoner. Protokollen består av 1) Trichoderma-kultur , 2) vasking for å oppnå konidier, 3) isolering av mononukleære celler i perifert blod (PBMC) ved bruk av polysukroseløsningsmetoden og differensiering av PBMCene i makrofager, 4) en in vitro-fagocytosemetode ved bruk av runde glassdeksel og farging, og 5) en clearance-analyse for å vurdere konidiens levedyktighet etter konidiafagocytose. Oppsummert kan disse teknikkene brukes til å måle soppclearanceeffektiviteten til makrofager.

Introduction

Trichoderma-slekten (Orden: Hypocreales, Familie: Hypocreaceae) består av allestedsnærværende, saprofytiske sopp som er parasitter av andre sopparter og er i stand til å produsere en rekke kommersielt nyttige enzymer1. Disse soppartene brukes til produksjon av heterologe proteiner2, produksjon av cellulose3, etanol, øl, vin og papir4, i tekstilindustrien5, næringsmiddelindustrien6 og i landbruket som biologiske kontrollmidler 7,8. I tillegg til den industrielle interessen for disse soppartene, har det økende antallet infeksjoner hos mennesker gitt noen Trichoderma-arter status som opportunistiske patogener9.

Trichoderma spp. vokser raskt i kulturen, med i utgangspunktet hvite og bomullsaktige kolonier som blir grønngule til mørkegrønne10. De er tilpasset til å leve i et bredt spekter av pH- og temperaturforhold, og de opportunistiske artene er i stand til å overleve ved fysiologisk pH og temperaturer og dermed kolonisere forskjellige menneskelige vev 11,12,13. Det er viktig at økningen i infeksjonsraten av Trichoderma spp. kan være forbundet med virulensfaktorer, og disse er ikke godt studert. I tillegg er studier som fokuserer på å forstå immunresponsen mot opportunistiske Trichoderma-arter fortsatt sjeldne.

Under en infeksjon, sammen med nøytrofiler, representerer makrofager forsvarslinjen som er ansvarlig for fagocytose, og forhindrer dermed vekst og kolonisering av patogener i forskjellige vev. Ved hjelp av mønstergjenkjenningsreseptorer, som Toll-lignende reseptorer og C-type lektinreseptorer, makrofager fagocytose sopp og behandler dem i fagolysosomer, og fremmer dermed et respiratorisk utbrudd, frigjøring av proinflammatoriske cytokiner og ødeleggelsen av fagocytoserte mikroorganismer14. Mekanismen for fagocytose kan imidlertid påvirkes og unngås av forskjellige mikrobielle strategier, for eksempel størrelsen og formen på soppcellene; Tilstedeværelsen av kapsler som hindrer fagocytose; redusere antall fagocytose-induserende reseptorer; ombyggingen av strukturen av aktinfibre i cytoplasma; hindrer dannelsen av pseudopodi; og fagosom eller fagolysosom unnslipper etter fagocytoseprosessen14.

Mange patogener, inkludert Cryptococcus neoformans, bruker makrofager som en nisje for å overleve i verten, spre og indusere infeksjon15. Fagocytose- og clearanceanalysen brukes til å evaluere immunresponsen mot patogener og for å identifisere de mikrobielle strategiene som brukes for å unngå det medfødte immunsystemet 15,16,17. Denne typen teknikk kan også brukes til å undersøke differensialkinetikken til fagocytose, forsinket fagosomforsuring og oksidativt utbrudd som resulterer i redusert soppdrap18.

Ulike metoder kan brukes til å evaluere fagocytose, soppoverlevelse og unnvikelse av fagosommodningsprosessen. Disse inkluderer fluorescensmikroskopi, som brukes til å observere fagocytose, den cellulære plasseringen og molekylene produsert under fagocytose19; flowcytometri, som gir kvantitative data om fagocytose og brukes til å evaluere de forskjellige markørene som er involvert i prosessen20,21; intravital mikroskopi, som brukes til å vurdere mikrobiell fangst og fagosommodning22; antistoffmediert fagocytose, som brukes til å vurdere spesifisiteten av fagocytoseprosessen for et patogen23; og andre 24,25,26,27.

Protokollen som presenteres her benytter en vanlig, billig og direkte metode ved hjelp av et optisk mikroskop og platevekstanalyse for å vurdere fagocytose og drap av soppkonidier. Denne protokollen vil gi leserne trinnvise instruksjoner for å utføre fagocytose og clearance-analysen ved bruk av humane perifere blodmononukleære makrofager utsatt for T. stromaticum. PBMC ble brukt fordi Trichoderma conidia brukes som biokontroll mot fytopatogener og biogjødsel for planteavlinger over hele verden og har forårsaket flere menneskelige infeksjoner, kalt Trichodermosis. Dessuten er det bare to tidligere arbeider som fokuserer på samspillet mellom Trichoderma conidia og det menneskelige immunsystemet, der vi undersøkte nøytrofiler28 og autofagi i makrofager29. Denne artikkelen viser først hvordan fagocytose av konidiene til T. stromaticum av PBMC-avledede makrofager kan studeres, og deretter hvordan levedyktigheten til de oppslukte konidiene kan vurderes ved hjelp av enkle mikroskopibaserte teknikker. Denne protokollen kan ytterligere lette undersøkelser av makrofagassosiert immunrespons eller immunsystemmodulasjonsrelaterte mekanismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etiske overveielser og mennesker
Alle eksperimenter med mennesker beskrevet i denne studien ble utført i henhold til Helsinkideklarasjonen og brasilianske føderale lover og godkjent av State University of Santa Cruz etiske komité (prosjektidentifikasjonskode: 550.382 / 2014).

Humant perifert blod ble samlet fra friske frivillige fra Ilhéus city, Bahia, Brasil, ikke utsatt for yrkesaktiviteter relatert til den studerte soppen. Personer med rapporterte helsemedisinske tilstander eller bruk av medisiner ble ekskludert. Alle forsøkspersonene samtykket frivillig til å delta og signerte et informert samtykkeskjema før de ble inkludert i denne studien.

1. Fremstilling av reagenser og løsninger

MERK: Forbered følgende reagenser og løsninger før du fortsetter. Se materialfortegnelsen (TOM) for informasjon om reagens og materialleverandør.

  1. Forbered en balansert steril fosfatbufret saltoppløsning 1x (PBS).
    MERK: I denne protokollen ble endotoksinfri PBS ikke brukt.
  2. Forbered potet druesukker agar (PDA) medium, og hell 20 ml i hver petriskål for T. stromaticum kultur. Forbered seks plater med PDA for hver donor, og bruk en plate for hver tilstand: 3 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer og 120 timer. I tillegg bør du bruke tre plater for hver kontroll: tre for Trichoderma-kontrollen og tre for R10-middelkontrollen. Bruk petriskåler på 60 mm x 15 mm eller 100 mm x 15 mm for optimal gjenvinning av konidia.
  3. Steriliser 100% glyserol.
  4. Forbered et R10-medium for cellekulturen: RPMI-medium supplert med 10% føtal bovint serum og 1% antibiotika (penicillin / streptomycin).
  5. Steriliser destillert vann for cellelysen.
  6. Forbered vann ved pH 7,0 for fargeprosessen.
    MERK: Juster om nødvendig pH ved hjelp av en pH-måler og løsninger på 0,1 M/L NaOH og 0,1 M/L HCl.
  7. Steriliser rund glassdeksel (13 mm) og pinsett.

2. Trichoderma stromaticum kultur og prosessering

  1. Fremstilling av en moderbestand (M1) av T. stromaticum:
    MERK: En moderbestand (M1) er nødvendig for å sikre at alle eksperimentene er gjort fra kulturen til den samme friske generasjonen (F1).
    1. Dyrk en T. stromaticum inoculum i petriskåler med PDA ved 28 °C i mørket i 7-10 dager til konidiene blir observert og kulturen blir grønn.
    2. Vask kulturen av T. stromaticum. Tilsett 3-5 ml PBS til kulturoverflaten ved hjelp av en pipette. Samle PBS fra platen, og dispenser den igjen over kulturen for gradvis å fjerne konidiene ved hjelp av pipetten. Gjenta denne prosessen så mye som nødvendig til suspensjonen blir mørkegrønn.
      MERK: Alternativt anbefales forsiktig vask av kulturen ved å tilsette 3-5 ml PBS til platen etterfulgt av å utføre en sirkulær bevegelse til suspensjonen blir grønn for å gjenopprette konidier. Ved gjentatt pipettering kan flere konidier samles inn.
    3. Overfør den gjenvunnede suspensjonen fra platen til et 15 ml sterilt rør med pipette. Gjenta trinn 2.1.2-2.1.3 så mange ganger som nødvendig for å få mer conidier.
    4. Sentrifuger suspensjonen ved 1,160 x g i 5 minutter ved 12 °C, og resuspender pelleten i 5 ml PBS. Gjenta dette trinnet (2.1.4) tre ganger for å oppnå en hyfefri suspensjon.
      NOTAT: For å resuspendere pelleten riktig, etter sentrifugering, anbefales kort virvel.
    5. Resuspender den endelige pelleten i 2-3 ml PBS, og tell konidiene i et Neubauer-kammer ved å bruke en fortynning på 1:100 eller 1:1,000.
      MERK: Under optimale forhold kan en endelig konsentrasjon på 2 x 108 conidia / ml gjenvinnes fra kulturen. Det er valgfritt å vurdere conidia-levedyktigheten ved hjelp av trypanblå ekskluderingsmetoden.
    6. Aliquot suspensjonen i 1,5 ml sterile rør ved å tilsette 0,5 ml av conidia-suspensjonen (fra trinn 2.1.5) til hver tube. Tilsett deretter 0,5 ml steril 100% glyserol for å oppnå M1-aksjer. Vortex kort, identifiser rørene, og oppbevar ved -20 ° C eller -80 ° C.
  2. Kultur av T. stromaticum og oppnå konidier for eksperimentet
    1. Plate 10 μL av M1-suspensjonen (tilberedt i trinn 2.1) i PDA ved 28 °C i mørket i 7-10 dager til konidiene observeres og kulturen blir grønn for å oppnå den friske F1-generasjonen.
      MERK: For å sikre en frisk T. stromaticumkultur for forsøket, vurder tiden som kreves for soppvekst og tiden som kreves for makrofagdifferensiering.
    2. Samle conidier, gjenta trinn 2.1.2-2.1.4.
    3. Oppløs den endelige pelleten i 2-3 ml PBS. Vurder konidienes levedyktighet ved hjelp av trypanblå ekskluderingsmetode, eller tell konidiene som nevnt i trinn 2.1.5.

3. Perifert blodmononukleær celle (PBMC) isolasjon

MERK: PBMCene oppnås ved tetthetsbarrieremetoden ved bruk av en polysukroseoppløsning med tetthet 1,077 g / ml30.

  1. Aliquot 15 ml av polysukroseoppløsningen til en 50 ml rør for hver donorprøve som skal samles inn.
  2. Samle 20 ml blod fra hver giver ved hjelp av tre til fire EDTA-rør. Rekrutter minimum fire givere per eksperiment. Ikke samle blodet til giverne; Bruk i stedet hver prøve separat som en biologisk replikasjon. For hver giver, overfør blodet til ett 50 ml rør, og legg til PBS for å oppnå et endelig volum på 35 ml.
  3. Overfør blodsuspensjonen (trinn 3.2) langsomt langs veggen av slangen som inneholder polysukroseoppløsningen (trinn 3.1) for å danne en bifasisk suspensjon.
    MERK: For å forhindre blanding av blodet med polysukroseoppløsningen, tilsett blodet sakte. Bruk av minimum 7 ml blod fra hver giver for PBMC-isolasjonen anbefales.
  4. Sentrifuger umiddelbart røret som inneholder den bifasiske suspensjonen ved 1 600 x g i 30 minutter ved 24 °C. Programmer sentrifugeringen av PBMC-ene: bruk akselerasjon 1 og retardasjon 0 for å unngå et brått stopp av sentrifugeringen.
  5. Vær oppmerksom på dannelsen av en hvit ring som inneholder PBMCene etter sentrifugering. De røde blodcellene og granulocytter ligger i det nedre laget, det neste laget inneholder polysukroseoppløsningen, og PBMCene ligger i den hvite ringen mellom polysukroseoppløsningen og plasmaet (øvre lag). Samle den hvite ringen ved å aspirere forsiktig med en pipette eller en steril Pasteur-pipette for ikke å fange røde blodlegemer, plasma eller polysukroseoppløsning, og overfør til ett 15 ml rør.
  6. Legg PBS til 15 ml røret som inneholder PBMC for å oppnå et endelig volum på 10 ml. Homogeniser suspensjonen, og sentrifuge røret ved 1,600 x g i 30 minutter ved 24 ° C.
  7. Vask cellene tre ganger ved 1 600 x g i 5 minutter ved 24 °C med 10 ml PBS. Deretter resuspenderes den endelige pelleten i 2 ml R10 medium.
  8. Vurder cellens levedyktighet ved hjelp av trypanblå ekskluderingsmetode, og tell cellene i et Neubauer-kammer.

4. Fagocytose kinetikk

MERK: De humane perifere blodmononukleære makrofagene behandles med T. stromaticum conidia ved en mangfoldighet av infeksjon (MOI) på 1:10 eller bare R10 medium som en kontroll. Infeksjonsmangfoldet (MOI) representerer forholdet mellom smittestoffene som er lagt til smittemålene og presenteres som absolutte tall: MOI = agens:mål31. Her bruker vi 1 T. stromaticum conidia (agent) for 10 makrofager (mål). Deretter inkuberes cellene ved 37 °C og 5 %CO2 i forskjellige tidsperioder (3 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer og 120 timer). Deretter brukes et rundt glassdeksel til å visualisere de vedhengende makrofagene som er involvert i fagocytoseprosessen under et mikroskop. En eksperimentell designfigur er gitt (figur 1).

MERK: Bruk av 24-brønnsplater foreslås.

  1. Behandling av humane makrofager med T. stromaticum conidia
    1. Legg et sterilt rundt glassdeksel (13 mm) til hver brønn ved hjelp av steril pinsett.
    2. Juster volumet av cellesuspensjonen oppnådd i trinn 3,7-3,8 til plate 8 x 105 celler per brønn til et endelig volum på 1 ml med R10 medium. Bruk et omvendt mikroskop for å vurdere cellemorfologien.
      MERK: Cellene må suspenderes i mediet og ha en avrundet morfologi.
    3. Inkuber cellene ved 37 °C under en 5% CO2 atmosfære i 7 dager, og erstatt mediet med ferskt R10 medium hver 2. dag for differensiering av monocyttene i makrofager32. Observer cellemorfologien ved hjelp av et omvendt mikroskop. Makrofagene vil presentere spinkel morfologi, med flate og utvidede former; Et økt cytoplasmatisk forhold og tilstedeværelsen av pseudopodi kan også observeres. Se etter adherente mononukleære avledede makrofager.
      MERK: En svært liten andel av udifferensierte monocytter kan forbli suspendert i mediet.
    4. Fjern mediet av hver brønn ved hjelp av en pipette, og vask cellene med 1 ml PBS for å fjerne rusk og ikke-adherente celler.
    5. Bruk suspensjonen klargjort i trinn 2.2 til å forberede en ny suspensjon av T. stromaticum conidia ved en endelig konsentrasjon på 8 x 104 conidia / ml i R10 medium.
    6. Legg til 1 ml av conidia-suspensjonen tilberedt i trinn 4.1.5 til hver behandlingsbrønn (3 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer og 120 timer) for å oppnå en MOI på 1:10. Til kontrollene, legg bare 1 ml R10 medium til brønnen.
    7. Utfordre makrofagene i 3 timer med T. stromaticum conidia ved 37 °C under en 5 % CO2 atmosfære. Etter 3 timer, fjern mediet og vask cellene for å fjerne ikke-fagocytoserte konidier.
    8. Tilsett 1 ml R10 medium til hver brønn, og inkuber platen til forskjellige tider (3 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer og 120 timer) ved 37 ° C under en 5% CO2 atmosfære.
  2. Fargelegging og analyse
    1. Fjern mediet fra hver brønn etter at den tilsvarende inkubasjonen (trinn 4.1.8) er fullført, og tilsett 1 ml PBS til den brønnen.
    2. Fjern de runde glassdekslene fra brønnene ved hjelp av steril pinsett og en nål for farging med et fargesett.
      MERK: Alternativt kan farging gjøres med May Grünwald-Giemsa flekk33.
    3. Til hver av de runde glassdekslene, tilsett flekkfiksering (5 s), fargestoff 1 (5 s), fargestoff 2 (2 s) og bufret vann pH 7,0 (5 s), som er komponentene i fargesettet. Vent til de er tørre, og fest dekslene på et glassglass ved hjelp av monteringsmiddel.
    4. Kvantifiser resultatet: Tell totalt 100 makrofager (Mø) for hver tidstilstand. Ved hjelp av et optisk mikroskop, telle antall makrofager med fagocytoserte konidier ved hjelp av en 100x objektiv og nedsenkningsolje (ligning [1]).
      Equation 1 (1)
    5. Oppnå antall konidiafagocytoserte per makrofag: Korreler konidiene som er tilstede i 100 makrofager delt på antall makrofager med minst ett fagocytosert konidium (ligning [2])34.
      Equation 2 (2)
      MERK: For å evaluere og telle conidier, kan ImageJ-programvaren brukes35.
    6. Fotografer fagocytosen fra hver prøve og tidstilstand ved hjelp av 40x og 100x mål for å presentere resultatene.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av fagocytose og conidial levedyktighetsanalyse ved bruk av humane perifere blodmononukleære makrofager. (1-10) Fagocytoseanalyse: T. stromaticum må dyrkes i PDA, og konidiene gjenvinnes ved å vaske platen med PBS. PBMCene skal isoleres ved tetthetsbarrieremetoden ved bruk av den beskrevne protokollen, dyrket i 24-brønnplater med sterile runde glassdeksel i 7 dager for differensiering i makrofager, og deretter behandles med en MOI på 1:10 med forskjellige tidsintervaller. De runde glassdekslene fjernes og farges med fargesettet, og resultatene analyseres ved hjelp av lysmikroskopi. (1-8,11-13) Conidia levedyktighetsanalyse: Etter isolering dyrkes PBMCene i 24-brønnsplater uten runde glassdeksler i 7 dager for differensiering i makrofager og behandles deretter med en MOI på 1:10 for forskjellige tidsintervaller. Cellene må lyseres ved inkubering med destillert vann; suspensjonen sentrifugeres deretter, og deretter belegges den resuspenderte pelleten i PDA for å analysere vekstkinetikken til Trichoderma. Denne figuren ble designet ved hjelp av en database med bilder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

5. Conidial levedyktighetsanalyse etter fagocytose

MERK: En eksperimentell designfigur er gitt (figur 1).

MERK: Bruk 24-brønnsplater.

  1. Utfordre de menneskeavledede makrofagene med T. stromaticum conidier.
    1. Gjenta trinn 4.1.2-4.1.8 for å skille monocyttene, og behandle makrofagene med T. stromaticum conidier.
      MERK: Ikke bruk runde glassdeksler i brønnene. Bruk de samme tidsintervallene som brukes til å analysere fagocytoseginetikken, slik at fagocytosen kan korreleres med conidial levedyktighet.
    2. Evaluere virkningen av R10-mediet på T. stromaticum-veksten ved å bruke brønner med suspensjonen utarbeidet i trinn 4.1.5 (R10 medium + conidier) som en kontroll.
  2. Conidial levedyktighetsanalyse
    1. Fjern mediet etter hver inkubasjonsperiode (3 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer og 120 timer), og vask cellene to ganger med PBS for å fjerne konidiene som ikke er fagocytosert.
      MERK: Kontrollen som inneholder R10 medium + conidia skal ikke vaskes.
    2. Tilsett 0,5 ml sterilt destillert vann til hver brønn, og inkuber platen ved 37 °C og 5 % CO2 i 30 minutter. Etter denne tiden, observer cellemorfologien under et omvendt mikroskop for å sikre at cellene har blitt lysert.
    3. Samle suspensjonen, og overfør den til 1,5 ml rør. Sentrifuger suspensjonen ved hjelp av en minisentrifuge ved 6000 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
    4. Kast supernatanten forsiktig, resuspender pelleten i 10 μl sterilt destillert vann og inokuler 10 μL av suspensjonen i den PDA-holdige platen ved 28 °C i mørket.
    5. Forbered en positiv kontroll for T. stromaticum vekst: Bruk suspensjonen av T. stromaticum conidia (trinn 2.2) til å forberede en ny suspensjon med en endelig konsentrasjon på 8 x 106 conidia / ml. Plate 10 μL av denne suspensjonen i PDA ved 28 °C i mørket.
      MERK: 10 μL av denne suspensjonen vil inneholde samme antall konidier (8 x 104) som ble brukt til å infisere blodmononukleære makrofager. Forskjellen mellom denne positive kontrollen og den som er nevnt i trinn 5.1.2 er at kontrollen nevnt ovenfor i trinn 5.1.2 brukes til å evaluere den mulige effekten av R10-mediet på Trichoderma-vekst i løpet av fagocytosetiden. Denne positive kontrollen i trinn 5.2.5 ved bruk av suspensjon av T. stromaticum conidia samlet i PBS representerer en kontroll for Trichoderma vekst uten påvirkning av R10 medium for å reflektere hvordan soppen vokser naturlig. Ved hjelp av denne kontrollen er det mulig å evaluere om R10-mediet påvirker Trichoderma-veksten .
    6. Observer vekstkinetikken til T. stromaticum i PDA hver dag, og fotografer kulturen.
    7. Analyse: To punkter kan brukes til å evaluere resultatene: 1) tiden (i dager) som kreves for at kulturen skal okkupere hele kulturplaten, og 2) tiden (i dager) til utseendet til den karakteristiske grønne pigmenteringen av T. stromaticum conidia i kultur.

6. Statistisk analyse

  1. Bruk en Kruskal-Wallis test for å bestemme statistisk signifikante forskjeller mellom de 8 gruppene / behandlingene. Vurder p < 0,05 som statistisk signifikant. Alle dataene presenteres som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). I figurene indikerer # statistisk signifikans ved p < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Teknikken som involverer fagocytose av soppkonidier av makrofager, er mye brukt til studier som evaluerer moduleringen av immunresponsene mot sopp. Vi brukte fagocytose av T. stromaticum conidia for å vurdere levedyktigheten til konidiene etter fagocytose, siden unnvikelsen av fagocytose og rømningen av fagosomer er mekanismer for soppvirulens. Forskere bør utføre disse teknikkene som en av de første analysene når de undersøker en art av klinisk interesse.

Figure 2
Figur 2 Fagocytose av T. stromaticum conidia av mononukleære makrofager fra humant perifert blod. Representative resultater av fagocytosekinetikk (A) under 40x og (B) 100x mål som viser PBMC-deriverte makrofager som inneholder T. stromaticum conidier. (C) T. stromaticum conidia fri og festet til den ytre membranen; (D) T. stromaticum conidia fullstendig internalisert av makrofager; (E) T. stromaticum conidia i et øvre plan; (F) multippel fagocytose; og (G) spiring av konidier innenfor (H) og utenfor makrofagene. Piler: gul, fri conidier; hvit, conidia festet til ytre membranen; svart, fullstendig internalisert conidier; rød, conidia spiring inne i makrofagene. Stiplede piler: svart, flere fagocytose; rød, konidia som spirer i R10-mediet utenfor makrofagene; hvit, conidia i øvre plan. Skalalinjen indikerer 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2 viser representative resultater av fagocytosekinetikken. I begynnelsen av fagocytoseprosessen kan frie T. stromaticum conidia observeres, så vel som konidier festet til den ytre membranen av makrofager eller fullstendig internalisert av dem (figur 2A-C). Færre konidier kan observeres fritt eller festet til makrofagens ytre membran med økende fagocytosetid.

Spesielt i dette arbeidet kunne konidier bli funnet fri og festet til den ytre membranen (figur 2C) i begynnelsen av fagocytoseprosessen, fullstendig internalisert av makrofagene (figur 2D), eller i et øvre plan sammenlignet med makrofagene (figur 2E), men ikke fagocytosert, og mer enn ett conidium kunne bli funnet i samme makrofag (figur 2F). Etter lange perioder (96 timer) kunne fagocytoserte konidier spire inne i makrofagene (figur 2G), og frie konidier kunne spire i R10-mediet og danne hyfer ved 37 °C (figur 2H).

Etter fagocytose var det mulig å observere at T. stromaticum conidia forble levedyktig selv etter 120 timers interaksjon med humane PBMC-avledede makrofager. De representative resultatene viser kulturen til gjenvunnet konidier (figur 3A) og representerer tiden (i dager) som kreves for at kulturen skal okkupere hele kulturplaten (figur 3B) og danne fargede grønne konidier (figur 3C). Bare diskrete T. stromaticum conidia var i stand til å unnslippe fagosomet og bli funnet fri i cytoplasmaet til mononukleære mononukleære makrofager fra humant perifert blod29. Trichodermas evne til å redusere produksjonen av reaktive oksygen- og nitrogenarter kan også bidra til overlevelse av konidier inne i fagosomet og forklare levedyktigheten etter fagocytose 28,29,36. Så langt har vi vist at fagocytoserte konidier forblir levedyktige og er i stand til å vokse i PDA-mediet selv etter 120 timer. Andre mikroorganismer har også blitt rapportert å overleve etter oppslukt av makrofager, som Aspergillus27,37 og Cryptococcus38.

Figure 3
Figur 3: Clearance evne til humant perifert blod mononukleære makrofager infisert med T. stromaticum conidier. Etter en utfordring med T. stromaticum conidia (3 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer eller 120 timer) ble PBMC-deriverte makrofager lysert, og suspensjonen ble belagt i PDA for å evaluere levedyktigheten til fagocytoserte konidier. (A) Representative resultater av T. stromaticum vekst etter fagocytose av PBMC-avledede makrofager er vist. Overvåking av (B) T. stromaticum-vekst og (C)-konidiasjon på forskjellige dager for den positive kontrollen med T. stromaticum i PBS (se trinn 5.2.5), kontrollen for R10-mediet (se trinn 5.1.2) og konidiene fagocytosert av makrofager for forskjellige tidsperioder (3 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer, 120 timer). Representative resultater fra fire friske donorer. Gjennomsnittlig ± standardavvik (SD). Kruskal-Wallis test. Symbolet # indikerer signifikans ved p < 0,05, n = 4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For flere sopppatogener, inkludert Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans og andre, er conidial eller gjærfagocytose en nøkkelprosess som muliggjør undersøkelse av cytoplasmatiske og molekylære hendelser i makrofag-patogen-interaksjoner, samt for bestemmelse av dødstidspunktet for den internaliserte konidien 14,39,40. Fagocytose er nøkkelprosessen i Trichoderma-vert-interaksjonen. Trichoderma-slekten modulerer flere fagocytoseveier, inkludert Dectin-1 og Dectin-2, Toll-lignende reseptor 2 og Toll-lignende reseptor 4, MHC og NF-κB 25,28,41,42,43. Trichoderma forårsaker trichoderlose hos kompromitterte og ikke-immunkompromitterte individer9. Det er viktig at flere arter av denne slekten brukes i landbruket og er den potensielle kilden til Trichodermosis. Det er et presserende behov for å forstå virulensfaktorene til T. stromaticum og mekanismen for immunresponsen i menneskekroppen mot disse soppene, da yrkesfarer forårsaket av Trichoderma-artene, inkludert T.stromaticum, stiger alarmerende. Metoden som presenteres her gir detaljer for å utføre fagocytose og drepe analysen for å studere Trichoderma-makrofag-interaksjonen i humane perifere blodavledede makrofager; Imidlertid kan denne metoden også brukes til å studere makrofager fra forskjellige vev, inkludert alveolar, peritoneal eller avstamningsmakrofager.

Det første trinnet i denne protokollen starter med en moderstamme (M1) suspensjon for å oppnå friske kulturer av soppen. Trichoderma kulturer vokser raskt, da de vanligvis tar over hele platen og begynner å vise grønnfarget konidia innen 5 dager. Temperatur og lys er avgjørende faktorer for Trichoderma-vekst , og endringer i disse faktorene kan påvirke kinetikken til Trichoderma og kompromittere eksperimentet44.

Etter vasking av T. stromaticum-kulturen, bør et endelig volum mellom 5-8 ml gjenvinnes. Suspensjonens fargeintensitet er proporsjonal med konidiakonsentrasjonen. Den oppnådde conidia-suspensjonen kan brukes til in vitro og in vivo analyser, slik som for vurdering av fagocytose26, nøytrofile ekstracellulære feller28, intranasal eksponering36,41, intraperitoneal eksponering26, intrakutan infeksjon45 og intravenøs infeksjon46. Tidligere forskning utført med humane makrofager har evaluert autofagi indusert av Trichoderma29 og slektens evne til å hemme dannelsen av ekstracellulære feller i nøytrofiler28, som er en mekanisme som brukes til å eliminere sopppatogener og andre mikroorganismer.

Det er viktig å merke seg at kulturmediet som brukes til å opprettholde cellene, kan påvirke conidial spiring (figur 3G,H). Hvis spiring ikke er ønsket for et bestemt eksperiment, anbefaler vi å utføre en innledende screeninganalyse med cellekulturmediet for å etablere vekstkinetikken til Trichoderma i det aktuelle mediet. Denne analysen bør utføres før in vitro-eksperimenter med ønsket cellelinje startes, og eksperimentet bør stoppes etter 72 timer hvis mediet viser seg ikke å være kompatibelt. Spiring av Trichoderma conidia (figur 3G,H) kan observeres fra 96 timer i og utenfor makrofagene.

Siden Trichoderma-arter presenterer forskjeller i morfologi og optimal temperatur og pH for veksten, kan resultatene som presenteres her ikke være reproduserbare for alle arter i slekten, og denne protokollen kan trenge tilpasninger når de utføres med andre arter. Som et eksempel spirer Trichoderma asperelloides conidia raskere i kultur enn T. stromaticum.

Tidligere dokumenterte protokoller for å evaluere fagocytose og drap av patogenet ved hjelp av flowcytometri og fluorescensmikroskopi krever dyre reagenser, men de gir spesifikk informasjon om fagocytoseprosessen19. Protokollen som presenteres i denne artikkelen krever bare et optisk mikroskop og platevekst for å evaluere fagocytose og gir omfattende bilder av fagocytoseprosessen. Ulike protokoller kan brukes til å oppnå differensierte makrofager og indusere makrofaglyse. Disse protokollene inkluderer bruk av forskjellige tider for makrofagdifferensiering i stedet for de 7 dagene som brukes her26 eller bruk av 2,5% deoksykolat47 for å lyse makrofagene i stedet for destillert vann ved 37 ° C og 5% CO2 i 30 minutter, som brukt her i denne protokollen. Disse metodene har blitt effektivt brukt til forskjellige sopparter som A. fumigatus27, A. nidulans18 og Cryptococcus neoformans15.

Noen begrensninger i denne protokollen er relatert til bruk av PBS som ikke er endotoksinfri, bruk av runde glassdeksler og bruk av humant blod. Vi anbefaler å teste PBS (ikke endotoksinfri) på celler for å sikre at den ikke kan aktivere monocyttene og forstyrre eksperimentet. Bruken av runde glassdeksler er svært nyttig for farging og telling av cellene, men cellene kan ikke spre seg jevnt under lysbildet, da noen celler migrerer til kanten av platebrønnen, og denne forskjellen kan ha innvirkning på det estimerte totale cellenummeret i de runde glassdekslene. Siden vi ikke bruker immunfluorescens eller lignende teknikker i denne protokollen, kan tilstedeværelsen av ikke-fagocytoserte konidier i et øvre plan sammenlignet med makrofagene føre til feiltolkning av fagocytoseresultatene. Når vi bruker blod fra menneskelige givere, varierer det endelige PBMC-tallet mellom givere, og lavt donorcelletall er kanskje ikke tilstrekkelig for alle eksperimenter.

Oppsummert kan disse teknikkene brukes til å måle funksjonen til makrofager og soppclearance, spesielt for filamentøse sopp som Trichoderma og andre mikrober, som gjær og bakterier. Videre gir denne protokollen fremtidige retninger for å studere reell variabilitet i immunresponsen mot konidardannende sopp i humane populasjoner, som ikke kan observeres ved hjelp av isogene dyremodeller eller cellelinjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av følgende brasilianske finansieringsinstitusjoner: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) med tilskudd RED0011/2012 og RED008/2014. U.R.S., J.O.C. og M.E.S.M. anerkjenner stipendet gitt av henholdsvis Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) og FAPESB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tubes Corning CLS431470 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate Kasvi K12-024 Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator Sanyo 303082 A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL Capp 5101500 Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm Olen K5-0015 Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets Esco Lifesciences group 2010274 Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium Merck 145 Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube FirstLab FL5-1109L EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan Merck 1.07961  Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum Gibco A2720801 Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon  database of images
Glycerol Merck 24900988 The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077 polysucrose solution
Image J  Image analysis software
Microscopy slides Precision 7105 Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge Prism C1801 The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber Kasvi K5-0011 The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast  Laborclin 620529 Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution - 10,000U LGC- Biotechnology  BR3011001 antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth Cralplast 18248 Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS) thermo fisher Scientific 10010001 PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile Accumax AP-3-B-S STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge Thermo Scientific TS-HM16R The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium Merck MFCD00217820 HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes Eppendorf Z683809 Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor Corning 4894 Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope LABOMED VU-7125500 It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
  2. Nevalainen, H., Peterson, R. Chapter 7 - Heterologous expression of proteins in Trichoderma. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  3. Do Vale, L. H. F., Filho, E. X. F., Miller, R. N. G., Ricart, C. A. O., de Sousa, M. V. Chapter 16 - Cellulase systems in Trichoderma: An overview. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  4. Ferreira, N. L., Margeot, A., Blanquet, S., Berrin, J. G. Chapter 17 - Use of cellulases from Trichoderma reesei in the twenty-first century part I: Current industrial uses and future applications in the production of second ethanol generation. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  5. Puranen, T., Alapuranen, M., Vehmaanperä, J. Chapter 26 - Trichoderma enzymes for textile industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  6. Kunamneni, A., Plou, F. J., Alcalde, M., Ballesteros, A. Chapter 24 - Trichoderma enzymes for food industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  7. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Herrera-Estrella, A., Schmoll, M., Kenerley, C. M. Trichoderma research in the genome era. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 105-129 (2013).
  8. Mukherjee, M., et al. Trichoderma-plant-pathogen interactions: Advances in genetics of biological control. Indian Journal of Microbiology. 52 (4), 522-529 (2012).
  9. dos Santos, U. R., dos Santos, J. L. Trichoderma after crossing kingdoms: Infections in human populations. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 26 (2), 97-126 (2023).
  10. Asis, A., et al. Identification patterns of Trichoderma strains using morphological characteristics, phylogenetic analyses and lignocellulolytic activities. Molecular Biology Reports. 48 (4), 3285-3301 (2021).
  11. Antal, Z., et al. Comparative study of potential virulence factors in human pathogenic and saprophytic Trichoderma longibrachiatum strains. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 52 (3-4), 341-350 (2005).
  12. Hatvani, L., Manczinger, L., Vágvölgyi, C., Kredics, L. Trichoderma as a human pathogen. Trichoderma: Biology and Applications. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Singh, U. S., Mukherjee, M., Schmoll, M. , Wallingford, UK. (2013).
  13. Kredics, L., et al. Clinical importance of the genus Trichoderma: A review. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 50 (2-3), 105-117 (2003).
  14. Erwig, L. P., Gow, N. A. R. Interactions of fungal pathogens with phagocytes. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 163-176 (2016).
  15. Nicola, A. M., Casadevall, A. In vitro measurement of phagocytosis and killing of Cryptococcus neoformans by macrophages. Methods in Molecular Biology. 844, 189-197 (2012).
  16. Medina, E., Goldmann, O. In vivo and ex vivo protocols for measuring the killing of extracellular pathogens by macrophages. Current Protocols in Immunology. , Chapter 14, Unit 14 1-17 (2011).
  17. Drevets, D. A., Canono, B. P., Campbell, P. A. Measurement of bacterial ingestion and killing by macrophages. Current Protocols in Immunology. 109, 1-17 (2015).
  18. Gresnigt, M. S., et al. Differential kinetics of Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus phagocytosis. Journal of Innate Immunity. 10 (2), 145-160 (2018).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Yan, Q., Ahn, S. H., Fowler, V. G. Macrophage phagocytosis assay of Staphylococcus aureus by flow cytometry. Bio-Protocol. 5 (4), 1406 (2015).
  21. Marr, K. A., Koudadoust, M., Black, M. Early events in macrophage killing of Aspergillus fumigatus conidia New flow cytometric viability assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1240-1247 (2001).
  22. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128, 12-19 (2017).
  23. Siggins, M. K., et al. Differential timing of antibody-mediated phagocytosis and cell-free killing of invasive African Salmonella allows immune evasion. European Journal of Immunology. 44 (4), 1093-1098 (2014).
  24. Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. Journal of Cell Science. 101 (4), 907-913 (1992).
  25. Harvath, L., Terle, D. A. Assay for phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 115, 281-290 (1999).
  26. dos Santos, A. G., et al. Trichoderma asperelloides spores downregulate dectin1/2 and TLR2 receptors of mice macrophages and decrease Candida parapsilosis phagocytosis independent of the M1/M2 polarization. Frontiers in Microbiology. 8, 1681 (2017).
  27. Souza, J. A. M., et al. Characterization of Aspergillus fumigatus extracellular vesicles and their effects on macrophages and neutrophils functions. Frontiers in Microbiology. 10, 2008 (2019).
  28. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Inhibition of extracellular traps by spores of Trichoderma stromaticum on neutrophils obtained from human peripheral blood. Molecular Immunology. 141, 43-52 (2022).
  29. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Trichoderma stromaticum spores induce autophagy and downregulate inflammatory mediators in human peripheral blood-derived macrophages. Current Research in Microbial Sciences. 3, 100145 (2022).
  30. Johnston, L., Harding, S. A., La Flamme, A. C. Comparing methods for ex vivo characterization of human monocyte phenotypes and in vitro responses. Immunobiology. 220 (12), 1305-1310 (2015).
  31. Abedon, S. T., Bartom, E. Multiplicity of infection. Brenner's Encyclopedia of Genetics. Second Edition. Maloy, S., Hughes, K. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  32. Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
  33. Lombard, Y., Giaimis, J., Makaya-Kumba, M., Fonteneau, P., Poindron, P. A new method for studying the binding and ingestion of zymosan particles by macrophages. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 155-165 (1994).
  34. Ghoneum, M., Gollapudi, S. Phagocytosis of Candida albicans by metastatic and non metastatic human breast cancer cell lines in vitro. Cancer Detection and Prevention. 28 (1), 17-26 (2004).
  35. Nunes, J. P. S., Dias, A. A. M. ImageJ macros for the user-friendly analysis of soft-agar and wound-healing assays. BioTechniques. 62 (4), 175-179 (2017).
  36. Alves-Filho, E. R., et al. The biocontrol fungus Trichoderma stromaticum downregulates respiratory burst and nitric oxide in phagocytes and IFN-gamma and IL-10. Journal of Toxicology and Environmental Health - Part A: Current Issues. 74 (14), 943-958 (2011).
  37. Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
  38. Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: Evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 15 (3), 403-411 (2013).
  39. Alonso, M. F., et al. The nature of the fungal cargo induces significantly different temporal programmes of macrophage phagocytosis. The Cell Surface. 8, 100082 (2022).
  40. Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
  41. Dos Santos, U. R., et al. Exposition to biological control agent Trichoderma stromaticum increases the development of cancer in mice injected with murine melanoma. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 252 (2020).
  42. Wang, G., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii induces macrophage activation. Carbohydrate Polymers. 149, 112-120 (2016).
  43. Xu, Y., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii promotes maturation of murine dendritic cells. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 1155-1161 (2016).
  44. Schmoll, M., Esquivel-Naranjo, E. U., Herrera-Estrella, A. Trichoderma in the light of day - Physiology and development. Fungal Genetics and Biology. 47 (11), 909-916 (2010).
  45. Zhang, G., Li, D. Trichoderma longibrachiatum-associated skin inflammation and atypical hyperplasia in mouse. Frontiers in Medicine. 9, 865722 (2022).
  46. Paredes, K., Capilla, J., Mayayo, E., Guarro, J. Virulence and experimental treatment of Trichoderma longibrachiatum, a fungus refractory to treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (8), 5029-5032 (2016).
  47. Perkhofer, S., Speth, C., Dierich, M. P., Lass-Flörl, C. In vitro determination of phagocytosis and intracellular killing of Aspergillus species by mononuclear phagocytes. Mycopathologia. 163 (6), 303-307 (2007).

Tags

levedyktighetsanalyse Trichoderma stromaticum konidier humant perifert blod mononukleære avledede makrofager fagocytose makrofag-patogen-interaksjoner immunresponser mot sopp fagosomflukt soppvirulens biokontrollmiddel biogjødselmiddel humane infeksjoner trichodermakultur vaskekonidier mononukleære celler i perifert blod (PBMC) makrofagdifferensiering in vitro fagocytosemetode clearanceanalyse soppclearance effektivitet
Levedyktighetsanalyse av <em>Trichoderma stromaticum</em> Conidia i humant perifert blod mononukleære makrofager
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

dos Santos, U. R., de Castro, J. O., … More

dos Santos, U. R., de Castro, J. O., Santos Matos, M. E., De Bonis, G., dos Santos, J. L. Viability Assay of Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (200), e65231, doi:10.3791/65231 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter