Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

טומוגרפיה פוטואקוסטית, אולטרסאונד ואנגיוגרפיה משולבת (PAUSAT) להדמיית מוח שלם לא פולשנית של שבץ איסכמי

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65319
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Multidisciplinary Brain Protection Program, Department of Anesthesiology, Duke University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

עבודה זו מדגימה את השימוש בפלטפורמת הדמיה מבוססת אולטרסאונד מולטימודאלי להדמיה לא פולשנית של שבץ איסכמי. מערכת זו מאפשרת לכמת חמצון דם באמצעות הדמיה פוטואקוסטית וזילוח לקוי במוח באמצעות אנגיוגרפיה אקוסטית.

Abstract

מוצג כאן מחקר שבץ איסכמי ניסיוני באמצעות מערכת הדמיה לא פולשנית שפיתחנו לאחרונה המשלבת שלוש טכנולוגיות הדמיה מבוססות אקוסטיקה: פוטואקוסטית, אולטרסאונד וטומוגרפיה אנגיוגרפית (PAUSAT). שילוב שלושת השיטות הללו מסייע ברכישת טומוגרפיה פוטואקוסטית מולטי-ספקטרלית (PAT) של חמצון הדם במוח, הדמיית אולטרסאונד בתדר גבוה של רקמת המוח ואנגיוגרפיה אקוסטית של זילוח הדם המוחי. פלטפורמת ההדמיה הרב-מודאלית מאפשרת לחקור את שינויי הזלוף והחמצון המוחיים במוח העכבר כולו לאחר שבץ. שני מודלים נפוצים של שבץ איסכמי הוערכו: מודל חסימת עורק המוח האמצעי הקבוע (pMCAO) והמודל הפוטוטרומבוטי (PT). PAUSAT שימש כדי לדמיין את אותם מוחות עכבר לפני ואחרי שבץ ולנתח כמותית את שני המודלים של שבץ. מערכת הדמיה זו הצליחה להראות בבירור את השינויים בכלי הדם במוח לאחר שבץ איסכמי, כולל הפחתה משמעותית בזילוח הדם וחמצון באזור אוטם השבץ (ipsilateral) בהשוואה לרקמה שלא נפגעה (contralateral). התוצאות אושרו הן על ידי הדמיית ניגודיות כתמי לייזר והן על ידי צביעת טריפנילטטרזוליום כלוריד (TTC). יתר על כן, נפח אוטם שבץ בשני המודלים שבץ נמדד ואומת על ידי צביעת TTC כאמת הקרקע. באמצעות מחקר זה, הוכחנו כי PAUSAT יכול להיות כלי רב עוצמה במחקרים פרה-קליניים לא פולשניים ואורכיים של שבץ איסכמי.

Introduction

הדם מוביל חמצן (דרך חלבון המוגלובין) וחומרים מזינים חשובים אחרים לרקמות בגופנו. כאשר זרימת הדם דרך רקמות מופרעת (איסכמיה), נזק חמור לרקמות יכול להתרחש, ההשפעות המיידיות ביותר של אשר נובעים מחוסר חמצן (היפוקסיה). שבץ איסכמי הוא תוצאה של זרימת דם מופרעת לאזור מסוים במוח. הנזק המוחי הנובע משבץ איסכמי יכול להתרחש בתוך דקות מחסימת כלי הדם, ולעתים קרובות יכול להיות בעל השפעות מתישות ומתמשכות 1,2. אסטרטגיה בעלת ערך רב להעריך את הפיזיופתולוגיה לאחר שבץ איסכמי ולזהות ולבדוק טיפולים חדשים היא השימוש במודלים של בעלי חיים קטנים במעבדה. הטיפולים המתגלים במעבדה שואפים להיות מתורגמים לשימוש קליני ולשפר את חיי המטופלים. עם זאת, השימוש בבעלי חיים במחקר ביו-רפואי צריך להיבחן בקפידה על פי עקרונות 3Rs של ראסל וברץ': החלפה, הפחתה ועידון3. מטרת רכיב ההפחתה היא לצמצם את מספר בעלי החיים מבלי לפגוע באיסוף הנתונים. בהתחשב בכך, היכולת להעריך לאורך את התפתחות הנגע באמצעות הדמיה לא פולשנית מאפשרת יתרון גדול בהפחתת מספר בעלי החיים הנדרשים, כמו גם למקסם את המידע המתקבל מכל חיה4.

טומוגרפיה פוטואקוסטית (PAT) היא שיטת הדמיה היברידית המשלבת ניגודיות ספיגה אופטית עם דימות אולטרסאונד ברזולוציה מרחבית5. מנגנון ההדמיה של PAT הוא כדלקמן. פולס לייזר עירור מואר על המטרה המצולמת. בהנחה שהמטרה בולעת אור באורך הגל של לייזר העירור, הטמפרטורה שלו תעלה. עלייה מהירה זו בטמפרטורה גורמת להתרחבות תרמו-אלסטית של המטרה. ההתפשטות גורמת לגל אולטרסאונד להתפשט החוצה מהמטרה. על ידי גילוי גל האולטרסאונד במיקומים רבים, הזמן הדרוש לגל להתפשט מהמטרה לגלאים יכול לשמש ליצירת תמונה באמצעות אלגוריתם שחזור. היכולת של PAT לזהות ספיגה אופטית באזורי רקמות עמוקים מבדילה PAT מהדמיית אולטרסאונד, המזהה גבולות של עכבות אקוסטיות שונות של רקמות5. בספקטרום הנראה והתת-אדום הקרוב, הביומולקולות העיקריות בעלות ספיגה גבוהה הנמצאות בשפע באורגניזמים הן המוגלובין, שומנים, מלנין ומים7. עניין מיוחד בחקר שבץ מוחי הוא המוגלובין. מכיוון שלאוקסיהמוגלובין ולדאוקסיהמוגלובין יש ספקטרום ספיגה אופטי שונה, ניתן להשתמש ב- PAT עם אורכי גל לייזר עירור מרובים כדי לקבוע את הריכוז היחסי של שני מצבי החלבון. זה מאפשר את ריווי החמצן של המוגלובין (sO2), או חמצון הדם, להיות מכומת בתוך ומחוץ לאזור אוטם 8,9. זהו מדד חשוב בשבץ איסכמי, שכן הוא יכול להצביע על רמת החמצן ברקמת המוח הפגועה לאחר איסכמיה.

אנגיוגרפיה אקוסטית (AA) היא שיטת דימות אולטרסאונד משופרת בניגודיות השימושית במיוחד להדמיית המורפולוגיה של כלי הדם in vivo10. השיטה מסתמכת על שימוש במתמר מתנודד דו-אלמנטי (אלמנט בתדר נמוך ואלמנט בתדר גבוה) בשילוב עם מיקרו-בועות המוזרקות למערכת הדם של נושא ההדמיה. אלמנט התדר הנמוך של המתמר משמש לשידור בתדר התהודה של המיקרו-בועות (למשל, 2 מגה-הרץ), ואילו אלמנט התדר הגבוה משמש לקליטת האותות הסופר-הרמוניים של המיקרו-בועות (למשל, 26 מגה-הרץ). כאשר הן מעוררות בתדר תהודה, למיקרו-בועות יש תגובה לא ליניארית חזקה, וכתוצאה מכך נוצרות אותות סופר-הרמוניים שרקמות הגוף הסובבות אותן אינן מייצרות11. על ידי קבלה עם אלמנט בתדר גבוה, זה מבטיח כי רק אותות microbubble מזוהים. מכיוון שהמיקרו-בועות מוגבלות לכלי הדם, התוצאה היא תמונה אנגיוגרפית של מורפולוגיה של כלי הדם. AA היא שיטה רבת עוצמה להדמיית שבץ איסכמי, מכיוון שהמיקרו-בועות הזורמות דרך מערכת הדם אינן מסוגלות לזרום דרך כלי דם חסומים. זה מאפשר AA לזהות אזורים במוח שאינם מחוררים עקב שבץ איסכמי, אשר מציין את אזור האוטם.

מחקר שבץ איסכמי פרה-קליני מסתמך בדרך כלל על שימוש בהיסטולוגיה ובבדיקות התנהגותיות כדי להעריך את המיקום והחומרה של השבץ. צביעת Triphenyltetrazolium chloride (TTC) היא ניתוח היסטולוגי נפוץ המשמש לקביעת נפח אוטם שבץ. עם זאת, ניתן להשתמש בו רק בנקודת קצה, שכן הוא דורש המתת חסד של בעל החיים12 . ניתן להשתמש במבחנים התנהגותיים כדי לקבוע פגיעה בתפקוד המוטורי במספר נקודות זמן, אך הם אינם יכולים לספק ערכים אנטומיים או פיזיולוגיים כמותיים13. הדמיה ביו-רפואית מספקת גישה כמותית יותר לחקר ההשפעות של שבץ איסכמי באופן לא פולשני ואורכי 9,14,15. עם זאת, טכנולוגיות הדמיה קיימות (כגון דימות תהודה מגנטית של בעלי חיים קטנים [MRI]) יכולות לבוא בעלות גבוהה, לא להיות מסוגלות לספק מידע מבני ותפקודי בו-זמני, או שיש להן עומק חדירה מוגבל (כמו רוב טכניקות הדימות האופטי).

כאן אנו משלבים טומוגרפיה פוטואקוסטית, אולטרסאונד ואנגיוגרפיה (PAUSAT; ראו תרשים מערכת באיור 1), המאפשרת מידע מבני ותפקודי משלים של זילוח דם וחמצון לאחר שבץ איסכמי16. אלה שני היבטים חשובים בהערכת חומרת הפציעה ובמעקב אחר ההחלמה או התגובה לטיפולים. שימוש בשיטות הדמיה משולבות אלה יכול להגדיל את כמות המידע המתקבל על ידי כל בעל חיים, להפחית את מספר בעלי החיים הדרושים ולספק מידע נוסף במחקר של טיפולים פוטנציאליים לשבץ איסכמי.

Figure 1
איור 1: דיאגרמת PAUSAT. (A) סכמה מלאה של מערכת PAUSAT, כולל הלייזר וה-OPO המשמשים ל-PAT. (B) מבט מבפנים על מערכת PAUSAT, כולל שני מתמרי אולטרסאונד. מתמר המתנדנד הדו-אלמנטי משמש הן לאולטרסאונד במצב B והן ל-AA, ומתמר המערך הליניארי משמש ל-PAT. שני המתמרים מותקנים על אותה במה ממונעת דו-ממדית, המאפשרת סריקה להפקת נתונים נפחיים. נתון זה שונהמ-16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת דיוק ונערכו בהתאם למדיניות שירות בריאות הציבור של ארצות הברית בנושא טיפול אנושי ושימוש בחיות מעבדה. עכברי C57BL/6J זכרים ונקבות (ראו טבלת חומרים) שימשו למחקרים אלה. לפחות שלושה בעלי חיים צולמו לכל קבוצת מודל שבץ. ראה איור 2 עבור זרימת העבודה המבוצעת בפרוטוקול זה.

Figure 2
איור 2: סיכום ההליך הניסיוני להדמיית PAUSAT המיושמת על שבץ. נוצר באמצעות Biorender.com. האיור מציג את זרימת העבודה של הליך ההדמיה החל מ-(A) שני מודלי השבץ העיקריים (pMCAO ו-PT stroke). (B) הזרקה רטרו-אורביטלית של המיקרו-בועות חייבת להתבצע לפני מיקום החיה על קרום PAUSAT. (ג) מסכה המספקת הרדמה רציפה וכרית חימום לשמירה על טמפרטורת גוף יציבה של בעל החיים נדרשים במערך זה. גוף החיה מונח על כרית החימום בעוד הראש מונח על קרום המערכת. (D) סדר רכישת התמונה מוצג גם באיור. (E) צביעת TTC מבוצעת כדי לאמת את התוצאות שלנו במחקר זה. DPI: ימים לאחר הפציעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. השראת מודל עכבר השבץ

  1. חסימת עורק מוחי אמצעי קבוע (pMCAO) עם קשירת עורק התרדמה המשותף (CCA).
    הערה: בקצרה, בצע קשירה קבועה של CCA ימין ואלקטרוצריבה אחורית של עורק המוח האמצעי הימני (MCA)17. הליך זה מגביל את זרימת הדם המוחית בקליפת המוח הימנית, וגורם לשבץ איסכמי18.
    1. יש להשרות הרדמה בתא אינדוקציה באמצעות תערובת אינהלציונית של 5.0% איזופלורן ב-30% O 2/70% N2 עד לאיבוד הכרה (מוכר כאובדן רפלקס הדוושה).
    2. יש לבצע אינטובציה לבעל החיים באמצעות קטטר 20 גרם (טבלת חומרים) ולחבר אותו למכונת הנשמה אוטומטית. הגדר את קצב הזרימה בהתבסס על משקל הגוף של בעל החיים ושמור על בעל החיים מורדם באמצעות 1.5%-2.0% isoflurane ב 30% O 2/70% N2.
    3. באמצעות מנורת חימום ובדיקה רקטלית המחוברת למכשיר בקר טמפרטורה, שמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים על 37 ° C.
    4. שים טיפה של משחת עיניים סיכה על העיניים של העכבר.
    5. הניחו את בעל החיים במצב שכיבה והוציאו את השיער מאזור הצוואר באמצעות גוזם שיער.
    6. נקו את אזור העור על ידי שימוש תחילה בצמר גפן עם פובידון-יוד, ולאחר מכן באמצעות פד סטרילי עם 70% אתנול. בצע זאת שלוש פעמים.
    7. ודא את עומק ההרדמה ואת היעדר הכאב על ידי צביטה קלה בכפה האחורית של החיה.
    8. בצע חתך sagittal 0.8 ס"מ על הקו האמצעי של הצוואר ולחשוף CCA ימין.
    9. הכינו תפר לקשירת CCA על ידי ניתוק תפר משי 4-0 לחוטים דקים יותר המרכיבים את החוט הראשי. השתמש באורך של 1.5 ס"מ של אחד מהליכי המשנה כדי לשדר את CCA לצמיתות.
      הערה: לאחר הידוק הקשר, הסר את החוט העודף על ידי חיתוך השלוחה במרחק של 1-2 מ"מ לקשר.
    10. החל טיפה של bupivacaine לפני סגירת הפצע.
    11. סגרו את החתך באמצעות תפרים כירורגיים ממשי קטועים 4-0 ומרחו משחה אנטיביוטית משולשת על פני השטח למניעת זיהום.
    12. הזז את העכבר כדי לחשוף את הצד הימני הצידי של גוף החיה.
    13. הסירו את השיער באזור שבין האוזן לאזור העיניים באמצעות גוזם שיער.
    14. יש לחטא את אזור הניתוח באמצעות צמר גפן עם פובידון-יוד, ולאחר מכן פד סטרילי עם 70% אתנול. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
    15. הניחו וילון סטרילי כדי לאבטח את אזור הניתוח. לאחר מכן, בצע חתך של 0.5 ס"מ בין עין ימין לאוזן של החיה, וחשף את המפרק בין הגולגולת לשריר הטמפורלי.
    16. באמצעות לולאת צריבה, צרוב את השריר כדי להפריד אותו מהגולגולת ולחשוף את האזור של MCA.
    17. קדח חלוןבגודל 0.2 מ"מ 2 כדי לחשוף את ה-MCA באמצעות מקדחה חשמלית, והשתמש ב-electrocautery על ה-MCA כדי לחסום את זרימת הדם.
      הערה: מספיק פעימה אחת בעוצמה של 80% כדי לצרוב את ה-MCA.
    18. באמצעות מזרק 1 מ"ל המחובר למחט 27G, להחיל טיפה של bupivacaine (טבלה של חומרים) באתר הניתוח.
    19. סגור את חתך העור באמצעות תפרי מונופילמנט שקופים 6-0 קטועים ומרח משחה אנטיביוטית משולשת על פני השטח כדי למנוע זיהום.
    20. לאחר סיום הניתוח, העבירו את בעל החיים לאינקובטור בטמפרטורה מבוקרת (32 מעלות צלזיוס) ואפשרו לבעל החיים להתאושש.
    21. לאחר שעתיים, העבירו את בעל החיים לכלוב הביתי שלו וספקו מזון ומים עד לליביטום.
  2. שבץ פוטוטרומבוטי (שבץ PT)
    הערה: בקצרה, שבץ PT מבוצע על ידי הארת רוז בנגל בתוך כלי הדם במוח. רוז בנגל מנוהל תוך צפקית, וברגע שהוא מופץ היטב בכל הגוף (5 דקות), הוא מואר על ידי אור קר ירוק, אשר מפעיל את רוז בנגל כדי ליצור מיני חמצן תגובתי (ROS). ROS אלה פוגעים בקרום תאי האנדותל, יוצרים טרומבי בכל האזור המואר ומובילים להפרעה מקומית בזרימת הדם במוח19.
    1. יש להשרות הרדמה בתא אינדוקציה באמצעות תערובת אינהלציונית של 5.0% איזופלורן ב-30% O 2/70% N2 עד לאיבוד הכרה (מוכר כאובדן רפלקס הדוושה).
    2. הגדר את בעל החיים למסגרת סטריאוטקסית, תוך שמירה על בעל החיים מורדם באמצעות מסכה ו 1.5%-2.0% isoflurane ב 30% O 2/70% N2.
    3. שמור על בעל החיים ב 37 ° C באמצעות תנור מחזור מים חמים בדיקה רקטלית כדי למדוד את טמפרטורת הגוף של החיה.
    4. שים טיפה של משחת עיניים סיכה על העיניים של העכבר.
    5. יש לגלח את ראשו של בעל החיים באמצעות גוזם שיער.
    6. נקו את אזור הקרקפת המגולחת שלוש פעמים, תחילה באמצעות צמר גפן עם פובידון-יוד, ולאחר מכן באמצעות פד סטרילי עם 70% אתנול.
    7. ודא את היעדר הכאב על ידי צביטה קלה בכפה האחורית של החיה.
    8. בצע חתך קשת 1.4 ס"מ בקו האמצעי של הקרקפת באמצעות אזמל ולחשוף את הגולגולת.
    9. באמצעות עיפרון חד, לעשות סימן ב 1.5 מ"מ מן bregma לכיוון צד ימין.
    10. הניחו חור סיכה עגול בקוטר 2.5 מ"מ שבמרכזו סימן 1.5 מ"מ.
      הערה: ריבוע המכיל חור סיכה עגול יכול להיעשות באמצעות סרט שחור דו צדדי ויצירת פתח בקוטר 2.5 מ"מ במרכז באמצעות כלי ניקוב חור יחיד בגודל שהוזכר.
    11. הניחו את האור הירוק הקר על חור הסיכה העגול, תוך שמירה על מרווח מינימלי בין האור לחור הסיכה.
    12. כסו את האזור ברדיד אלומיניום כדי למנוע התפשטות של האור.
    13. לאחר שההתקנה מוכנה, הזריקו לבעל החיים תוך צפקי 10 מ"ג/ק"ג רוז בנגל (10 מ"ג/מ"ל במי מלח חוצצים פוספט אחד [PBS]) והמתינו 5 דקות.
    14. לאחר 5 דקות, הפעל את מקור האור הקר (עוצמה: 4.25) ושמור על החשיפה למשך 15 דקות.
    15. לאחר מכן, כבו את האור הקר ואמתו את השבץ בעין בלתי (האזור צפוי להיות לבן יותר מהאזור שמסביב) או באמצעות מכשירים חיצוניים למדידת זרימת הדם במוח (לדוגמה, באמצעות הדמיית ניגוד כתמי לייזר (רשימת חומרים; ראה שלב 5.1).
    16. באמצעות מזרק 1 מ"ל המחובר למחט 27G, להחיל טיפה של bupivacaine (טבלה של חומרים) באתר הניתוח.
    17. סגרו את חתך העור באמצעות 6-0 תפרי מונופילמנט שקופים קטועים, ומרחו משחה אנטיביוטית משולשת על פני השטח למניעת זיהום.
    18. לאחר סיום הניתוח, העבירו את בעל החיים לאינקובטור בטמפרטורה מבוקרת (32 מעלות צלזיוס) ואפשרו לבעל החיים להתאושש.
    19. לאחר שעתיים, העבירו את בעל החיים לכלוב הביתי שלו וספקו מזון ומים עד לליביטום.

2. הכנת PAUSAT לדימות

  1. הפעל את הלייזר בגודל 532 ננומטר והשאר אותו דולק למשך 15 דקות כדי להתחמם.
  2. הכינו את פלטפורמת ההדמיה לחיה המורדמת.
    1. הניחו רמפה מותאמת אישית (איור 2C) המחוברת לשלב המתכוונן ידנית (רשימת חומרים) לצד קרום ההדמיה.
    2. חבר מחזיק שיניים עכבר עם צינור הנשימה המחובר לרמפה המותאמת אישית וחבר כרית חימום על פני הרמפה.
  3. לאחר שהלייזר התחמם, בדוק שנתיב הלייזר והצמידות לחבילת הסיבים מיושרים היטב באמצעות כרטיס גלאי אינפרא אדום קרוב (רשימת חומרים) על ידי מיקום הכרטיס לפני כניסת חבילת הסיבים ולוודא שאור הלייזר נכנס לצרור.
    הערה: התאם את מראות נתיב הלייזר לפי הצורך כדי להבטיח שקלט הלייזר ממורכז עם קלט חבילת הסיבים.

3. הכנת החיה לפאוסט

הערה: PAUSAT מבוצע יום אחד לאחר ניתוח שבץ PT או 3 ימים לאחר ניתוח pMCAO. הכנת PAUSAT להדמיה (שלב 2) אורכת כ-20 דקות ויש לעשות זאת מיד לפני הכנת החיה ל-PAUSAT.

  1. יש להשרות הרדמה בתא אינדוקציה באמצעות תערובת אינהלציה של 5% איזופלורן מעורבב עם 30% O 2/70% N2 עד לאיבוד הכרה (מוכר כאובדן רפלקס הדוושה).
  2. מעבירים את בעל החיים למצע מחומם עם מחזיק שיניים ומסכה, ושומרים על ההרדמה באיזופלורן 1.5%-2.0% ב-30% O 2/70% N2.
  3. השתמש במנורת חימום ובבדיקה רקטלית המחוברת למכשיר בקר טמפרטורה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים על 37 ° C.
  4. גזזו את השיער בחלק העליון של ראש החיה באמצעות מכונת גילוח חשמלית. כלול את האזור מקרוב העיניים אל מאחורי האוזניים.
  5. יש לגלח את השיער בחלק העליון של ראשו של בעל החיים על ידי מריחת קרם מסחרי להסרת שיער כדי להסיר לחלוטין את השיער הקצר שנותר. השאירו על העור למשך 5-6 דקות, ולאחר מכן נגבו באמצעות צמר גפן טבול במים כדי לסייע בהסרה מלאה של הקרם. יש לחזור על הפעולה עד שהעור נקי משיער.
    הערה: לצורך הדמיה יום אחד לאחר הניתוח, ניתן לבצע שלבים אלה לפני תחילת הניתוח; ביום אחד לאחר שבץ PT, ניתן להשמיט אותם. כאשר רכישת תמונה PAUSAT מבוצעת מספר ימים לאחר הניתוח, שלב זה נדרש באופן קריטי להתבצע.
  6. ברגע שהחיה והמערכת מוכנים להדמיה, וממש לפני העברת בעל החיים לפלטפורמה של המערכת, הזריקו תמיסה של 100 מיקרו-ליטר של מיקרו-בועות בריכוז המלאי (טבלה של חומרים) רטרו-מסלולית באמצעות מחט 27 גרם.
    הערה: ברגע שהבועות נמצאות במחזור בזרם הדם, יש פרק זמן מוגבל לתמונה ללא אובדן משמעותי של אות (~ 10 דקות).
  7. שים טיפה של קרם הגנה על העיניים של העכבר.
    הערה: לא מומלץ למרוח חומר סיכה לעיניים עד לביצוע הזרקת רטרו-אורביטל כדי למנוע מחומרים זרים להגיע למחזור הדם של החיה. לכן, מריחת קרם להסרת שיער חייבת להתבצע לאט ובזהירות כדי למנוע התקרבות רבה מדי לעיניים (אך מספיק כדי לחשוף את אזור העניין בו צפוי השבץ). הסרת קרם השיער מתבצעת באמצעות צמר גפן שהיה טבול בעבר במים, ומונע מהקרם לטפטף, מה שעלול להזיק לעיניים.

4. הדמיית PAUSAT

הערה: זה נעשה כדי לדמיין את האזורים הנגדיים והאיפסי של המוח לאחר שבץ

  1. העבר את העכבר לפלטפורמת התמונה המשולבת PAUSAT (Table of Materials), והצב את העכבר במצב שכיבה על הרמפה המותאמת אישית (איור 2C).
  2. מלא את חלון ההדמיה במספיק מים מזוקקים על פני השטח לצורך צימוד אקוסטי.
    הערה: מומלץ להשתמש ברמפה אופציונלית המודפסת באמצעות מדפסת תלת-ממד כדי למנוע מגוף בעל החיים להירטב במהלך רכישת התמונה ולשפר את נוחות החיה. זה גם עוזר לשמור על טמפרטורת גוף יציבה. יתר על כן, ניתן לחבר את הרמפה לשלב ידני (טבלת חומרים) כדי להתאים את עומק המוקד של מתמר המתנדנד הדו-אלמנטי ביחס לראש העכבר. קובץ עיצוב הרמפה המותאם אישית זמין לפי בקשה למחברים.
  3. אבטחו את ראש העכבר במחזיק השיניים וודאו הרדמה וזרימת אוויר נאותים.
  4. באמצעות מנורת חימום ובדיקה רקטלית המחוברת למכשיר בקר טמפרטורה, שמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים על 37 ° C.
  5. פתח את יישום ההדמיה (רשימת חומרים) ונווט לאולטרסאונד במצב B.
  6. השתמש בחלון האולטרסאונד החי כדי להתאים ידנית את ראש העכבר למיקום הרצוי.
  7. השתמש בחלון האולטרסאונד החי כדי להתאים את גובה הבמה, כך שעומק המוקד של המתמר (19 מ"מ) יהיה בערך באמצע האזור לצילום.
  8. הדמיה עם אולטרסאונד במצב B
    1. התאם את הערך של תדר שידור אולטרסאונד במצב B (עבור מחקרים אלה, השתמש 16 MHz).
    2. הזן את פרטי ספריית השמירה ביישום ההדמיה.
    3. השתמש בתיבה הצפה כדי לבחור את האזור הרצוי לסריקת המוח במצב B.
    4. לחץ על הלחצן רכוש סטטי.
    5. בדוק את תוצאות הסריקה ביישום לאחר השלמת רכישת התמונה כדי לוודא שהאזור הרצוי הוקלט.
      הערה: הימנע מעיכובים מיותרים ברכישת הדמיה במצב B כדי להבטיח שריכוז גבוה מספיק של מיקרו-בועות יישאר בזרם הדם עבור AA.
  9. הדמיה עם AA
    1. חזור לרכישת תמונות.
    2. עבור למצב אנגיוגרפיה אקוסטית ביישום ההדמיה (רשימת חומרים).
    3. הזן את פרמטרי פרוטוקול הסריקה הרצויים (החשוב שבהם הוא ריווח מסגרות ומספר המסגרות לכל מיקום, שהוגדר ל -0.2 מ"מ ו- 10, בהתאמה, עבור מחקרים אלה).
    4. לחץ על הלחצן רכוש סטטי.
      הערה: רכישת AA נמשכת זמן רב יותר מאולטרסאונד במצב B.
    5. לאחר השלמת הסריקה, בדוק את תוצאות הסריקה תחת ניתוח תמונה כדי לוודא שאיכות התמונה היא כצפוי.
      הערה: עבור מצב AA, ניתן להשיג נפח מייצג יותר של המוח כולו על-ידי חזרה על סריקה שנייה בעומק מוקד שונה בתוך המוח, ולאחר מכן שילוב מחדש של התמונות עם עיבוד נכון (ראו איור 3).
  10. הדמיה עם טומוגרפיה פוטואקוסטית
    1. פתח את יישום המתנד הפרמטרי האופטי (OPO) (רשימת חומרים) והגדר אותו ל- 756 ננומטר.
      הערה: OPO יכולים בקלות לצאת מהכיול, לכן לפני הניסוי, ודא שה- OPO מכויל כראוי באמצעות ספקטרומטר עצמאי.
    2. תרגם ידנית את מתמר המערך הליניארי לקואורדינטות שנקבעו קודם לכן כדי להבטיח שאמצעי האחסון המתנדנדים ואמצעי האחסון של המערך הליניארי יירשמו במשותף באופן אוטומטי.
      הערה: קריטי שניסוי רישום משותף באמצעות רשת פנטום ייעשה מראש כדי לקבוע את המרחק המדויק הדרוש לתרגום השלב, כך שהנתונים המתקבלים משני המתמרים יירשמו במשותף בתלת-ממד.
    3. פתח את יישום הלייזר והפעל את הלייזר 532 ננומטר.
    4. באמצעות מד כוח לייזר, למדוד את האנרגיה של פלט הלייזר ולוודא כי היא האנרגיה הרצויה (~ 10 mJ לכל פולס שימש עבור מחקרים אלה).
    5. בחר את פרמטרי הסריקה הרצויים עבור PAT (גודל צעד של 0.4 מ"מ, אורך סריקה של 20 מ"מ וממוצע של 10 מסגרות לכל מיקום).
    6. פתח את תוכנית MATLAB של מערכת איסוף נתוני אולטרסאונד (Table of Materials) ולחץ על כפתור ההפעלה .
    7. רכוש את סריקת PAT על-ידי לחיצה על לחצן התחל .
    8. לאחר השלמת הסריקה, פתחו את תוכנית השמירה של MATLAB. שנה את שם השמירה לשם הקובץ הרצוי ולחץ על לחצן הפעל .
    9. שנה את אורך הגל של OPO ל- 798 ננומטר וחזור על השלבים מ- 4.10.3 ל- 4.10.8.
      הערה: למחקר אורך, מומלץ לאפשר לבעל החיים להתאושש על ידי הצבתו באינקובטור ובהשגחה למשך מספר שעות (לאחר שלבים 1.1.18 ו- 1.1.19). אם יש צורך באימות תוצאות, המשך לסעיף 5 מיד לאחר הדמיה של PAUSAT.

5. אופציונלי: אימות תוצאות

  1. הדמיית ניגודיות כתמי לייזר (LSCI).
    1. מרדימים את בעל החיים באמצעות איזופלורן 1.5%-2.0% ב-30% O 2/70% N2.
    2. הגדר את בעל החיים למסגרת סטריאוטקסית, תוך שמירה על בעל החיים מורדם באמצעות מסכה והרדמה אינהלציונית שהוזכרה לעיל.
    3. שמור על בעל החיים ב 37 ° C באמצעות תנור מחזור מים חמים בדיקה רקטלית כדי למדוד את טמפרטורת הגוף של החיה.
    4. שים טיפה של קרם הגנה על העיניים של העכבר.
    5. ודא את היעדר הכאב על ידי צביטה קלה בכפה האחורית של החיה.
    6. הסר את השיער על הקרקפת של בעל החיים באמצעות גוזם שיער.
    7. יש לחטא את אזור הניתוח באמצעות צמר גפן עם פובידון-יוד, ולאחר מכן פד סטרילי עם 70% אתנול. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
    8. בצע חתך sagittal 1.4 מ"מ על הקו האמצעי של הקרקפת ולחשוף את הגולגולת. השתמשו במלקחיים כדי להחזיק את הקרקפת ולמנוע ממנה לתפוס את אזור המוח לסריקה.
    9. מרחו כמה טיפות מלח על הגולגולת והניחו את מכשיר מערכת הניגוד בלייזר (טבלת חומרים) מעל ראשו של בעל החיים.
    10. תחת תפריט קובץ , הגדר את ההתקן במצב מקוון, הכלול בתפריט המשנה מצב עבודה.
    11. בחרו בתיקיית אחסון התמונות המוגדרת כברירת מחדל בתפריט 'קובץ' ובתפריט המשנה 'שמור קביעות'.
    12. בתפריט מקור אור, חבר את הלייזר המנחה ("לייזר מופעל") ואת האור הלבן (" אור לבן דולק") כדי לאתר את חלון ההדמיה במיקום הנכון.
    13. בתפריט הגדרה, בחר הגדרות הגדלה, הזז את הסמן ידנית ל- 2.5 ולחץ על החל ואישור כדי לשמור את ההגדרות.
    14. כוונן את המיקוד על-ידי הזזת סרגל המיקוד באופן ידני הממוקם בתפריט המשנה העליון של הדף הראשי.
    15. בתפריט Setting , בחר Pseudo Color Threshold Setting, התאם את הסף כרצונך ולחץ על Apply ו - OK כדי לשמור את ההגדרות.
    16. בתפריט מקור אור, נתק את הלייזר המנחה ("לייזר כבוי") ואת האור הלבן (" אור לבן כבוי") לפני לכידת התמונה.
    17. צלם את התמונה על ידי בחירת סמל ההפעלה בתפריט המשנה העליון של הדף הראשי.
  2. צביעת טריפנילטטרזוליום כלוריד (TTC)
    1. מרדים עמוק את בעל החיים באמצעות 5% isoflurane ב 30% O 2/70% N2.
    2. לאחר שבעל החיים הפסיק לנשום, ערפו את ראשו באמצעות מספריים חדים.
    3. הסר את כל העור סביב הראש ואת השרירים באזור הצוואר.
    4. בצע חתך sagittal בחלק העורפי של הגולגולת עד שהוא מגיע לעצם הקודקוד.
    5. בצע חתך אופקי (~ 5 מ"מ) בצד שמאל וימין מתחת לכלי הדם. הסר את עצם העורפית של הגולגולת באמצעות מלקחיים ישרים.
    6. בצע חתך (~ 5 מ"מ) בתפר הקדמי של הגולגולת.
    7. בצע חתך קשת (~ 10-15 מ"מ) בקו האמצע של הגולגולת - בין חצאי הכדור - וודא שהם מופרדים לחלוטין.
    8. באמצעות מספריים מעוקלים בגודל #7, הסר את העצמות השמאלית והימנית הקודקודית של הגולגולת מהמרכז לצדדים.
    9. מעבירים את המוח למיכל מלא ב-5 מ"ל של PBS 1x קר כקרח ושומרים אותו על קרח למשך 10 דקות.
    10. העבירו את המוח למטריצת מוח מפלדת אל-חלד (מקטעים בעובי 1 מ"מ).
    11. חתכו את המוח למקטעים קורונליים בקוטר 1 מ"מ באמצעות סכיני גילוח חד פעמיים (Table of Materials).
    12. מחזיקים את הלהבים בצדדיהם, מעבירים למיכל מלא ב-PBS 1x קר כקרח.
    13. הפרידו בזהירות את החלקים מהלהבים בזה אחר זה.
    14. מעבירים את פרוסות המוח לצלחת פטרי בקוטר 70 מ"מ המכילה 5 מ"ל של 2% TTC (טבלת חומרים, 3) ב-1x PBS.
    15. יש לדגור במשך 15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר (R/T).
    16. לאחר 15 דקות, השליכו את ה-TTC, החליפו אותו ב-3 מ"ל פורמלין ודגרו בחושך למשך 30 דקות לפחות ב-R/T.
    17. לבסוף, העבירו את פרוסות המוח על סרט פלסטיק שקוף וסרקו את הדגימות, כולל סרגל בתמונת הסריקה כהפניה למדידות עתידיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הדמיה של מורפולוגיה של כלי דם במוח
AA מייצר תמונות מורפולוגיות של כלי דם על ידי מיקרו-בועות מלהיבות במערכת הדם בתדירות התהודה שלהן וקבלת התגובה הסופר-הרמונית של המיקרו-בועות. על-ידי שימוש ברמפה המותאמת אישית (איור 2C) המחוברת לשלב שניתן לכוונן ידנית, אנו יכולים לדמיין את מוח העכבר במצב AA בשני עומקי מוקד שונים. כאשר אזורים עמוקים יותר מכוונים, אזורים שטחיים יותר (כמו קליפת המוח) מראים רזולוציה ועוצמת אות נמוכות יותר (איור 3A), ולהיפך (איור 3B). אולם על-ידי רכישת שני עומקי מוקד ושילובם, תמונות AA יכולות לספק מידע על חתך שלם של העטרה (איור 3C,D). בנוסף, על ידי שימוש בשלב הממונע כדי לסרוק לאורך ממד שלישי, PAUSAT יכול לרשום סדרה של תמונות קורונליות המכסות את אזור העניין (ROI) שהוגדר על ידי המשתמש. סדרות אלה של תמונות יכולות להיות מיושרות ולהשתמש בהן כדי לדמיין ייצוג תלת-ממדי של המוח כולו, או החזר ההשקעה שהוגדר על ידי המשתמש. עם זאת, תוצאות נוספות המוכיחות כי ניתן לנתח מדדים כמותיים אחרים (כגון נפח השבץ) באמצעות מידע תלת-ממדי מאוסף התמונות שנרכשו על ידי PAUSAT מובאות גם כאן.

הערכה אנטומית ותפקודית לפני ואחרי שבץ איסכמי
כדי להמחיש את הפוטנציאל של מערכת PAUSAT במחקרים פרה-קליניים, חקרנו שתי קבוצות של בעלי חיים שעברו את אחד המודלים של שבץ איסכמי שנותחו כאן: pMCAO או PT stroke. שני מודלים אלה של שבץ נבדלים זה מזה בעקרונות שבאמצעותם נוצר האזור האיסכמי. בקצרה, במודל pMCAO, עורק המוח האמצעי הוא electro-cauterized, לעצור את אספקת הדם מעורק זה למוח. פגיעה זו גורמת לפגיעה משנית, שבה הרקמה שמסביב הופכת לאיסכמית, ומגדילה את האזור שנפגע מהשבץ. החלטנו לדמיין את המוח של שבץ pMCAO ביום השלישי לאחר השבץ, מאחר שזהו הזמן שבו מושג האזור המרבי שצפוי להיות מושפע מהשבץ. בשבץ PT, לעומת זאת, השטח המרבי של הרקמה המושפעת מהשבץ מושג לאחר היום הראשון, ולכן החלטנו לדמיין שבץ PT ביום הראשון לאחר ביצוע השבץ. למרות שבחרנו בנקודות זמן אלה במחקר שלנו, PAUSAT יכול לשמש לניטור אורכי של שבץ בכל נקודת זמן רצויה.

ראשית, סריקה במצב B נרכשה כדי לוודא את המיקום הנכון של ראש החיה ולזהות את הגבולות המרחביים בין הגולגולת למוח (איור 4A ואיור 5A). החלק הקדמי ביותר של המוח המודגם כולל את התפר הקדמי של הגולגולת כנקודת התייחסות. החזר השקעה של 20 מ"מ (קדמי עד אחורי) x 17.15 מ"מ (רוחבי) המכסה את השמאלי (נגדי; CL) והזכות (ipsilateral; IL) המיספרות הוגדרו במחקרים הבאים לאיתור אזור השבץ. תמונות AA סיפקו מידע לגבי מבני כלי הדם על ידי מיקוד האות מהמיקרו-בועות המסתובבות. התוצאות שלנו מראות שבמוח שלא נפגע (נקודת ההתחלה), שתי ההמיספרות מציגות התפלגות דומה של כלי הדם (איור 4B ואיור 5B), כצפוי בהיעדר פגיעה. תוצאה דומה נצפתה עבור התפלגות מפת חמצון הרקמה בהתבסס על תמונות PA שהתקבלו בשני אורכי גל שונים (איור 4C ואיור 5C). החלטנו להעריך שני אורכי גל שונים בהתבסס על הבליעה האופטית המקסימלית המקומית של המוגלובין לא מחומצן (756 ננומטר) ואורך הגל שבו המוגלובין לא מחומצן ומחומצן הציג בליעה אופטית שווה (798 ננומטר)20. על-ידי לכידת שני המצבים האלה של המוגלובין, אנו יכולים להעריך במדויק את חמצון הרקמה (איור 4D ואיור 5D).

יום לאחר קבלת תמונת הבסיס מהמוח, ביצענו ניתוח בחיה (pMCAO או PT stroke), כפי שתואר בסעיפים הקודמים. קבוצה חדשה של תמונות נרכשה בנקודת זמן מסוימת לאחר השבץ (ראו איור 2A) כדי להעריך את המיקום והגודל של הקו. תמונות AA שהתקבלו מעכברים שעברו pMCAO מראות ירידה ניכרת בעוצמת האות בצד ימין של קליפת המוח (איור 4B). אותו אזור מראה ירידה במפת חמצון הרקמה מתמונות של הרשות הפלסטינית, מה שמרמז על אזור איסכמי (איור 4D). כדי לאמת את התוצאות שלנו, החלטנו לקצור את המוח ולבצע צביעת TTC מיד לאחר קבלת התמונות מחיית השבץ. התוצאות שלנו מראות שהאזור שזוהה כשבץ דומה בהשוואה לתוצאות שלנו על-ידי PAUSAT ולצביעת TTC המבוססת היטב (איור 4B-E). אנו גם מדגימים כאן כי PAUSAT יכול לזהות אזורי שבץ במוח באמצעות מודל שני של שבץ, שבץ PT, המוערך בנקודת זמן מוקדמת יותר לאחר השראת שבץ (יום אחד). כפי שניתן לראות באיור 5B, הצלחנו לזהות אזור בחלק העליון של קליפת המוח עם אספקת זרימת דם מופחתת וירידה במקביל בריווי החמצן (איור 5D). התוצאות שהתקבלו מצביעת TTC תואמות את המיקום והגודל של השבץ שזוהה בעבר על-ידי PAUSAT (איור 5B-E).

גיל העכבר המצולם יכול להשפיע מאוד על איכות התמונה. גולגולתו של עכבר מתעבה עם הגיל, ומכיוון שלגולגולת יש עכבה אקוסטית שונה משמעותית ביחס לרקמה רכה, אחוז גדול מהגלים העל-קוליים משתקפים בגבול הגולגולת. מכיוון שכל מערכות הדימות המשולבות הללו מבוססות אקוסטית, הדבר מוביל לירידה בעומק ההדמיה עבור עכברים מבוגרים. אפשר לראות זאת בבירור באיור 6, שבו עכברים משלושה גילאים שונים צולמו עם AA באותם תנאים. תוצאות דומות של אות נמוך צפויות אם הליך ההדמיה לא יבוצע כפי שתואר קודם לכן.

ניתוח כמותי של נפח השבץ על ידי PAUSAT
כפי שמתואר בתוצאות שהוזכרו לעיל, PAUSAT לוכדת סדרה של תמונות קורונליות המכוונות להחזר השקעה שתואר על ידי המשתמש. ניתחנו את נפח השבץ על ידי חישוב אזור הקו בתוך תמונות העטרה השונות והמרחק בין התמונות. נפח הקו שחושב על-ידי PAUSAT אינו מראה הבדל סטטיסטי (p < 0.05) בהשוואה לנפח הקו שחושב על בסיס גישה דומה באמצעות תמונות צביעת TTC (איור 7).

Figure 3
איור 3: השפעת עומק מוקד של מתמר מתנדנד על איכות תמונות AA. ניתן לרכוש תמונות בעומקי מוקד מרובים ולשלב אותן מאוחר יותר כדי להפיק את תוצאות ההדמיה הטובות ביותר של המוח כולו. (A) חתך קורונלי AA שנרכש בעומק מוקד עמוק יותר. (B) חתך קורונלי AA שנרכש בעומק מוקד שטחי יותר. (C) תוצאה של מיזוג תמונות עם מיקוד עמוק יותר (ירוק) ותמונות ממוקדות יותר באופן שטחי (מגנטה). (D) תוצאה של שילוב של מיקוד עמוק יותר ותמונות ממוקדות יותר באופן שטחי עם ערך קנה מידה של פיקסלים הדומה ל-(A) ו-(B). נתון זה שונהמ-16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תוצאות PAUSAT מייצגות של מוח עכבר (# 1) לפני ואחרי שבץ pMCAO. (A) תמונות קורונליות של אולטרסאונד במצב B בסיסיות ולאחר שבץ. (B) תמונות AA קורונליות בסיסיות ולאחר שבץ. (C) תמונות העטרה של PA בקו הבסיס ולאחר שבץ בעירור של 756 ננומטר. (D) מפת רוויית חמצן המבוססת על תמונות עירור של 756 ננומטר ו-798 ננומטר. (E) חלקים מוכתמים ב-TTC במוח עכבר, המראים את אותו אזור של שבץ. המרחק בין הקווים בתחתית התמונה מייצג 1 מ"מ. נתון זה שונהמ-16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תוצאות PAUSAT מייצגות של עכבר לפני ואחרי שבץ PT . (A) תמונות קורונליות של אולטרסאונד במצב B בסיסיות ולאחר שבץ. (B) תמונות AA קורונליות בסיסיות ולאחר שבץ. (C) תמונות העטרה של PA בקו הבסיס ולאחר שבץ בעירור של 756 ננומטר. (D) מפת רוויית חמצן המבוססת על תמונות עירור של 756 ננומטר ו-798 ננומטר. (E) חלקים מוכתמים ב-TTC במוח עכבר, המראים את אותו אזור של שבץ. המרחק בין הקווים בתחתית התמונה מייצג 1 מ"מ. נתון זה שונהמ-16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: השפעת גיל העכבר על איכות תמונות AA. איור זה מראה את ההבדל בעוצמת אות AA ובעומק ההדמיה כאשר בעלי חיים מגילאים שונים מצולמים בתנאים דומים. כפי שניתן לראות באיור, הדמיה של עכברים מבוגרים יותר (18 חודשים) מפיקה תמונות באיכות נמוכה יותר בשל גודל ועובי הגולגולת בהשוואה לעכברים צעירים יותר (1.5 חודשים), בעוד שעכברים בוגרים מראים אות ביניים (6 חודשים). בשל חוסר ההתאמה הגדול של העכבה האקוסטית בין הגולגולת לרקמת המוח, גלי אולטרסאונד המתפשטים דרך הגולגולת מוחזרים ונשברים, מה שמוביל לאובדן אות ולירידה ברזולוציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: ניתוח נפח השבץ האיסכמי. (A) דוגמה של מקטעי TTC משבץ PT ותמונות מקוטעות TTC תואמות, תמונות AA ותמונות מקוטעות AA במיקומים קורונליים דומים. (B) נפח הקו שחושב בהתבסס על תמונות TTC ו-AA עבור pMCAO ו-PT stroke, ללא הבדלים משמעותיים (p > 0.05). הגרף מציג את הממוצע ± סטיית התקן (S.D.) (n = 3 בעלי חיים לקבוצה). נתון זה שונהמ-16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנם כמה היבטים חיוניים של שיטה זו, שאם נעשה בצורה לא נכונה, יכול להוביל לירידה משמעותית באיכות התמונה וניתוח כמותי. התוצאה הנפוצה ביותר של שגיאת משתמש בתמונות PAUSAT היא חוסר אות או עוצמת אות נמוכה מאוד, שתיהן יכולות להתרחש ממגוון סיבות. סיבה אחת כזו היא בעיה בצימוד האקוסטי. בועות אוויר גדולות במים המקיפות את ראשו של העכבר במהלך ההדמיה יכולות לעתים קרובות לחסום את האולטרסאונד מלנוע אל המתמר או ממנו, ולגרום לאזור צל בתמונה המתקבלת עבור כל שלושת המודלים של המערכת. ניתן למנוע זאת על ידי הבטחת נוכחות מספקת של מים בין קרום המערכת לבין הדגימה שיש לצלם. זה יכול להתרחש גם כי יש חוסר אות AA, אבל אות PA גבוה להפתיע, ללא תלות באורכי הגל בשימוש. זה יכול להיות בגלל נוכחות של שיער - במיוחד שיער כהה - להפריע לספיגת האור. כדי להימנע מכך, יש צורך לגלח בעבר את ראשו של בעל החיים עד שלא ניתן יהיה לזהות שיער חזותי.

לגבי תמונות AA, בעיה נוספת שעלולה להתרחש ותוביל לחוסר אות או אות נמוך מאוד היא ריכוז נמוך של מיקרו-בועות הקיימות במערכת הדם. אם המיקרו-בועות מדוללות מדי או שהן הוזרקו בצורה לא נכונה, האות המתקבל יהיה חלש מאוד. הזרקת רטרו-מסלולית חייבת להתבצע רק על ידי כוח אדם מאומן היטב. סיבה נוספת יכולה להיות פרק זמן ארוך בין הזרקת מיקרו-בועות לבין תחילת ההדמיה, מה שיכול להוביל להפחתה של המיקרו-בועות בזרם הדם. כדי להימנע מכך, מומלץ להכין את המערכת להדמיה לפני הזרקת המיקרו-בועות, כך שניתן יהיה להעביר את בעל החיים לקרום מערכת PAUSAT מיד לאחר ההזרקה. ראוי להזכיר כי ניתן להשתמש גם בנתיבים חלופיים תוך ורידיים (כגון הזרקת ורידים בזנב) כאשר בעל החיים כבר ממוקם על קרום מערכת PAUSAT, מה שמקצר את הזמן בין הזרקה להדמיה. בנוסף, על מנת לשמור על ריכוז מקסימלי של מיקרו-בועות אפשרי, מומלץ גם לבצע את הדמיית AA לפני הדמיה PA.

אות הרשות הפלסטינית יכול להיות מושפע גם אם הצעדים הדרושים אינם מבוצעים כראוי. אחת הבעיות נוגעת לאיכות לייזר העירור. שני המרכיבים העיקריים המתארים את מקור הלייזר הם אנרגיית הפולס ואורך הגל. מומלץ מאוד להשתמש במד כוח וספקטרומטר עצמאיים כדי למדוד כמויות אלה ולוודא שהן מוגדרות לערכים הרצויים. אם מניחים ערך שגוי, החישובים הפונקציונליים יספקו תוצאות מטעות.

ייתכן גם שכאשר תמונות AA ו-PA משולבות, הן אינן מתואמות. הסיבה העיקרית לכך היא שהקואורדינטות שנקבעו בין המתמרים לא היו מדויקות. כדי למנוע זאת, קריטי לבצע את הניסויים הנדרשים באמצעות רשת פנטום מראש כדי לקבוע את הקואורדינטות המדויקות לרישום משותף מוצלח של תמונות AA ו- PA. מקור פוטנציאלי נוסף לחוסר דיוק נובע מכיול שגוי של OPO. כדי להקל על כך, OPO חייב להיות מכויל כראוי באמצעות ספקטרומטר עצמאי.

נותרו תחומים משמעותיים של שיפור, במיוחד בנוגע לאיכות התמונה של רכיב PAT של מערכת משולבת זו. מערכת PAT הנוכחית מבוססת על תצורת מערך ליניארי סורק. אנו מסוגלים להבחין בהבדלים בקנה מידה גדול בחמצון של אוטם לעומת אזורים בריאים במוח באמצעות מספר מודלים של עכברי שבץ, אולם לא ניתן לראות את כלי הדם המפורטים (כלי דם). ישנן שתי בעיות עיקריות התורמות לאיכות תמונה נמוכה זו. הראשונה היא בעיית הראייה המוגבלת. על מנת ליצור תמונה משוחזרת מלאה של דגימה ב- PAT, הגלאי חייב להקיף לחלוטין את האובייקט (או להיות בעל זווית מוצקה של 4π). עם זאת, במסגרת הניסוי, זה קשה. זה מעורר את בעיית הראייה המוגבלת, מה שמוביל לכך שכלי דם אורתוגונליים למערך המתמרים, אינם ניתנים לגילוי21. קיימים פתרונות להפחתת ההשפעות של בעיית הצפייה המוגבלת במערך ליניארי PAT, שהמבטיח שבהם הוא השימוש במיקרו-בועות כמקורות נקודתיים וירטואליים22. הבעיה השנייה של PAT במערך ליניארי היא רזולוציית גובה ורגישות ירודות, עקב המיקוד החלש של העדשה האקוסטית. עם זאת, השימוש בעקיפה של חריץ יחיד בתכנון החומרה של מערכת מערך ליניארי הוכח כיוצר רזולוציה איזוטרופית ורגישות עבור PAT23,24 של מערך ליניארי. גישות למידה עמוקה הוכחו גם כפותרות חלקית הן את בעיית הראייה המוגבלת והן את רזולוציית הגובה הירודה של PAT25,26,27 במערך ליניארי. השילוב של פתרונות אלה ישפר באופן משמעותי את איכות התמונה של רכיב PAT במערכת ההדמיה המשולבת שלנו.

כאן, הצגנו שיטת הדמיה רב-מודאלית חדשנית לא פולשנית לכימות מבני ותפקודי של שבץ איסכמי במסגרת הפרה-קלינית. באמצעות AA מתאפשרת מורפולוגיה ברורה ומיפוי זילוח של כלי הדם במוח העכבר. חוסר אות מוגדר מקומית יכול להצביע על אזור אוטם שבו יש ירידה בזילוח הדם, המאפשר להעריך את נפח האוטם באופן לא פולשני ואורכי. באמצעות PAT, ניתן למדוד את ריווי החמצן של המוגלובין בתוך ומחוץ לאזור השבץ, ולהראות את המצב ההיפוקסי של רקמות המוח באזור האוטם. שיטה זו של דימות המוח כולו היא בעלות נמוכה ביחס לחלופות מסוימות, כגון MRI של בעלי חיים קטנים. יתר על כן, הוא מאפשר שילוב של מידע פונקציונלי ומבני ברקמה עמוקה שמכשירי הדמיה פרה-קליניים אחרים אינם מסוגלים להשיג. בהשוואה לניתוחים היסטולוגיים, שיטה זו מאפשרת מדידה של מדדים אלה לאורך ובנקודות זמן מרובות, בניגוד לנקודת קצה אחת. היכולת לעשות זאת תספק פירוט כמותי חסר תקדים במחקר הפרה-קליני של שבץ איסכמי. בנוסף, יכולת ההדמיה המבנית והתפקודית של מערכת זו יכולה להיות מיושמת במחקרים פרה-קליניים רבים מעבר לשבץ איסכמי28. כל מצב מחלה או תופעה ביולוגית המשפיעים על מערכת כלי הדם יכולים להיחקר לעומק באמצעות PAUSAT, מה שהופך אותו לכלי הדמיה פרה-קליני רב עוצמה שניתן לתרגם לתחומים פרה-קליניים רבים אחרים (למשל, סרטן).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים בעבודה זו.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לצוות ההנדסה של SonoVol Inc. על התמיכה הטכנית שלהם. עבודה זו מומנה חלקית על ידי פרס איגוד הלב האמריקאי למדעים שיתופיים (18CSA34080277), לג'יי יאו וו' יאנג; המכונים הלאומיים לבריאות של ארצות הברית (NIH) מעניקים R21EB027981, R21 EB027304, RF1 NS115581 (יוזמת המוח), R01 NS111039, R01 EB028143; פרס CAREER של הקרן הלאומית למדע של ארצות הברית (NSF) 2144788; מענק יוזמת צוקרברג ע"ש צ'אן (2020-226178), לג'יי יאו; וה-NIH מעניק R21NS127163 ו-R01NS099590 ל-W. Yang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 GA catheter BD Insyte Autoguard Winged 381534 For mouse intubation
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma T8877 Necessary for TTC-staining brain for validation
532nm Laser Quantel Q-smart 850 Laser used to pump the OPO for PAT
Automatic Ventilator Rovent Jr. Kent Scientific RV-JR To keep mice under anesthesia during surgical procedure
Black braided silk 4-0 USP Surgical Specialties SP116 Used for sutures on the neck for pMCAO surgery
Bupivacaine Hospira 0409-1159-18 Used prior to closing wounds during surgical procedure
C57BL/6 Mice Jackson Lab #000664 Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female)
Clear suture Ethicon 8606 Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT
Cold Light LED Schott KL 1600 Needed to create PT stroke
Disposable Razor Blade Accutec Blades 74-0002 For sectioning mouse brain
Electric drill JSDA JD-700 Used to expose MCA during pMCAO procedure
Electrocauterization tool Wet-Field Wet-Field Bipolar-RG Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure
Hair removal gel Veet 8282651 Used to remove hair from mouse prior to imaging
High Temperature Cautery Loop Tip BOVIE Medical Corporation REF AA03 Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull
IR Detector Card Thorlabs VRC5 Used to ensure light path is aligned
Laser Power Meter Ophir StarBright, P/N 7Z01580 Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging
Laser Speckle Imaging System RWD Life Science Co. RFLSI-III Can be used to validate stroke surgery success
Lubricant Eye Ointment Soothe AB31336 Can be used to avoid drying of the eyes
Manually adjustable stage Thorlabs L490 Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging
Modified Vega Imaging System Perkin Elmer LLA00061 System containing both B-mode/AA and PAT transducers
Optical Parametric Oscillator Quantel versaScan-L532 Allows for tuning of excitation wavelength in a large range
Programmable Ultrasound System Verasonics Vantage 256 Used for PAT part of system
Rose Bengal Sigma 330000 Necessary to induce PT stroke
Suture LOOK SP116 Used for permanent ligation of CCA
Temperature Contoller Physitemp TCAT-2 Used to maintain stable body temperature of mice during procedures
VesselVue Microbubbles Perkin Elmer P-4007001 Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 87 (1), 179-197 (2007).
  2. Vander Worp, H. B., van Gijn, J. Clinical Practice. Acute ischemic stroke. The New England Journal of Medicine. 357 (6), 572-579 (2007).
  3. Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
  4. Hochrainer, K., Yang, W. Stroke proteomics: from discovery to diagnostic and therapeutic applications. Circulation Research. 130 (8), 1145-1166 (2022).
  5. Wang, L. V., Yao, J. A practical guide to photoacoustic tomography in the life sciences. Nature Methods. 13 (8), 627-638 (2016).
  6. Aldrich, J. E. Basic physics of ultrasound imaging. Critical Care Medicine. 35 (5), S131-S137 (2007).
  7. Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), R37-R61 (2013).
  8. Li, M., Tang, Y., Yao, J. Photoacoustic tomography of blood oxygenation: a mini review. Photoacoustics. 10, 65-73 (2018).
  9. Menozzi, L., Yang, W., Feng, W., Yao, J. Sound out the impaired perfusion: Photoacoustic imaging in preclinical ischemic stroke. Frontiers in Neuroscience. 16, 1055552 (2022).
  10. Gessner, R. C., Frederick, C. B., Foster, F. S., Dayton, P. A. Acoustic angiography: a new imaging modality for assessing microvasculature architecture. International Journal of Biomedical Imaging. 2013, 936593 (2013).
  11. Dayton, P. A., Rychak, J. J. Molecular ultrasound imaging using microbubble contrast agents. Frontiers in Bioscience. 12, 5124-5142 (2007).
  12. Isayama, K., Pitts, L. H., Nishimura, M. C. Evaluation of 2, 3, 5-triphenyitetrazolium chloride staining to delineate rat brain infarcts. Stroke. 22 (11), 1394-1398 (1991).
  13. Ruan, J., Yao, Y. Behavioral tests in rodent models of stroke. Brain Hemorrhages. 1 (4), 171-184 (2020).
  14. Parthasarathy, A. B., Kazmi, S. M. S., Dunn, A. K. Quantitative imaging of ischemic stroke through thinned skull in mice with Multi Exposure Speckle Imaging. Biomedical Optics Express. 1 (1), 246-259 (2010).
  15. Hingot, V., et al. Early ultrafast ultrasound imaging of cerebral perfusion correlates with ischemic stroke outcomes and responses to treatment in mice. Theranostics. 10 (17), 7480-7491 (2020).
  16. Menozzi, L., et al. Three-dimensional non-invasive brain imaging of ischemic stroke by integrated photoacoustic, ultrasound and angiographic tomography (PAUSAT). Photoacoustics. 29, 100444 (2022).
  17. Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. Journal of Visualized Experiments. (89), e51729 (2014).
  18. Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Fern, R., Gibson, C. L. An alternative surgical approach reduces variability following filament induction of experimental stroke in mice. Disease Models & Mechanisms. 10 (7), 931-938 (2017).
  19. Labat-Gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. Journal of Visualized Experiments. (76), e50370 (2013).
  20. Matsumoto, Y., et al. Visualising peripheral arterioles and venules through high-resolution and large-area photoacoustic imaging. Scientific Reports. 8 (1), 14930 (2018).
  21. Xu, Y., Wang, L. V., Ambartsoumian, G., Kuchment, P. Reconstructions in limited-view thermoacoustic tomography. Medical Physics. 31 (4), 724-733 (2004).
  22. Yal Tang,, et al. High-fidelity deep functional photoacoustic tomography enhanced by virtual point sources. Photoacoustics. 29, 100450 (2023).
  23. Zheng, W., Huang, C., Zhang, H., Xia, J. Slit-based photoacoustic tomography with co-planar light illumination and acoustic detection for high-resolution vascular imaging in human using a linear transducer array. Biomedical Engineering Letters. 12 (2), 125-133 (2022).
  24. Wang, Y., et al. Slit-enabled linear-array photoacoustic tomography with near isotropic spatial resolution in three dimensions. Optics Letters. 41 (1), 127-130 (2016).
  25. Vu, T., Li, M., Humayun, H., Zhou, Y., Yao, J. A generative adversarial network for artifact removal in photoacoustic computed tomography with a linear-array transducer. Experimental Biology and Medicine. 245 (7), 597-605 (2020).
  26. Zhang, H., et al. Deep-E: A fully-dense neural network for improving the elevation resolution in linear-array-based photoacoustic tomography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 41 (5), 1279-1288 (2022).
  27. Hauptmann, A., et al. Model-based learning for accelerated, limited-view 3-D photoacoustic tomography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 37 (6), 1382-1393 (2018).
  28. Li, M., et al. Three-dimensional deep-tissue functional and molecular imaging by integrated photoacoustic, ultrasound, and angiographic tomography (PAUSAT). IEEE Transactions on Medical Imaging. 41 (10), 2704-2714 (2022).

Tags

מדעי המוח גיליון 196
טומוגרפיה פוטואקוסטית, אולטרסאונד ואנגיוגרפיה משולבת (PAUSAT) להדמיית מוח שלם לא פולשנית של שבץ איסכמי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Menozzi, L., del Águila, Á.,… More

Menozzi, L., del Águila, Á., Vu, T., Ma, C., Yang, W., Yao, J. Integrated Photoacoustic, Ultrasound, and Angiographic Tomography (PAUSAT) for NonInvasive Whole-Brain Imaging of Ischemic Stroke. J. Vis. Exp. (196), e65319, doi:10.3791/65319 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter