Summary
この研究は、虚血性脳卒中の非侵襲的イメージングのためのマルチモーダル超音波ベースのイメージングプラットフォームの使用を示しています。このシステムは、光音響イメージングによる血液酸素化の定量化と、音響血管造影による脳内の灌流障害の定量化を可能にします。
Abstract
ここでは、光音響、超音波、血管造影断層撮影(PAUSAT)の3つの音響ベースのイメージング技術を統合した、新しく開発された非侵襲的イメージングシステムを使用した実験的虚血性脳卒中研究を紹介します。これら3つのモダリティを組み合わせることで、脳血液酸素化のマルチスペクトル光音響断層撮影(PAT)、脳組織の高周波超音波イメージング、脳血液灌流の音響血管造影が可能になります。マルチモーダルイメージングプラットフォームは、脳卒中後のマウス脳全体の脳灌流および酸素化変化の研究を可能にする。一般的に使用される2つの虚血性脳卒中モデル、永久中大脳動脈閉塞(pMCAO)モデルと光血栓(PT)モデルが評価されました。PAUSATは、脳卒中前後の同じマウス脳を画像化し、両方の脳卒中モデルを定量的に解析するために使用されました。この画像システムは、無傷組織(対側)と比較して、脳卒中梗塞領域(同側)の血液灌流と酸素化の有意な減少を含む、虚血性脳卒中後の脳血管の変化を明確に示すことができました。結果は、レーザースペックルコントラストイメージングとトリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色の両方によって確認されました。さらに、両方の脳卒中モデルにおける脳卒中梗塞体積を測定し、グラウンドトゥルースとしてTTC染色によって検証した。この研究を通じて、PAUSATが虚血性脳卒中の非侵襲的および縦断的前臨床試験において強力なツールになり得ることを実証しました。
Introduction
血液は酸素(ヘモグロビンタンパク質を介して)やその他の重要な栄養素を体内の組織に輸送します。組織を通る血流が中断されると(虚血)、組織に深刻な損傷が起こり得、その最も直接的な影響は酸素欠乏(低酸素症)によるものです。虚血性脳卒中は、脳の特定の領域への血流の中断の結果です。虚血性脳卒中に起因する脳損傷は、血管閉塞から数分以内に発生する可能性があり、多くの場合、衰弱させ、永続的な影響を与える可能性があります1,2。虚血性脳卒中後の生理病理学を評価し、新しい治療法を特定してテストするための非常に価値のある戦略は、実験室での小動物モデルの使用です。研究室で発見された治療法は、臨床使用に変換され、患者の生活を改善することを目的としています。ただし、生物医学研究における動物の使用は、ラッセルとバーチの3R原則(交換、削減、改良)に従って慎重に評価する必要があります3。削減コンポーネントの目的は、データ収集を損なうことなく動物の数を減らすことです。このことを前提として、非侵襲的なイメージングによって病変の進展を縦断的に評価できることは、必要な動物数を減らすとともに、各動物から得られる情報を最大化する上で大きな利点となります4。
光音響断層撮影(PAT)は、光吸収コントラストと超音波イメージング空間分解能5を組み合わせたハイブリッドイメージングモダリティです。PATの撮像メカニズムは以下の通りである。励起レーザーパルスは、画像化されているターゲットに照射されます。ターゲットが励起レーザーの波長の光を吸収すると仮定すると、温度が上昇します。この急激な温度上昇により、ターゲットが熱弾性膨張します。膨張により、超音波がターゲットから伝播します。多くの位置で超音波を検出することにより、波がターゲットから検出器に伝播するのに必要な時間を使用して、再構成アルゴリズムを介して画像を作成できます。深部組織領域における光吸収を検出するPATの能力は、PATを、組織の異なる音響インピーダンスの境界を検出する超音波イメージングと区別する5。可視および近赤外スペクトルにおいて、生物に豊富に存在する主要な高吸収生体分子は、ヘモグロビン、脂質、メラニン、および水です7。脳卒中の研究において特に興味深いのはヘモグロビンである。オキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンは異なる光吸収スペクトルを有するので、PATを複数の励起レーザー波長と共に使用して、タンパク質の2つの状態の相対濃度を決定することができる。これにより、ヘモグロビンの酸素飽和度(sO2)、または血液酸素化を、梗塞領域の内外で定量することができます8,9。これは、虚血後の損傷した脳組織の酸素レベルを示す可能性があるため、虚血性脳卒中の重要な尺度です。
音響血管造影(AA)は、 インビボ10における血管系の形態を画像化するのに特に有用である造影増強超音波画像化法である。この方法は、イメージング対象の循環系に注入されたマイクロバブルと組み合わせて、2素子のワブラートランスデューサ(低周波素子と高周波素子)を使用することに依存しています。トランスデューサの低周波素子はマイクロバブルの共振周波数(例えば2MHz)での送信に使用され、高周波素子はマイクロバブルの超高調波信号(例えば26MHz)を受信するために使用される。共振周波数で励起されると、マイクロバブルは強い非線形応答を持ち、その結果、周囲の体組織が生成しない超高調波信号が生成されます11。高周波素子で受信することで、マイクロバブル信号のみを確実に検出します。マイクロバブルは血管に閉じ込められているため、血管形態の血管造影画像が得られます。AAは、循環器系を流れるマイクロバブルが閉塞した血管を流れることができないため、虚血性脳卒中を画像化するための強力な方法です。これにより、AAは、梗塞領域を示す虚血性脳卒中のために灌流されていない脳の領域を検出することができます。
前臨床虚血性脳卒中研究は、一般に、脳卒中の位置と重症度を評価するために組織学と行動検査の使用に依存しています。トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色は、脳卒中梗塞体積を決定するために使用される一般的な組織学的分析です。ただし、動物を安楽死させる必要があるため、エンドポイントでのみ使用できます12。行動テストは、複数の時点での運動機能障害を決定するために使用できますが、定量的な解剖学的または生理学的値を提供することはできません13。生物医学画像は、虚血性脳卒中の影響を非侵襲的かつ縦断的に研究するためのより定量的なアプローチを提供します9、14、15。ただし、既存のイメージング技術(小動物磁気共鳴画像法[MRI]など)は、コストが高く、構造的および機能的情報を同時に提供できないか、または侵入深さが制限される可能性があります(ほとんどの光学イメージング技術と同様)。
ここでは、光音響、超音波、血管造影断層撮影(PAUSAT;図1のシステム 図を参照)を組み合わせて、虚血性脳卒中後の血液灌流と酸素化の補完的な構造的および機能的情報を可能にします16。これらは、傷害の重症度を評価し、治療に対する回復または反応を監視する上で2つの重要な側面です。これらの統合されたイメージング方法を使用すると、各動物によって取得される情報量を増やし、必要な動物の数を減らし、虚血性脳卒中の潜在的な治療法の研究においてより多くの情報を提供することができます。
図1:パウサット図。 (A)PATに使用されるレーザーとOPOを含むPAUSATシステムの完全な回路図。 (B)2つの超音波トランスデューサを含むPAUSATシステムの内部図。二振動子型ワブラー探触子はBモード超音波と単三振動子の両方に使用され、リニアアレイ探触子はPATに使用されます。両方のトランスデューサは同じ2D電動ステージに取り付けられているため、スキャンして体積データを生成できます。この図は16から変更されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
すべての動物の手順は、デューク大学医療センターの動物の管理および使用委員会によって承認され、実験動物の人道的管理および使用に関する米国公衆衛生局の方針に従って実施されました。これらの研究には、雄と雌のC57BL / 6Jマウス( 材料表を参照)を使用しました。1回の脳卒中モデル群につき少なくとも3匹の動物を画像化した。このプロトコルで従うワークフローについては、 図 2 を参照してください。
図2:脳卒中に適用されたPAUSATイメージングの実験手順の概要。 Biorender.com で作成されました。図は、(A)2つの主要なストロークモデル(pMCAOとPTストローク)から始まるイメージング手順のワークフローを示しています。(B)動物をPAUSAT膜に配置する前に、マイクロバブルの逆軌道注入を行う必要があります。(C)この設定では、連続麻酔を提供するマスクと動物の体温を安定させるための加熱パッドが必要です。頭がシステムの膜の上に置かれている間、動物の体は加熱パッドの上に置かれます。(D)画像取得の順序も図に表示されています。(E)TTC染色は、この研究の結果を検証するために実行されます。DPI:傷害後の日数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
1. 脳卒中マウスモデルの誘導
- 総頸動脈(CCA)結紮を伴う永久的な中大脳動脈閉塞(pMCAO)。
注:簡単に言うと、右CCAの永久結紮と右中大脳動脈(MCA)の後方電気焼灼を行います17。この手順は、脳の右皮質の脳血流を制限し、虚血性脳卒中を引き起こします18。- 意識喪失(ペダル反射の喪失として認識される)まで、30%O 2/70%N2中の5.0%イソフルランの吸入混合物を用いて誘導室内で麻酔を誘発する。
- 20 Gカテーテル(材料表)を使用して動物に挿管し、自動人工呼吸器に接続します。動物の体重に基づいて流速を設定し、30%O 2 / 70%N 2中の1.5%〜2.0%イソフルランを使用して動物を麻酔したままにします。
- 加熱ランプと温度調節器に接続された直腸プローブを使用して、動物の体温を37°Cに保ちます。
- マウスの目に潤滑剤の目の軟膏を一滴置きます。
- 動物を仰臥位に置き、ヘアトリマーを使用して首の部分から髪を取り除きます。
- 最初にポビドンヨードを含む綿棒を使用し、次に70%エタノールを含む滅菌パッドを使用して、皮膚領域をきれいにします。これを3回実行します。
- 動物の後足を少しつまんで、麻酔の深さと痛みがないことを確認します。
- 首の中央線に0.8cmの矢状切開を行い、右CCAを露出させます。
- 4-0シルク縫合糸を主糸を構成する細い糸に解離することにより、CCA結紮用の縫合糸を準備します。サブスレッドの1つを1.5 cmの長さにして、CCAを永久に結紮します。
注意: 結び目を締めた後、結び目から1〜2mmの距離で延長部を切断して、余分な糸を取り除きます。 - 傷を閉じる前にブピバカインを一滴塗ります。
- 中断された4-0シルク外科用縫合糸を使用して切開部を閉じ、感染を防ぐために表面にトリプル抗生物質軟膏を塗布します。
- マウスを動かして、動物の体の右側を露出させます。
-
ヘアトリマーを使用して、耳と目の領域の間の領域の髪を取り除きます。
-
ポビドンヨードを含む綿棒を使用して手術部位を消毒し、続いて70%エタノールを含む滅菌パッドを使用します。この手順を 3 回繰り返します。
-
手術領域を固定するために滅菌ドレープを置きます。次に、動物の右目と耳の間に0.5 cmの切開を行い、頭蓋骨と側頭筋の間の関節を露出させます。
- 焼灼ループを使用して、筋肉を焼灼して頭蓋骨から分離し、MCAの領域を露出させます。
- 電気ドリルを使用して0.2 mm2 の窓を開けてMCAを露出させ、MCAに電気焼灼を使用して血流を遮断します。
注:MCAを焼灼するには、80%の電力強度の単一パルスで十分です。 - 27Gの針に取り付けた1mLシリンジを使用して、手術部位にブピバカイン(材料表)を一滴塗布します。
- 中断された6-0透明なモノフィラメント縫合糸を使用して皮膚の切開部を閉じ、感染を防ぐために表面にトリプル抗生物質軟膏を塗布します。
- 手術が完了したら、動物を制御された温度(32°C)のインキュベーターに移し、動物を回復させます。
- 2時間後、動物を自宅のケージに移し、餌と水を 自由に提供します。
- 光血栓性脳卒中(PT脳卒中)
注:簡単に言えば、PT脳卒中は、脳内の血管内のローズベンガルを照らすことによって実行されます。ローズベンガルは腹腔内投与され、全身によく分布すると(5分)、緑色の冷光で照らされ、ローズベンガルを活性化して活性酸素種(ROS)を生成します。これらのROSは内皮細胞の膜を損傷し、照射領域全体に血栓を形成し、局所的な脳血流の乱れを引き起こします19。- 意識喪失(ペダル反射の喪失として認識される)まで、30%O 2/70%N2中の5.0%イソフルランの吸入混合物を用いて誘導室内で麻酔を誘発する。
- 動物を固定装置用フレームにセットし、マスクおよび30%O 2/70%N 2中の1.5%〜2.0%イソフルランを用いて動物を麻酔したままにする。
- 温水循環ヒーターと直腸プローブを使用して動物を37°Cに保ち、動物の体温を測定します。
- マウスの目に潤滑剤の目の軟膏を一滴置きます。
- ヘアトリマーを使用して動物の頭を剃ります。
- 剃った頭皮領域を3回洗浄し、最初にポビドンヨードを含む綿棒を使用し、次に70%エタノールを含む滅菌パッドを使用します。
- 動物の後足を少しつまんで痛みがないことを確認します。
- メスを使って頭皮の中間線を1.4cm矢状切開し、頭蓋骨を露出させます。
- 鋭い鉛筆を使用して、ブレグマから右側に向かって1.5 mmのところに印を付けます。
- 1.5mmマークの中央に直径2.5mmの円形のピンホールを配置します。
注意: 円形のピンホールを含む正方形は、両面の黒いテープを使用し、上記のサイズの単一穴パンチツールを使用して中央に直径2.5mmの開口部を作ることによって作成できます。 - 緑色の冷光を円形のピンホールに配置し、光とピンホールの間のギャップを最小限に抑えます。
- 光が広がらないようにアルミホイルで覆います。
- セットアップの準備ができたら、10 mg / kgのローズベンガル(1xリン酸緩衝生理食塩水[PBS]に10 mg / mL)を腹腔内注射し、5分間待ちます。
- 5分後、冷光源(強度:4.25)をオンにし、15分間露光を維持します。
- 次に、冷光をオフにして、肉眼(その領域は周囲の領域よりも白いと予想されます)または外部デバイスを使用して脳血流を測定する(たとえば、レーザースペックルコントラストイメージング(材料表;手順5.1を参照))のいずれかで脳卒中を確認します。
- 27Gの針に取り付けた1mLシリンジを使用して、手術部位にブピバカイン(材料表)を一滴塗布します。
- 中断された6-0透明なモノフィラメント縫合糸を使用して皮膚の切開を閉じ、感染を防ぐために表面にトリプル抗生物質軟膏を塗布します。
- 手術が完了したら、動物を制御された温度(32°C)のインキュベーターに移し、動物を回復させます。
- 2時間後、動物を自宅のケージに移し、餌と水を 自由に提供します。
2. イメージングのためのPAUSATの準備
- 532 nmレーザーをオンにし、15分間オンのままにしてウォームアップします。
- 麻酔をかけた動物用のイメージングプラットフォームを準備します。
- イメージングメンブレンの横にある手動で調整可能なステージ(材料表)に取り付けられたカスタマイズされたランプ(図2C)を配置します。
- 呼吸管をカスタマイズされたランプに接続したマウスの歯ホルダーを取り付け、ランプの表面に加熱パッドを固定します。
- レーザーがウォームアップした後、近赤外線検出器カード(材料表)を使用して、カードをファイバーバンドル入力の前に置き、レーザー光がバンドルに入ることを確認し、レーザーパスとファイバーバンドルへの結合が適切に整列していることを確認します。
注意: 必要に応じてレーザーパスミラーを調整して、レーザー入力がファイバーバンドル入力の中央に配置されるようにします。
3.パウサットのための動物の準備
注:PAUSATは、PT脳卒中手術の1日後またはpMCAO手術の3日後に行われます。イメージングのためのPAUSATの準備(ステップ2)には約20分かかり、PAUSATのために動物を準備する直前に行う必要があります。
- 意識が失われる(ペダル反射の喪失として認識される)まで、30%O2/70%N2と混合した5%イソフルランの吸入混合物を使用して誘導室内で麻酔を誘発する。
- 動物を歯ホルダーとマスクを備えた加熱されたプラットフォームに移し、麻酔を30%O 2 / 70%N 2中の1.5%〜2.0%イソフルランに維持する。
- 加熱ランプと直腸プローブを温度調節装置に接続して、動物の体温を37°Cに保ちます。
- 電気かみそりを使用して動物の頭のてっぺんの髪を整えます。目の近くから耳の後ろまでの領域を含めます。
- 市販の脱毛クリームを塗って動物の頭のてっぺんの髪を剃り、残りの短い髪を完全に取り除きます。皮膚に5〜6分間置いてから、水に浸した綿棒を使用して拭き取り、クリームを完全に取り除きます。肌に髪の毛がなくなるまで繰り返します。
注:手術の1日後にイメージングする場合、これらの手順は手術を開始する前に実行できます。PT脳卒中の1日後に、それらは省略することができます。手術の数日後にPAUSAT画像取得を行う場合、このステップを非常に実行する必要があります。 - 動物とシステムがイメージングの準備ができたら、動物をシステムのプラットフォームに移す直前に、ストック濃度のマイクロバブルの100 μL溶液(材料表)を27 Gの針を使用して後眼窩的に注入します。
注:気泡が血流中を循環すると、信号を大幅に失うことなく画像化する時間が限られています(~10分)。 - マウスの目に目の保護ローションを一滴垂らします。
注:異物が動物の血流に到達するのを防ぐために、後眼窩注射が行われるまで眼潤滑剤を塗布することはお勧めしません。したがって、脱毛クリームの塗布は、目に近づきすぎないようにゆっくりと慎重に行う必要があります(ただし、脳卒中が予想される関心領域を露出するのに十分です)。ヘアクリームの除去は、事前に水に浸した綿棒で行い、クリームが滴り落ちて目を損傷するのを防ぎます。
4. パウサットイメージング
注:これは、脳卒中後の脳の対側領域と同側領域を画像化するために行われます
- マウスを統合されたPAUSAT(材料表)画像プラットフォームに移し、カスタマイズされたランプの仰臥位にマウスを置きます(図2C)。
- イメージングウィンドウの表面に音響結合用の十分な蒸留水を入れます。
注意: 画像取得中に動物の体が濡れるのを防ぎ、動物の快適さを向上させるために、3Dプリンターを使用して印刷されたオプションのランプをお勧めします。また、安定した体温を維持するのに役立ちます。さらに、ランプを手動ステージ(材料表)に取り付けて、マウスヘッドに対する二振動子型ワブラー探触子の焦点深度を調整することができます。カスタムランプ設計ファイルは、著者へのリクエストに応じて入手できます。 - マウスヘッドを歯入れに固定し、適切な麻酔と空気の流れを確保します。
- 加熱ランプと温度調節器に接続された直腸プローブを使用して、動物の体温を37°Cに保ちます。
- イメージングアプリケーション(材料表)を開き、Bモード超音波に移動します。
- ライブ超音波ウィンドウを使用して、マウスヘッドを目的の位置に直接調整します。
- ライブ超音波ウィンドウを使用してステージの高さを調整し、探触子の焦点深度(19 mm)が画像化領域のほぼ中央になるようにします。
- Bモード超音波によるイメージング
- Bモードで超音波送信周波数の値を調整します(これらの研究では、16MHzを使用してください)。
- イメージングアプリケーションで保存ディレクトリ情報を入力します。
- フローティングボックスを使用して、脳のBモードスキャンに必要な領域を選択します。
- [静的を取得]ボタンを押します。
- 画像取得が完了したら、アプリケーションでスキャン結果をチェックして、目的の領域が画像化されていることを確認します。
注:Bモードイメージング取得の不必要な遅延を回避して、AAの血流に十分に高濃度のマイクロバブルが残るようにします。
- AAによるイメージング
- 画像取得に戻る
- イメージングアプリケーションで音響血管造影モードに変更します(材料表)。
- 目的のスキャンプロトコルパラメータを入力します(その中で最も重要なのは、フレーム間隔と位置あたりのフレーム数であり、これらの研究ではそれぞれ0.2 mmと10に設定されました)。
- [静的を取得]ボタンを押します。
注意: AA取得は、Bモード超音波よりも時間がかかります。 - スキャンが完了したら、[ 画像分析 ] でスキャンの結果をチェックして、画質が期待どおりであることを確認します。
注:AAモードの場合、脳内の異なる焦点深度で2回目のスキャンを繰り返し、後で適切な後処理で画像を再結合することにより、より代表的な全脳ボリュームを取得できます( 図3を参照)。
- 光音響断層撮影によるイメージング
- 光パラメトリック発振器(OPO)アプリケーション(材料表)を開き、756 nmに設定します。
注意: OPOはキャリブレーションから簡単に抜け出す可能性があるため、実験の前に、独立した分光計を使用してOPOが正しくキャリブレーションされていることを確認してください。 - リニアアレイ探触子を以前に決定した座標に手動で変換して、ワブラーボリュームとリニアアレイボリュームが自動的に同時登録されるようにします。
注:ファントムグリッドを使用した共レジストレーション実験を事前に行い、ステージの移動に必要な正確な距離を決定し、両方のトランスデューサーから得られたデータが3Dで同時登録されるようにすることが重要です。 - レーザーアプリケーションを開き、532nmレーザーをオンにします。
- レーザーパワーメーターを使用して、レーザー出力のエネルギーを測定し、それが目的のエネルギーであることを確認します(これらの研究では、パルスあたり~10 mJが使用されました)。
- PATに必要なスキャンパラメータを選択します(0.4 mmステップサイズ、20 mmスキャン長、および位置ごとに平均10フレーム)。
- 超音波データ収集システムMATLABプログラム(材料表)を開き、 実行 ボタンを押します。
- スタートボタンを押してPATスキャンを取得します。
- スキャンが完了したら、MATLAB保存プログラムを開きます。保存名を目的のファイル名に変更し、[ 実行 ]ボタンを押します。
- OPO波長を798nmに変更し、4.10.3から4.10.8までの手順を繰り返します。
注:縦断的研究では、動物をインキュベーターに入れ、数時間観察することで回復させることをお勧めします(手順1.1.18および1.1.19に従います)。結果の検証が必要な場合は、PAUSATイメージングの直後にセクション5に進みます。
- 光パラメトリック発振器(OPO)アプリケーション(材料表)を開き、756 nmに設定します。
5. オプション: 結果の検証
- レーザースペックルコントラストイメージング(LSCI)。
- 30%O 2 / 70%N 2中の1.5%〜2.0%イソフルランを用いて動物に麻酔をかける。
- 動物を定位固定装置フレームにセットし、マスクおよび上記の吸入麻酔を使用して動物を麻酔したままにする。
- 温水循環ヒーターと直腸プローブを使用して動物を37°Cに保ち、動物の体温を測定します。
- マウスの目に目の保護ローションを一滴垂らします。
- 動物の後足を少しつまんで痛みがないことを確認します。
- ヘアトリマーを使用して動物の頭皮の毛を取り除きます。
- ポビドンヨードを含む綿棒を使用して手術部位を消毒し、続いて70%エタノールを含む滅菌パッドを使用します。この手順を 3 回繰り返します。
- 頭皮の中央線に1.4mmの矢状切開を行い、頭蓋骨を露出させます。鉗子を使用して頭皮を保持し、スキャンする脳の領域を占有しないようにします。
- 頭蓋骨に生理食塩水を数滴垂らし、レーザースペックル造影システム装置(材料表)を動物の頭の上に置きます。
- [ファイル]メニューで、サブメニューの[作業モード]に含まれるデバイスをオンラインモードに設定します。
- [ ファイル ]メニューと[ 設定の保存 ]サブメニューでデフォルトの画像保存フォルダを選択します。
- 光源メニューで、ガイドレーザー(「レーザーオン」)と白色光(「ホワイトライトオン」)を接続して、イメージングウィンドウを正しい位置に配置します。
- [設定]メニューで[倍率設定]を選択し、カーソルを手動で2.5に移動し、[適用]と[OK]を押して設定を保存します。
- メインページの上部のサブメニューにあるフォーカスバーを手動で移動して、フォーカスを調整します。
- [ 設定 ]メニューで、[ 擬似カラーしきい値設定]を選択し、必要に応じてしきい値を調整し、[ 適用 ]と [OK] を押して設定を保存します。
- [光源]メニューで、画像をキャプチャする前に、ガイドレーザー(「レーザーオフ」)と白色光(「ホワイトライトオフ」)を切断します。
- メイン ページの上部サブメニューにある [再生 ] 記号を選択して、画像をキャプチャします。
- トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色
- 30%O2 / 70%N2中の5%イソフルランを使用して動物を深く麻酔する。
- 動物が呼吸を止めたら、鋭いハサミを使って斬首します。
- 頭の周りの皮膚と首の部分の筋肉をすべて取り除きます。
- 頭頂骨に達するまで頭蓋骨の後頭部に矢状切り込みを入れます。
- 血管の下の左右に水平方向(~5mm)の切り込みを入れます。まっすぐな鉗子を使用して頭蓋骨の後頭骨を取り除きます。
- 頭蓋骨の前鼻縫合糸に切り込み(~5mm)を入れます。
- 頭蓋骨の正中線(半球の間)に矢状に切り込み(~10-15 mm)を入れ、それらが完全に分離されていることを確認します。
- サイズ#7の湾曲したはさみを使用して、頭蓋骨の頭頂骨の左右の骨を中央から側面まで取り除きます。
- 脳を5 mLの氷冷1x PBSで満たされた容器に移し、氷上で10分間保ちます。
- 脳をステンレス鋼の脳マトリックス(厚さ1 mmの切片)に移します。
- 使い捨てのかみそりの刃を使用して、1mmの冠状切片に脳を切片化します(材料表)。
- ブレードの側面を持って、氷冷した1x PBSで満たされた容器に移します。
- ブレードからセクションを1つずつ慎重に分離します。
- 脳スライスを、1x PBSに5 mLの2%TTC(材料表、3)を含む直径70 mmのペトリ皿に移します。
- 室温(R / T)で暗所で15分間インキュベートします。
- 15分後、TTCを廃棄し、3 mLのホルマリンと交換し、暗所でR / Tで少なくとも30分間インキュベートします。
- 最後に、脳スライスを透明なプラスチックフィルムに移し、将来の測定の基準としてスキャン画像に定規を含めてサンプルをスキャンします。
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Representative Results
脳内の血管形態のイメージング
AAは、循環器系のマイクロバブルを共振周波数で励起し、マイクロバブルの超高調波応答を受け取ることで血管形態画像を生成します。手動で調整可能なステージに取り付けられたカスタマイズされたランプ(図2C)を使用することにより、2つの異なる焦点深度でAAモードでマウスの脳をイメージングできます。より深い領域をターゲットにすると、より浅い領域(大脳皮質など)は解像度と信号強度が低くなり(図3A)、その逆も同様です(図3B)。しかし、2つの焦点深度を取得して組み合わせることで、AA画像は冠状断面全体に関する情報を提供できます(図3C、D)。さらに、電動ステージを使用して3次元に沿ってスキャンすることにより、PAUSATはユーザーが定義した関心領域(ROI)をカバーする一連のコロナ画像を登録できます。これらの一連の画像を整列させて、脳全体の3D表現、またはユーザーが定義したROIを視覚化するために使用できます。ただし、PAUSATによって取得された画像の編集からの3D情報を使用して、他の定量的測定値(ストローク量など)を分析できることを示す追加の結果もここに提供されます。
虚血性脳卒中前後の解剖学的および機能的評価
前臨床試験におけるPAUSATシステムの可能性を説明するために、ここで分析された虚血性脳卒中のモデルの1つにさらされた2つのグループの動物、pMCAOまたはPT脳卒中を研究しました。これら2つの脳卒中モデルは、虚血領域が作り出される原理が異なる。簡単に言えば、pMCAOモデルでは、中大脳動脈が電気焼灼され、この動脈から脳への血液供給が停止します。この損傷は二次損傷を引き起こし、周囲の組織が虚血性になり、脳卒中の影響を受ける領域を拡大します。pMCAO脳卒中の脳を脳卒中後3日目に画像化することにしたのは、脳卒中の影響を受けると予想される最大面積が達成される時期であるためです。しかし,PT脳卒中では脳卒中の冒し組織の最大面積は初日以降に達成されるため,脳卒中施行後1日目にPT脳卒中を画像化することにした。私たちの研究ではこれらの時点を選択しましたが、PAUSATは任意の時点で脳卒中の縦断的モニタリングに使用できます。
まず、Bモードスキャンを取得して、動物の頭の正しい位置を確認し、頭蓋骨と脳の間の空間的限界を特定しました(図4Aおよび図5A)。画像化された脳の最も前方の部分は、基準点として頭蓋骨の前鼻縫合糸を含む。ROI 20 mm (前方から背面) x 17.15 mm (側面) で、左側 (反対側;CL)および右(同側;IL)半球は、脳卒中領域を特定するために以下の研究で定義した。AA画像は、循環するマイクロバブルからの信号をターゲットにすることにより、血管構造に関する情報を提供しました。私たちの結果は、損傷していない脳(ベースライン)では、損傷がない場合に予想されるように、両方の半球が同様の血管分布を示すことを示しています(図4Bおよび図5B)。同様の結果は、2つの異なる波長で得られたPA画像に基づく組織酸素化マップ分布についても観察されます(図4Cおよび図5C)。我々は、脱酸素化ヘモグロビンの局所最大光吸収量(756 nm)と、脱酸素化ヘモグロビンと酸素化ヘモグロビンが等しい光吸収を示す波長(798 nm)に基づいて、2つの異なる波長を評価することにしました20。ヘモグロビンのこれら2つの状態を捉えることで、組織の酸素化を正確に推定することができます(図4Dおよび図5D)。
脳からベースライン画像を取得した翌日、前のセクションで説明したように、動物に対して手術(pMCAOまたはPT脳卒中)を行いました。ストロークの位置とサイズを評価するために、ストローク後の特定の時点で新しい画像セットが取得されました( 図2Aを参照)。pMCAOを受けたマウスから取得したAA画像は、皮質の右側面におけるシグナルの強度の顕著な減少を示しています(図4B)。同じ領域は、PA画像からの組織酸素化マップの減少を示し、虚血領域を示唆している(図4D)。結果を検証するために、脳を採取し、脳卒中動物から画像を取得した直後にTTC染色を行うことにしました。私たちの結果は、脳卒中として特定された領域が、PAUSATおよび確立されたTTC染色による結果と比較した場合に類似していることを示しています(図4B-E)。また、PAUSATは、脳卒中誘発後のより早い時点(1日)に評価された脳卒中の2番目のモデルであるPT脳卒中を使用して、脳内の脳卒中領域を特定できることもここで示します。図 5Bに示すように、皮質の上部で血流供給が減少し、それに伴い酸素飽和度が低下した領域を特定することができました(図5D)。TTC染色から得られた結果は、PAUSATによって以前に同定された脳卒中の位置およびサイズと一致する(図5B−E)。
画像化されるマウスの年齢は、画質に大きく影響します。マウスの頭蓋骨は加齢とともに厚くなり、頭蓋骨は軟部組織に対して音響インピーダンスが大きく異なるため、超音波の大部分が頭蓋骨境界で反射されます。これらの統合イメージングシステムはすべて音響ベースであるため、これは古いマウスのイメージング深度の低下につながります。これは、3つの異なる年齢のマウスが同じ条件下でAAで画像化された 図6で明確に見ることができます。前述のようにイメージング手順に従わない場合でも、同様の低信号結果が予想されます。
PAUSATによる一回拍出量の定量分析
上記の結果で説明したように、PAUSATは、ユーザが記述したROIをターゲットとする一連のコロナ画像をキャプチャする。異なるコロナ画像内の一回拍出面積と画像間の距離を計算することにより、一回拍出量を解析した。PAUSATによって計算された一回拍出量は、TTC染色画像を使用して同様のアプローチに基づいて計算された一回拍出量と比較して統計的な差(p < 0.05)を示していません(図7)。
図3:単三画像の品質に対するワブラー探触子の焦点深度の影響。 複数の焦点深度の画像を取得し、後で組み合わせて、最良の全脳イメージング結果を得ることができます。(A)より深い焦点深度で取得したAA冠状断面。(B)AA冠状断面は、より表面的な焦点深度で取得されました。(C)より深い焦点(緑)とより表面的に焦点を合わせた(マゼンタ)画像を融合した結果。(D)より深い焦点を合わせた画像と、(A)および(B)に匹敵するピクセルスケール値で焦点を合わせた結果。この図は16から変更されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:pMCAO脳卒中前後のマウス脳の代表的なPAUSAT結果 。 (A)ベースラインおよび脳卒中後のBモード超音波冠状画像。(B)ベースラインおよび脳卒中後のAA冠状画像。(C)756 nm励起でのベースラインおよびストローク後のPAコロナ画像。(D)756 nmおよび798 nmの励起画像に基づく酸素飽和度マップ。(e)マウス脳のTTC染色切片、脳卒中の同じ領域を示す。画像下部の線の間の距離は1mmを表しています。この図は16から変更されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:PT脳卒中前後のマウスの代表的なPAUSAT結果 。 (A)ベースラインおよび脳卒中後のBモード超音波冠状画像。(B)ベースラインおよび脳卒中後のAA冠状画像。(C)756 nm励起でのベースラインおよびストローク後のPAコロナ画像。(D)756 nmおよび798 nmの励起画像に基づく酸素飽和度マップ。(e)マウス脳のTTC染色切片、脳卒中の同じ領域を示す。画像下部の線の間の距離は1mmを表しています。この図は16から変更されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:AA画像の品質に対するマウスの年齢の影響。 この図は、異なる年齢の動物を同等の条件下でイメージングした場合のAA信号強度とイメージング深度の違いを示しています。図に見られるように、年配のマウス(18か月)のイメージングでは、若いマウス(1.5か月)と比較して頭蓋骨のサイズと厚さのために低品質の画像が生成されますが、成体マウスは中間の信号を示します(6か月)。頭蓋骨と脳組織の間の音響インピーダンスの不整合が大きいため、頭蓋骨を伝播する超音波は反射および屈折し、信号損失および分解能低下を招く。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:虚血性脳卒中の体積の分析。 (A)PT脳卒中からのTTC切片と、対応するTTCセグメント化画像、AA画像、および同等の冠状位置でのAAセグメント画像の例。(B)pMCAOおよびPT脳卒中のTTCおよびAA画像に基づいて計算された一回拍出量で、有意差は認められなかった(p > 0.05)。グラフは平均±標準偏差(SD)を示しています。(n = 1群3匹)。この図は16から変更されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この方法には、誤って行うと画質と定量分析が大幅に低下する可能性のある重要な側面がいくつかあります。PAUSAT画像でユーザーエラーが発生する最も一般的な結果は、信号の欠如または非常に低い信号強度のいずれかであり、どちらもさまざまな理由で発生する可能性があります。そのような理由の1つは、音響結合の問題です。イメージング中にマウスの頭部を囲む水中の大きな気泡は、超音波がトランスデューサに出入りするのを妨げることが多く、システムの3つのモダリティすべてで結果の画像に影の領域が発生します。これは、システムメンブレンとイメージングするサンプルの間に十分な水が存在することを確認することで防ぐことができます。また、AA信号が不足しているが、使用する波長に関係なく、驚くほど高いPA信号が発生する可能性もあります。これは、光の吸収を妨げる髪、特に黒い髪の存在が原因である可能性があります。これを避けるためには、髪の毛が視覚的に識別できなくなるまで、動物の頭を以前に剃っている必要があります。
AA画像に関して、起こり得る、または非常に低いシグナルの欠如につながるであろう別の問題は、循環系に存在する低濃度のマイクロバブルである。マイクロバブルが希釈されすぎたり、不適切に注入されたりすると、結果として生じる信号は非常に弱くなります。逆軌道注入は、十分に訓練された要員によってのみ行われなければなりません。別の理由は、マイクロバブル注入からイメージングの開始までの時間が長いことであり、血流中のマイクロバブルの減少につながる可能性があります。これを避けるために、マイクロバブルを注入する前にイメージング用のシステムを準備して、注射直後に動物をPAUSATシステムメンブレンに移すことができるようにすることをお勧めします。動物がすでにPAUSATシステムメンブレンに配置されている場合は、代替の静脈内経路(尾静脈注射など)も使用でき、注射からイメージングまでの時間を短縮できることは言及する価値があります。さらに、可能な限りマイクロバブルの最大濃度を維持するために、PAイメージングの前にAAイメージングを行うことも推奨されます。
必要な手順が適切に実行されない場合も、PA信号が影響を受ける可能性があります。問題の1つは、励起レーザーの品質に関するものです。レーザー光源を記述する2つの主要なコンポーネントは、パルスエネルギーと波長です。独立したパワーメーターと分光計を使用してこれらの量を測定し、目的の値に設定されていることを確認することを強くお勧めします。誤った値が想定されると、関数計算によって誤解を招く結果になります。
また、AA画像とPA画像を組み合わせると、位置がずれる可能性もあります。この主な理由は、探触子間で確立された座標が正確ではなかったことです。これを防ぐには、事前にファントムグリッドを使用して必要な実験を実行し、AA画像とPA画像の同時登録を成功させるための正確な座標を決定することが重要です。不正確さの別の潜在的な原因は、OPOの不適切なキャリブレーションによるものです。これを軽減するには、独立した分光器を使用してOPOを正しく校正する必要があります。
特にこの統合システムのPATコンポーネントの画質に関しては、改善の余地があります。現在のPATシステムは、スキャニングリニアアレイ構成に基づいています。いくつかの脳卒中マウスモデルを用いて、梗塞と脳の健常領域の酸素化の大きな違いを観察することができますが、詳細な血管系(微小血管)は見ることができません。この低画質に寄与する2つの主な問題があります。1つ目は、限定的な視野の問題です。PATでサンプルの全視野再構成画像を作成するには、検出器が物体を完全に囲む(または4πの立体角を持つ)必要があります。しかし、実験の設定では、これは困難です。これは、限られた視野の問題を生じさせ、トランスデューサアレイに直交する血管を生じさせ、検出不能である21。リニアアレイPATにおける限定視野問題の影響を低減する解決策は存在するが、その中で最も有望なものは、仮想点光源22としてのマイクロバブルの使用である。リニアアレイPATの2番目の問題は、音響レンズの焦点が弱いため、仰角分解能と感度が低いことです。しかし、リニアアレイシステムのハードウェア設計にシングルスリット回折を使用すると、リニアアレイPAT23,24の等方分解能と感度が得られることが示されています。ディープラーニングアプローチは、線形アレイPAT25、26、27の限られた視野の問題と低い標高分解能の両方を部分的に解決することも示されています。これらのソリューションを組み合わせることで、当社の統合イメージングシステムのPATコンポーネントの画質が大幅に向上します。
ここでは、前臨床環境における虚血性脳卒中の構造的および機能的定量化のための新しい非侵襲的マルチモーダルイメージング法を提示しました。AAにより、マウス脳内の血管の明確な形態と灌流マッピングが可能です。局所的に定義されたシグナルの欠如は、血液灌流が減少している梗塞領域を示すことができ、非侵襲的および縦断的に梗塞体積を推定することを可能にする。PATを介して、ヘモグロビンの酸素飽和度は、脳卒中領域の内外で測定することができ、梗塞領域の脳組織の低酸素状態を示すことができます。この全脳イメージング方法は、小動物MRIなどのいくつかの代替手段と比較して低コストです。さらに、他の前臨床イメージングデバイスでは達成できない深部組織の機能情報と構造情報の組み合わせが可能になります。組織学的分析と比較して、この方法は、単一のエンドポイントではなく、縦断的および複数の時点でこれらのメトリックを測定することを可能にします。そうする能力は、虚血性脳卒中の前臨床試験において前例のない定量的詳細を提供するであろう。さらに、このシステムの構造的および機能的イメージング機能は、虚血性脳卒中28を超えた多くの前臨床試験に適用できます。PAUSATを使用すると、血管系に影響を与える疾患状態や生物学的現象を詳細に研究できるため、他の多くの前臨床分野(癌など)に変換可能な強力な前臨床イメージングツールになります。
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Disclosures
著者は、この作品に利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
著者は、SonoVol Inc.のエンジニアリングチームの技術サポートに感謝したいと思います。この研究は、米国心臓協会の共同科学賞(18CSA34080277)によって部分的に後援され、J.ヤオとW.ヤンに贈られました。米国国立衛生研究所(NIH)は、R21EB027981、R21 EB027304、RF1 NS115581(BRAINイニシアチブ)、R01 NS111039、R01 EB028143を助成します。米国国立科学財団(NSF)キャリア賞2144788;チャンザッカーバーグイニシアチブ助成金(2020-226178)、J.ヤオへ。NIHはW.ヤンにR21NS127163とR01NS099590を付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 GA catheter | BD Insyte Autoguard Winged | 381534 | For mouse intubation |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 | Necessary for TTC-staining brain for validation |
| 532nm Laser | Quantel | Q-smart 850 | Laser used to pump the OPO for PAT |
| Automatic Ventilator Rovent Jr. | Kent Scientific | RV-JR | To keep mice under anesthesia during surgical procedure |
| Black braided silk 4-0 USP | Surgical Specialties | SP116 | Used for sutures on the neck for pMCAO surgery |
| Bupivacaine | Hospira | 0409-1159-18 | Used prior to closing wounds during surgical procedure |
| C57BL/6 Mice | Jackson Lab | #000664 | Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female) |
| Clear suture | Ethicon | 8606 | Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT |
| Cold Light LED | Schott | KL 1600 | Needed to create PT stroke |
| Disposable Razor Blade | Accutec Blades | 74-0002 | For sectioning mouse brain |
| Electric drill | JSDA | JD-700 | Used to expose MCA during pMCAO procedure |
| Electrocauterization tool | Wet-Field | Wet-Field Bipolar-RG | Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure |
| Hair removal gel | Veet | 8282651 | Used to remove hair from mouse prior to imaging |
| High Temperature Cautery Loop Tip | BOVIE Medical Corporation | REF AA03 | Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull |
| IR Detector Card | Thorlabs | VRC5 | Used to ensure light path is aligned |
| Laser Power Meter | Ophir | StarBright, P/N 7Z01580 | Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging |
| Laser Speckle Imaging System | RWD Life Science Co. | RFLSI-III | Can be used to validate stroke surgery success |
| Lubricant Eye Ointment | Soothe | AB31336 | Can be used to avoid drying of the eyes |
| Manually adjustable stage | Thorlabs | L490 | Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging |
| Modified Vega Imaging System | Perkin Elmer | LLA00061 | System containing both B-mode/AA and PAT transducers |
| Optical Parametric Oscillator | Quantel | versaScan-L532 | Allows for tuning of excitation wavelength in a large range |
| Programmable Ultrasound System | Verasonics | Vantage 256 | Used for PAT part of system |
| Rose Bengal | Sigma | 330000 | Necessary to induce PT stroke |
| Suture | LOOK | SP116 | Used for permanent ligation of CCA |
| Temperature Contoller | Physitemp | TCAT-2 | Used to maintain stable body temperature of mice during procedures |
| VesselVue Microbubbles | Perkin Elmer | P-4007001 | Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL) |
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