Integrierte photoakustische, Ultraschall- und Angiographietomographie (PAUSAT) für die nicht-invasive Ganzhirnbildgebung des ischämischen Schlaganfalls

Summary

Diese Arbeit demonstriert den Einsatz einer multimodalen ultraschallbasierten Bildgebungsplattform für die nicht-invasive Bildgebung des ischämischen Schlaganfalls. Dieses System ermöglicht die Quantifizierung der Sauerstoffsättigung des Blutes durch photoakustische Bildgebung und die Beeinträchtigung der Durchblutung im Gehirn durch akustische Angiographie.

Abstract

Hier wird eine experimentelle ischämische Schlaganfallstudie vorgestellt, bei der unser neu entwickeltes nicht-invasives Bildgebungssystem verwendet wird, das drei akustische Bildgebungstechnologien integriert: photoakustische Bildgebung, Ultraschall und angiographische Tomographie (PAUSAT). Die Kombination dieser drei Modalitäten hilft bei der multispektralen photoakustischen Tomographie (PAT) der Sauerstoffversorgung des Gehirns, der Hochfrequenz-Ultraschallbildgebung des Hirngewebes und der akustischen Angiographie der zerebralen Blutdurchblutung. Die multimodale Bildgebungsplattform ermöglicht die Untersuchung von Veränderungen der zerebralen Perfusion und Sauerstoffversorgung im gesamten Mäusegehirn nach einem Schlaganfall. Es wurden zwei häufig verwendete ischämische Schlaganfallmodelle evaluiert: das Modell des permanenten Verschlusses der mittleren Hirnarterie (pMCAO) und das Modell der Photothrombose (PT). PAUSAT wurde verwendet, um die gleichen Mäusegehirne vor und nach einem Schlaganfall abzubilden und beide Schlaganfallmodelle quantitativ zu analysieren. Dieses bildgebende System war in der Lage, die Gefäßveränderungen des Gehirns nach ischämischem Schlaganfall deutlich darzustellen, einschließlich einer signifikant reduzierten Durchblutung und Sauerstoffversorgung in der Schlaganfall-Infarktregion (ipsilateral) im Vergleich zum unverletzten Gewebe (kontralateral). Die Ergebnisse wurden sowohl durch Laser-Speckle-Kontrast-Imaging als auch durch Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung bestätigt. Des Weiteren wurde das Schlaganfall-Infarktvolumen in beiden Schlaganfallmodellen gemessen und mittels TTC-Färbung als Ground Truth validiert. Durch diese Studie haben wir gezeigt, dass PAUSAT ein leistungsfähiges Werkzeug in nicht-invasiven und longitudinalen präklinischen Studien zum ischämischen Schlaganfall sein kann.

Introduction

Das Blut transportiert Sauerstoff (über das Hämoglobin-Protein) und andere wichtige Nährstoffe in das Gewebe unseres Körpers. Wenn der Blutfluss durch das Gewebe unterbrochen ist (Ischämie), kann es zu schweren Gewebeschäden kommen, deren unmittelbarste Auswirkungen auf Sauerstoffmangel (Hypoxie) zurückzuführen sind. Ein ischämischer Schlaganfall ist das Ergebnis einer unterbrochenen Durchblutung einer bestimmten Region des Gehirns. Die Hirnschädigung infolge eines ischämischen Schlaganfalls kann innerhalb von Minuten nach einem Gefäßverschluss auftreten und oft schwächende und dauerhafte Auswirkungen haben ^1,2. Eine sehr wertvolle Strategie, um die Physiopathologie nach einem ischämischen Schlaganfall zu bewerten und neue Behandlungen zu identifizieren und zu testen, ist die Verwendung von Kleintiermodellen im Labor. Die im Labor entdeckten Behandlungen sollen in die klinische Anwendung überführt werden und das Leben der Patienten verbessern. Die Verwendung von Tieren in der biomedizinischen Forschung muss jedoch sorgfältig nach den 3R-Prinzipien von Russell und Burch bewertet werden: Ersatz, Reduktion und Verfeinerung³. Ziel der Reduktionskomponente ist es, die Anzahl der Tiere zu reduzieren, ohne die Datenerhebung zu beeinträchtigen. Vor diesem Hintergrund bietet die Möglichkeit, die Läsionsentwicklung mittels nicht-invasiver Bildgebung longitudinal zu bewerten, einen großen Vorteil bei der Reduzierung der Anzahl der benötigten Tiere sowie bei der Maximierung der von jedem Tier erhaltenen Informationen⁴.

Die Photoakustische Tomographie (PAT) ist ein hybrides Bildgebungsverfahren, das optischen Absorptionskontrast mit räumlicher Auflösung der Ultraschallbildgebung kombiniert⁵. Der Bildgebungsmechanismus von PAT ist wie folgt. Ein Anregungslaserpuls wird auf das abgebildete Ziel gerichtet. Unter der Annahme, dass das Target Licht mit der Wellenlänge des Anregungslasers absorbiert, steigt die Temperatur an. Dieser schnelle Temperaturanstieg führt zu einer thermoelastischen Ausdehnung des Targets. Die Ausdehnung bewirkt, dass sich eine Ultraschallwelle vom Ziel ausbreitet. Durch die Detektion der Ultraschallwelle an vielen Positionen kann die Zeit, die die Welle benötigt, um sich vom Ziel zu den Detektoren auszubreiten, genutzt werden, um durch einen Rekonstruktionsalgorithmus ein Bild zu erstellen. Die Fähigkeit des PAT, die optische Absorption in tiefen Geweberegionen zu erkennen, unterscheidet PAT von der Ultraschallbildgebung, die die Grenzen unterschiedlicher akustischer Impedanzen von Geweben erkennt⁵. Im sichtbaren und nahen Infrarotspektrum sind die primären hochabsorbierenden Biomoleküle, die in Organismen reichlich vorhanden sind, Hämoglobin, Lipide, Melanin und Wasser⁷. Von besonderem Interesse bei der Erforschung des Schlaganfalls ist das Hämoglobin. Da Oxyhämoglobin und Desoxyhämoglobin unterschiedliche optische Absorptionsspektren aufweisen, kann PAT mit mehreren Anregungslaserwellenlängen verwendet werden, um die relative Konzentration der beiden Zustände des Proteins zu bestimmen. Dadurch kann die Sauerstoffsättigung des Hämoglobins (sO₂) oder die Sauerstoffsättigung des Blutes innerhalb und außerhalb der Infarktregion quantifiziert werden ^8,9. Dies ist ein wichtiges Maß bei ischämischem Schlaganfall, da es den Sauerstoffgehalt im geschädigten Hirngewebe nach einer Ischämie anzeigen kann.

Die Akustische Angiographie (AA) ist ein kontrastmittelverstärktes Ultraschall-Bildgebungsverfahren, das besonders für die Darstellung der Morphologie der Gefäße in vivo geeignet ist ¹⁰. Die Methode beruht auf der Verwendung eines Zwei-Element-Wobbler-Schallkopfs (ein Niederfrequenzelement und ein Hochfrequenzelement) in Verbindung mit Mikrobläschen, die in das Kreislaufsystem des Bildgebenden injiziert werden. Das Niederfrequenzelement des Wandlers wird zum Senden mit der Resonanzfrequenz der Mikrobläschen (z. B. 2 MHz) verwendet, während das Hochfrequenzelement zum Empfang der superharmonischen Signale der Mikrobläschen (z. B. 26 MHz) verwendet wird. Wenn die Mikrobläschen mit einer Resonanzfrequenz angeregt werden, haben sie eine starke nichtlineare Reaktion, was zur Erzeugung von superharmonischen Signalen führt, die das umgebende Körpergewebe nicht erzeugt¹¹. Durch den Empfang mit einem Hochfrequenzelement wird sichergestellt, dass nur die Mikroblasensignale detektiert werden. Da die Mikrobläschen auf die Blutgefäße beschränkt sind, entsteht ein angiographisches Bild der Morphologie der Blutgefäße. AA ist eine leistungsstarke Methode zur Darstellung eines ischämischen Schlaganfalls, da die Mikrobläschen, die durch das Kreislaufsystem fließen, nicht durch verstopfte Gefäße fließen können. Auf diese Weise kann AA Regionen des Gehirns erkennen, die aufgrund eines ischämischen Schlaganfalls nicht durchblutet sind, was auf die Infarktregion hinweist.

Die präklinische ischämische Schlaganfallforschung stützt sich in der Regel auf den Einsatz von Histologie und Verhaltenstests, um die Lokalisation und den Schweregrad des Schlaganfalls zu beurteilen. Die Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung ist eine gängige histologische Analyse, die zur Bestimmung des Schlaganfall-Infarktvolumens verwendet wird. Es kann jedoch nur an einem Endpunkt verwendet werden, da das Tier eingeschläfert werden muss¹². Verhaltenstests können verwendet werden, um eine Beeinträchtigung der motorischen Funktion zu mehreren Zeitpunkten zu bestimmen, aber sie können keine quantitativen anatomischen oder physiologischen Werte liefern¹³. Die biomedizinische Bildgebung bietet einen eher quantitativen Ansatz, um die Auswirkungen eines ischämischen Schlaganfalls nichtinvasiv und longitudinal zu untersuchen 9,14,15. Bestehende bildgebende Verfahren (z. B. Magnetresonanztomographie [MRT]) bei Kleintieren können jedoch mit hohen Kosten verbunden sein, nicht in der Lage sein, gleichzeitig strukturelle und funktionelle Informationen zu liefern, oder eine begrenzte Eindringtiefe aufweisen (wie die meisten optischen Bildgebungsverfahren).

Hier kombinieren wir photoakustische, Ultraschall- und angiographische Tomographie (PAUSAT; siehe Systemdiagramm in Abbildung 1), was komplementäre strukturelle und funktionelle Informationen über die Durchblutung und Oxygenierung nach ischämischem Schlaganfall ermöglicht¹⁶. Dies sind zwei wichtige Aspekte bei der Beurteilung des Schweregrads der Verletzung und der Überwachung der Genesung oder des Ansprechens auf Behandlungen. Durch den Einsatz dieser integrierten Bildgebungsverfahren kann die Menge an Informationen, die von jedem Tier gewonnen werden, erhöht werden, wodurch die Anzahl der benötigten Tiere verringert wird und mehr Informationen über die Untersuchung potenzieller Behandlungen für ischämische Schlaganfälle bereitgestellt werden.

Abbildung 1: PAUSAT-Diagramm . (A) Vollständiger Schaltplan des PAUSAT-Systems, einschließlich des Lasers und des OPO, die für PAT verwendet werden. (B) Innenansicht des PAUSAT-Systems, einschließlich zweier Ultraschallwandler. Der Dual-Element-Wobbler-Schallkopf wird sowohl für B-Mode-Ultraschall als auch für AA verwendet, und der Linear-Array-Schallkopf wird für PAT verwendet. Beide Wandler sind auf demselben motorisierten 2D-Tisch montiert, was eine Abtastung zur Erzeugung volumetrischer Daten ermöglicht. Diese Zahl wurde von¹⁶ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Protocol

Alle tierexperimentellen Verfahren wurden vom Tierpflege- und -verwendungsausschuss des Duke University Medical Center genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des öffentlichen Gesundheitsdienstes der Vereinigten Staaten zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Für diese Studien wurden männliche und weibliche C57BL/6J-Mäuse (siehe Materialtabelle) verwendet. Pro Schlaganfall-Modellgruppe wurden mindestens drei Tiere abgebildet. In Abbildung 2 sehen Sie den Workflow, der in diesem Protokoll befolgt wird.

Abbildung 2: Zusammenfassung des experimentellen Vorgehens für die PAUSAT-Bildgebung bei Schlaganfall. Erstellt mit Biorender.com. Die Abbildung zeigt den Workflow des bildgebenden Verfahrens ausgehend von (A) den beiden Hauptschlaganfallmodellen (pMCAO und PT-Schlaganfall). (B) Vor der Positionierung des Tieres auf der PAUSAT-Membran muss eine retroorbitale Injektion der Mikrobläschen durchgeführt werden. (C) Eine Maske, die eine kontinuierliche Anästhesie ermöglicht, und ein Heizkissen, um die Körpertemperatur des Tieres stabil zu halten, sind in diesem Setup erforderlich. Der Körper des Tieres wird auf das Heizkissen gelegt, während der Kopf auf der Membran des Systems ruht. (D) Die Reihenfolge der Bildaufnahme ist ebenfalls in der Abbildung dargestellt. (E) Die TTC-Färbung wird durchgeführt, um unsere Ergebnisse in dieser Studie zu validieren. DPI: Tage nach der Verletzung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

1. Induktion des Schlaganfall-Mausmodells

1. Permanenter Verschluss der mittleren Hirnarterie (pMCAO) mit Ligatur der Arteria carotis communis (CCA).
   HINWEIS: Führen Sie kurz eine dauerhafte Ligatur der rechten CCA und eine posteriore Elektrokauterisation der rechten mittleren Hirnarterie (MCA) ^durch17. Dieses Verfahren schränkt den zerebralen Blutfluss in der rechten Hirnrinde ein und verursacht einen ischämischen Schlaganfall¹⁸.
   1. In einer Induktionskammer wird eine Anästhesie mit einer Inhalationsmischung aus 5,0 % Isofluran in 30 % O2/70 %_N2 bis zur Bewusstlosigkeit eingeleitet (erkannt als Verlust des Pedalreflexes).
   2. Intubieren Sie das Tier mit einem 20-G-Katheter (Materialtabelle) und schließen Sie es an ein automatisches Beatmungsgerät an. Stellen Sie die Durchflussrate basierend auf dem Körpergewicht des Tieres ein und halten Sie das Tier mit 1,5 % bis 2,0 % Isofluran in 30 % O 2 / 70 % N₂ betäubt.
   3. Halten Sie mit einer Heizlampe und einer Rektalsonde, die an einen Temperaturregler angeschlossen ist, die Körpertemperatur des Tieres bei 37 °C.
   4. Geben Sie einen Tropfen Gleitmittel-Augensalbe auf die Augen der Maus.
   5. Legen Sie das Tier in Rückenlage und entfernen Sie die Haare mit einem Haarschneider aus dem Nackenbereich.
   6. Reinigen Sie die Hautpartie, indem Sie zuerst ein Wattestäbchen mit Povidon-Jod und dann ein steriles Pad mit 70%igem Ethanol verwenden. Führen Sie dies dreimal durch.
   7. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie und die Abwesenheit von Schmerzen, indem Sie die hintere Pfote des Tieres leicht einklemmen.
   8. Machen Sie einen 0,8 cm langen sagittalen Schnitt an der Mittellinie des Halses und legen Sie die rechte CCA frei.
   9. Bereiten Sie eine Naht für die CCA-Ligatur vor, indem Sie eine 4-0-Seidennaht in dünnere Fäden dissoziieren, die den Hauptfaden bilden. Verwenden Sie eine Länge von 1,5 cm eines der Unterfäden, um den CCA dauerhaft zu ligieren.
      Anmerkungen: Entfernen Sie nach dem Festziehen des Knotens überschüssigen Faden, indem Sie die Verlängerung in einem Abstand von 1-2 mm zum Knoten abschneiden.
   10. Tragen Sie einen Tropfen Bupivacain auf, bevor Sie die Wunde schließen.
   11. Schließen Sie den Schnitt mit unterbrochenen chirurgischen 4-0-Seidennähten und tragen Sie eine dreifache antibiotische Salbe auf die Oberfläche auf, um Infektionen zu vermeiden.
   12. Bewegen Sie die Maus, um die rechte seitliche Seite des Körpers des Tieres freizulegen.
   13. Entfernen Sie die Haare im Bereich zwischen Ohr und Augenpartie mit einem Haarschneider.
   14. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit einem Wattestäbchen mit Povidon-Jod, gefolgt von einem sterilen Pad mit 70% Ethanol. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
   15. Legen Sie ein steriles Tuch an, um den Operationsbereich zu sichern. Machen Sie dann einen 0,5 cm langen Schnitt zwischen dem rechten Auge und dem Ohr des Tieres, wodurch das Gelenk zwischen Schädel und Schläfenmuskel freigelegt wird.
   16. Kauterisieren Sie den Muskel mit einer Kauteröse, um ihn vom Schädel zu trennen und den Bereich der MCA freizulegen.
   17. Bohren Sie ein 0,2 mm² Fenster, um die MCA mit einer elektrischen Bohrmaschine freizulegen, und verwenden Sie Elektrokauter auf der MCA, um den Blutfluss zu verschließen.
       Anmerkungen: Ein einzelner Impuls mit 80 % Leistungsintensität reicht aus, um den MCA zu verätzen.
   18. Tragen Sie mit einer 1-ml-Spritze, die an einer 27G-Nadel befestigt ist, einen Tropfen Bupivacain (Materialtabelle) auf die Operationsstelle auf.
   19. Schließen Sie den Hautschnitt mit unterbrochenen 6-0 durchsichtigen monofilen Nähten und tragen Sie eine dreifache antibiotische Salbe auf die Oberfläche auf, um Infektionen zu vermeiden.
   20. Bringen Sie das Tier nach Abschluss der Operation in einen Inkubator mit kontrollierter Temperatur (32 °C) und lassen Sie das Tier sich erholen.
   21. Setzen Sie das Tier nach 2 Stunden in seinen Heimatkäfig um und stellen Sie Futter und Wasser nach Belieben zur Verfügung.
2. Photothrombotischer Schlaganfall (PT-Schlaganfall)
   HINWEIS: Kurz gesagt, der PT-Schlaganfall wird durch Beleuchten von Rose Bengal in den Gefäßen im Gehirn durchgeführt. Rose Bengal wird intraperitoneal verabreicht und sobald es gut im Körper verteilt ist (5 min), wird es von einem grünen, kalten Licht beleuchtet, das die Rose Bengal aktiviert, um reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu erzeugen. Diese ROS schädigen die Membran der Endothelzellen, erzeugen Thromben im gesamten beleuchteten Bereich und führen zu einer lokalen Störung des zerebralen Blutflusses¹⁹.
   1. In einer Induktionskammer wird eine Anästhesie mit einer Inhalationsmischung aus 5,0 % Isofluran in 30 % O2/70 %_N2 bis zur Bewusstlosigkeit eingeleitet (erkannt als Verlust des Pedalreflexes).
   2. Setzen Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen und halten Sie das Tier mit einer Maske und 1,5%-2,0% Isofluran in 30% O2/70%_N2 betäubt.
   3. Halten Sie das Tier bei 37 °C, indem Sie eine Heißwasser-Umluftheizung und eine Rektalsonde verwenden, um die Körpertemperatur des Tieres zu messen.
   4. Geben Sie einen Tropfen Gleitmittel-Augensalbe auf die Augen der Maus.
   5. Rasiere den Kopf des Tieres mit einem Haarschneider.
   6. Reinigen Sie die rasierte Kopfhaut dreimal, zuerst mit einem Wattestäbchen mit Povidon-Jod und dann mit einem sterilen Pad mit 70%igem Ethanol.
   7. Stellen Sie sicher, dass keine Schmerzen auftreten, indem Sie die hintere Pfote des Tieres leicht einklemmen.
   8. Machen Sie mit einem Skalpell einen 1,4 cm langen sagittalen Schnitt an der Mittellinie der Kopfhaut und legen Sie den Schädel frei.
   9. Markieren Sie mit einem spitzen Bleistift 1,5 mm von der Bregma zur rechten Seite.
   10. Platzieren Sie ein kreisförmiges Loch mit einem Durchmesser von 2,5 mm mittig auf der 1,5-mm-Markierung.
       Anmerkungen: Ein Quadrat mit einer kreisförmigen Lochblende kann mit doppelseitigem schwarzem Klebeband und einer Öffnung mit einem Durchmesser von 2,5 mm in der Mitte mit einem Einlochlochwerkzeug der genannten Größe hergestellt werden.
   11. Platzieren Sie das grüne, kalte Licht auf der kreisförmigen Lochblende und halten Sie den Abstand zwischen der Lampe und der Lochblende auf ein Minimum.
   12. Decken Sie den Bereich mit Alufolie ab, um eine Ausbreitung des Lichts zu vermeiden.
   13. Sobald das Setup fertig ist, injizieren Sie dem Tier intraperitoneal 10 mg/kg Rose Bengal (10 mg/ml in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung [PBS]) und warten Sie 5 Minuten.
   14. Schalten Sie nach 5 Minuten die Kaltlichtquelle ein (Intensität: 4,25) und halten Sie die Belichtung 15 Minuten lang aufrecht.
   15. Schalten Sie als Nächstes das kalte Licht aus und überprüfen Sie den Strich entweder mit bloßem Auge (der Bereich ist voraussichtlich weißer als der umgebende Bereich) oder mit externen Geräten zur Messung des zerebralen Blutflusses (z. B. mit Laser-Speckle-Kontrastbildgebung (Materialtabelle; siehe Schritt 5.1).
   16. Tragen Sie mit einer 1-ml-Spritze, die an einer 27G-Nadel befestigt ist, einen Tropfen Bupivacain (Materialtabelle) auf die Operationsstelle auf.
   17. Schließen Sie den Hautschnitt mit unterbrochenen 6-0 durchsichtigen monofilen Nähten und tragen Sie eine dreifache antibiotische Salbe auf die Oberfläche auf, um eine Infektion zu verhindern.
   18. Bringen Sie das Tier nach Abschluss der Operation in einen Inkubator mit kontrollierter Temperatur (32 °C) und lassen Sie das Tier sich erholen.
   19. Setzen Sie das Tier nach 2 Stunden in seinen Heimatkäfig um und stellen Sie Futter und Wasser nach Belieben zur Verfügung.

2. PAUSAT für die Bildgebung vorbereiten

1. Schalten Sie den 532-nm-Laser ein und lassen Sie ihn 15 Minuten zum Aufwärmen eingeschaltet.
2. Bereiten Sie die Bildgebungsplattform für das anästhesierte Tier vor.
   1. Platzieren Sie eine angepasste Rampe (Abbildung 2C), die an der manuell verstellbaren Bühne (Materialtabelle) befestigt ist, neben der Bildgebungsmembran.
   2. Befestigen Sie einen Mauszahnhalter mit dem Beatmungsschlauch, der mit der kundenspezifischen Rampe verbunden ist, und befestigen Sie ein Heizkissen auf der Oberfläche der Rampe.
3. Nachdem sich der Laser erwärmt hat, überprüfen Sie mit einer Nahinfrarot-Detektorkarte (Materialtabelle), ob der Laserweg und die Einkopplung in das Faserbündel gut ausgerichtet sind, indem Sie die Karte vor den Faserbündeleingang legen und sicherstellen, dass das Laserlicht in das Bündel eintritt.
   Anmerkungen: Stellen Sie alle Laserpfadspiegel nach Bedarf ein, um sicherzustellen, dass der Lasereingang mit dem Faserbündeleingang zentriert ist.

3. Vorbereitung des Tieres auf PAUSAT

HINWEIS: PAUSAT wird 1 Tag nach der PT-Schlaganfalloperation oder 3 Tage nach der pMCAO-Operation durchgeführt. Die Vorbereitung von PAUSAT für die Bildgebung (Schritt 2) dauert ca. 20 Minuten und sollte unmittelbar vor der Vorbereitung des Tieres auf PAUSAT erfolgen.

1. Die Anästhesie wird in einer Induktionskammer mit einer Inhalationsmischung aus 5 % Isofluran gemischt mit 30 % O2/70 %_N2 bis zur Bewusstlosigkeit eingeleitet (erkannt als Verlust des Pedalreflexes).
2. Übertragen Sie das Tier auf eine beheizte Plattform mit einem Zahnhalter und einer Maske und halten Sie die Anästhesie bei 1,5 % bis 2,0 % Isofluran in 30 % O 2 / 70 % N_2.
3. Verwenden Sie eine Heizlampe und eine Rektalsonde, die an einen Temperaturregler angeschlossen ist, um die Körpertemperatur des Tieres auf 37 °C zu halten.
4. Schneiden Sie die Haare auf dem Kopf des Tieres mit einem Elektrorasierer ab. Beziehen Sie den Bereich von der Nähe der Augen bis hinter die Ohren ein.
5. Rasieren Sie die Haare auf dem Kopf des Tieres, indem Sie eine handelsübliche Haarentfernungscreme auftragen, um die verbleibenden kurzen Haare vollständig zu entfernen. 5-6 Minuten auf der Haut einwirken lassen, dann mit einem in Wasser getupften Wattestäbchen abwischen, um die Creme vollständig zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Haut frei von Haaren ist.
   HINWEIS: Für die Bildgebung 1 Tag nach der Operation können diese Schritte vor Beginn der Operation durchgeführt werden. 1 Tag nach dem PT-Schlaganfall können sie weggelassen werden. Wenn die PAUSAT-Bildaufnahme einige Tage nach der Operation durchgeführt wird, ist dieser Schritt unbedingt erforderlich.
6. Sobald das Tier und das System für die Bildgebung bereit sind und unmittelbar vor dem Transfer des Tieres auf die Plattform des Systems, wird eine 100-μl-Lösung von Mikrobläschen in der Stammkonzentration (Materialtabelle) retroorbital mit einer 27-G-Nadel injiziert.
   HINWEIS: Sobald die Bläschen im Blutkreislauf zirkulieren, bleibt nur eine begrenzte Zeit für die Aufnahme ohne nennenswerten Signalverlust (~10 min).
7. Geben Sie einen Tropfen Augenschutzlotion auf die Augen der Maus.
   Anmerkungen: Es wird nicht empfohlen, Augengleitmittel aufzutragen, bis die retroorbitale Injektion durchgeführt wurde, um zu vermeiden, dass Fremdstoffe in den Blutkreislauf des Tieres gelangen. Daher muss das Auftragen der Haarentfernungscreme langsam und vorsichtig durchgeführt werden, um zu vermeiden, dass man den Augen zu nahe kommt (aber genug, um die interessierende Region freizulegen, in der der Schlaganfall erwartet wird). Die Entfernung der Haarcreme erfolgt mit einem Wattestäbchen, das zuvor in Wasser getupft wurde, um zu verhindern, dass die Creme tropft, was die Augen schädigen kann.

4. PAUSAT-Bildgebung

HINWEIS: Dies geschieht, um die kontra- und ipsi-lateralen Regionen des Gehirns nach einem Schlaganfall darzustellen

1. Übertragen Sie die Maus auf die integrierte PAUSAT-Bildplattform (Table of Materials) und platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf der benutzerdefinierten Rampe (Abbildung 2C).
2. Füllen Sie das Bildgebungsfenster mit ausreichend destilliertem Wasser auf der Oberfläche, um eine akustische Kopplung zu ermöglichen.
   HINWEIS: Eine optionale Rampe, die mit einem 3D-Drucker gedruckt wird, wird empfohlen, um zu verhindern, dass der Körper des Tieres während der Bildaufnahme nass wird, und um den Komfort des Tieres zu verbessern. Es hilft auch, eine stabile Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus kann die Rampe an einem manuellen Tisch (Materialtabelle) befestigt werden, um die Fokustiefe des Dual-Element-Wobbler-Wandlers relativ zum Mauskopf einzustellen. Die benutzerdefinierte Rampenentwurfsdatei steht den Autoren auf Anfrage zur Verfügung.
3. Befestigen Sie den Mauskopf im Zahnhalter und sorgen Sie für eine ordnungsgemäße Anästhesie und Luftzirkulation.
4. Halten Sie mit einer Heizlampe und einer Rektalsonde, die an einen Temperaturregler angeschlossen ist, die Körpertemperatur des Tieres bei 37 °C.
5. Öffnen Sie die Bildgebungsanwendung (Materialtabelle) und navigieren Sie zu B-Mode-Ultraschall.
6. Verwenden Sie das Live-Ultraschallfenster, um den Mauskopf manuell in die gewünschte Position zu bringen.
7. Verwenden Sie das Live-Ultraschallfenster, um die Höhe des Tisches so einzustellen, dass die Brenntiefe des Schallkopfs (19 mm) ungefähr in der Mitte des abzubildenden Bereichs liegt.
8. Bildgebung mit B-Mode-Ultraschall
   1. Stellen Sie den Wert der Ultraschallsendefrequenz im B-Modus ein (verwenden Sie für diese Studien 16 MHz).
   2. Geben Sie die Informationen zum Speicherverzeichnis in die Imaging-Anwendung ein.
   3. Verwenden Sie das schwebende Feld, um die gewünschte Region für den B-Mode-Scan des Gehirns auszuwählen.
   4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Statisch erfassen .
   5. Überprüfen Sie die Ergebnisse des Scans in der Anwendung, sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, um sicherzustellen, dass der gewünschte Bereich abgebildet wurde.
      HINWEIS: Vermeiden Sie unnötige Verzögerungen bei der Aufnahme von B-Mode-Bildgebung, um sicherzustellen, dass eine ausreichend hohe Konzentration von Mikrobläschen im Blutkreislauf für die AA verbleibt.
9. Bildgebung mit AA
   1. Zurück zur Seite Bilderfassung.
   2. Wechseln Sie in der Bildgebungsanwendung in den Modus Akustische Angiographie (Materialtabelle).
   3. Geben Sie die gewünschten Parameter des Scanprotokolls ein (der wichtigste davon ist der Bildabstand und die Anzahl der Bilder pro Position, die für diese Studien auf 0,2 mm bzw. 10 festgelegt wurde).
   4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Statisch erfassen .
      HINWEIS: Die AA-Erfassung dauert länger als der B-Mode-Ultraschall.
   5. Überprüfen Sie nach Abschluss des Scans die Ergebnisse des Scans unter Bildanalyse, um sicherzustellen, dass die Bildqualität den Erwartungen entspricht.
      HINWEIS: Für den AA-Modus kann ein repräsentativeres Gesamthirnvolumen erfasst werden, indem ein zweiter Scan mit einer anderen Fokustiefe im Gehirn wiederholt und die Bilder später mit einer ordnungsgemäßen Nachbearbeitung neu kombiniert werden (siehe Abbildung 3).
10. Bildgebung mit photoakustischer Tomographie
    1. Öffnen Sie die Anwendung optischer parametrischer Oszillator (OPO) (Materialtabelle) und stellen Sie sie auf 756 nm ein.
       Anmerkungen: OPOs können leicht aus der Kalibrierung herauskommen, stellen Sie daher vor dem Experiment sicher, dass das OPO korrekt kalibriert ist, indem Sie ein unabhängiges Spektrometer verwenden.
    2. Verschieben Sie den Linear-Array-Wandler manuell in die zuvor festgelegten Koordinaten, um sicherzustellen, dass die Wobbler-Volumina und die Linear-Array-Volumina automatisch gemeinsam registriert werden.
       HINWEIS: Es ist wichtig, dass zuvor ein Co-Registrierungsexperiment mit einem Phantomgitter durchgeführt wird, um den genauen Abstand zu bestimmen, der für die Verschiebung des Tisches erforderlich ist, so dass die resultierenden Daten von beiden Wandlern in 3D registriert werden.
    3. Öffnen Sie die Laseranwendung und schalten Sie den 532-nm-Laser ein.
    4. Messen Sie mit einem Laserleistungsmessgerät die Energie der Laserleistung und stellen Sie sicher, dass es sich um die gewünschte Energie handelt (~10 mJ pro Puls wurden für diese Studien verwendet).
    5. Wählen Sie die gewünschten Scanparameter für PAT aus (0,4 mm Schrittweite, 20 mm Scanlänge und 10 gemittelte Bilder pro Position).
    6. Öffnen Sie das MATLAB-Programm (Table of Materials) des Ultraschalldatenerfassungssystems und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen .
    7. Erfassen Sie den PAT-Scan, indem Sie die Start-Taste drücken.
    8. Sobald der Scan abgeschlossen ist, öffnen Sie das MATLAB-Speicherprogramm. Ändern Sie den Speichernamen in den gewünschten Dateinamen und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen .
    9. Ändern Sie die OPO-Wellenlänge auf 798 nm und wiederholen Sie die Schritte von 4.10.3 bis 4.10.8.
       HINWEIS: Für eine Längsschnittstudie wird empfohlen, dem Tier die Möglichkeit zu geben, sich zu erholen, indem es in einen Inkubator gelegt und einige Stunden lang beobachtet wird (gemäß den Schritten 1.1.18 und 1.1.19). Wenn eine Ergebnisvalidierung gewünscht wird, fahren Sie unmittelbar nach der PAUSAT-Bildgebung mit Abschnitt 5 fort.

5. Optional: Ergebnisvalidierung

1. Laser-Speckle-Kontrast-Bildgebung (LSCI).
   1. Betäuben Sie das Tier mit 1,5%-2,0% Isofluran in 30% O2/70%_N2.
   2. Setzen Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen und halten Sie das Tier mit einer Maske und der oben erwähnten Inhalationsanästhesie betäubt.
   3. Halten Sie das Tier bei 37 °C, indem Sie eine Heißwasser-Umluftheizung und eine Rektalsonde verwenden, um die Körpertemperatur des Tieres zu messen.
   4. Geben Sie einen Tropfen Augenschutzlotion auf die Augen der Maus.
   5. Stellen Sie sicher, dass keine Schmerzen auftreten, indem Sie die hintere Pfote des Tieres leicht einklemmen.
   6. Entfernen Sie die Haare auf der Kopfhaut des Tieres mit einem Haarschneider.
   7. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit einem Wattestäbchen mit Povidon-Jod, gefolgt von einem sterilen Pad mit 70% Ethanol. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
   8. Machen Sie einen 1,4 mm langen sagittalen Schnitt an der Mittellinie der Kopfhaut und legen Sie den Schädel frei. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Kopfhaut zu halten und zu verhindern, dass sie den zu scannenden Bereich des Gehirns einnimmt.
   9. Tragen Sie einige Tropfen Kochsalzlösung auf den Schädel auf und platzieren Sie das Laser-Speckle-Kontrastsystem (Materialtabelle) über dem Kopf des Tieres.
   10. Versetzen Sie das Gerät im Menü Datei in den Online-Modus, der im Untermenü Arbeitsmodus enthalten ist.
   11. Wählen Sie den Standard-Bildspeicherordner im Menü "Datei" und im Untermenü "Einstellungen speichern" aus.
   12. Verbinden Sie im Menü Lichtquelle den Nachführlaser ("Laser an") und das weiße Licht ("Weißlicht an"), um das Bildgebungsfenster an der richtigen Position zu platzieren.
   13. Wählen Sie im Menü "Einstellungen" die Option "Vergrößerungseinstellungen", bewegen Sie den Cursor manuell auf 2,5 und drücken Sie "Übernehmen" und "OK", um die Einstellungen zu speichern.
   14. Passen Sie den Fokus an, indem Sie die Fokusleiste im oberen Untermenü der Hauptseite manuell verschieben.
   15. Wählen Sie im Menü " Einstellung " die Option " Pseudofarben-Schwellenwerteinstellung" aus, passen Sie den Schwellenwert wie gewünscht an und drücken Sie "Übernehmen " und "OK ", um die Einstellungen zu speichern.
   16. Trennen Sie im Menü "Lichtquelle " den Guiding-Laser ("Laser aus") und das weiße Licht ("Weißlicht aus"), bevor Sie das Bild aufnehmen.
   17. Nehmen Sie das Bild auf, indem Sie das Wiedergabesymbol im oberen Untermenü der Hauptseite auswählen.
2. Färbung von Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)
   1. Betäuben Sie das Tier tief mit 5 % Isofluran in 30 % O2/70 %_N2.
   2. Sobald das Tier aufgehört hat zu atmen, enthaupten Sie es mit einer scharfen Schere.
   3. Entfernen Sie die gesamte Haut um den Kopf und die Muskeln im Nackenbereich.
   4. Machen Sie einen sagittalen Schnitt im hinteren Teil des Schädels, bis er das Scheitelbein erreicht.
   5. Machen Sie einen horizontalen Schnitt (~5 mm) in der linken und rechten Seite unterhalb des Blutgefäßes. Entfernen Sie den Hinterhauptknochen des Schädels mit einer geraden Pinzette.
   6. Machen Sie einen Schnitt (~5 mm) an der frontonasalen Naht des Schädels.
   7. Machen Sie einen sagittalen Schnitt (~10-15 mm) in der Mittellinie des Schädels - zwischen den Hemisphären - und stellen Sie sicher, dass sie vollständig getrennt sind.
   8. Entfernen Sie mit einer gebogenen Schere der Größe #7 die parietalen linken und rechten Knochen des Schädels von der Mitte zu den Seiten.
   9. Übertragen Sie das Gehirn in einen Behälter, der mit 5 ml eiskaltem 1x PBS gefüllt ist, und halten Sie es 10 Minuten lang auf Eis.
   10. Übertragen Sie das Gehirn in eine Gehirnmatrix aus Edelstahl (1 mm dicke Abschnitte).
   11. Schneiden Sie das Gehirn mit Einweg-Rasierklingen in 1 mm koronale Schnitte (Materialtabelle).
   12. Halten Sie die Klingen an den Seiten fest und füllen Sie sie in einen mit eiskaltem 1x PBS gefüllten Behälter.
   13. Trennen Sie die Abschnitte vorsichtig nacheinander von den Klingen.
   14. Übertragen Sie die Gehirnscheiben in eine Petrischale mit 70 mm Durchmesser mit 5 ml 2% TTC (Materialtabelle, 3) in 1x PBS.
   15. 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur (R/T) inkubieren.
   16. Nach 15 Minuten verwerfen Sie das TTC, ersetzen Sie es durch 3 ml Formalin und inkubieren Sie es mindestens 30 Minuten lang im Dunkeln bei R/T.
   17. Zum Schluss werden die Hirnschnitte auf eine durchsichtige Plastikfolie übertragen und die Proben gescannt, einschließlich eines Lineals im Scanbild als Referenz für zukünftige Messungen.

Representative Results

Bildgebung der Morphologie der Blutgefäße im Gehirn
AA erzeugt Bilder der Morphologie der Blutgefäße, indem Mikrobläschen im Kreislaufsystem mit ihrer Resonanzfrequenz angeregt werden und die superharmonische Reaktion der Mikrobläschen empfangen wird. Durch die Verwendung der angepassten Rampe (Abbildung 2C), die an einem manuell einstellbaren Tisch angebracht ist, können wir das Mäusegehirn im AA-Modus bei zwei verschiedenen Brenntiefen abbilden. Wenn tiefere Regionen anvisiert werden, zeigen oberflächlichere Regionen (z. B. die Großhirnrinde) eine schlechtere Auflösung und Signalstärke (Abbildung 3A) und umgekehrt (Abbildung 3B). Durch die Erfassung von zwei Fokustiefen und deren Kombination können AA-Bilder jedoch Informationen über einen gesamten koronalen Abschnitt liefern (Abbildung 3C,D). Darüber hinaus kann PAUSAT durch die Verwendung des motorisierten Tisches zum Scannen entlang einer dritten Dimension eine Reihe von koronalen Bildern registrieren, die die vom Benutzer definierte Region of Interest (ROI) abdecken. Diese Bildserien können ausgerichtet und verwendet werden, um eine 3D-Darstellung des gesamten Gehirns oder den vom Benutzer definierten ROI zu visualisieren. Aber auch zusätzliche Ergebnisse, die zeigen, dass auch andere quantitative Messgrößen (wie z.B. das Schlagvolumen) mit Hilfe der 3D-Informationen aus der Zusammenstellung der von PAUSAT aufgenommenen Bilder analysiert werden können, werden hier bereitgestellt.

Anatomische und funktionelle Beurteilung vor und nach ischämischem Schlaganfall
Um das Potenzial des PAUSAT-Systems in präklinischen Studien zu veranschaulichen, untersuchten wir zwei Gruppen von Tieren, die einem der hier analysierten ischämischen Schlaganfallmodelle unterzogen wurden: pMCAO oder PT-Schlaganfall. Diese beiden Schlaganfallmodelle unterscheiden sich in den Prinzipien, nach denen die ischämische Region gebildet wird. Kurz gesagt, im pMCAO-Modell ist die mittlere Hirnarterie elektroverätzt, wodurch die Blutzufuhr von dieser Arterie zum Gehirn unterbrochen wird. Diese Verletzung löst eine sekundäre Verletzung aus, bei der das umliegende Gewebe ischämisch wird und den vom Schlaganfall betroffenen Bereich vergrößert. Wir haben uns entschieden, das pMCAO-Schlaganfallgehirn am dritten Tag nach dem Schlaganfall abzubilden, da dies der Zeitpunkt ist, an dem die maximale Fläche, die voraussichtlich vom Schlaganfall betroffen ist, erreicht ist. Beim PT-Schlaganfall wird jedoch die maximale Gewebefläche, die vom Schlaganfall betroffen ist, nach dem ersten Tag erreicht, so dass wir uns entschieden haben, den PT-Schlaganfall am ersten Tag nach dem Schlaganfall abzubilden. Obwohl wir diese Zeitpunkte in unserer Studie gewählt haben, kann PAUSAT für die longitudinale Überwachung des Schlaganfalls zu jedem gewünschten Zeitpunkt verwendet werden.

Zunächst wurde ein B-Mode-Scan aufgenommen, um die korrekte Position des Kopfes des Tieres sicherzustellen und die räumlichen Grenzen zwischen Schädel und Gehirn zu identifizieren (Abbildung 4A und Abbildung 5A). Der vorderste Teil des abgebildeten Gehirns enthält die frontonasale Naht des Schädels als Referenzpunkt. Ein ROI von 20 mm (anterior bis posterior) x 17,15 mm (lateral) über die linke Seite (kontralateral; CL) und die rechte (ipsilaterale; IL) wurde in den folgenden Studien zur Lokalisierung der Schlaganfallregion definiert. AA-Bilder lieferten Informationen über die Strukturen der Blutgefäße, indem sie auf das Signal der zirkulierenden Mikrobläschen abzielten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass im unverletzten Gehirn (Baseline) beide Hemisphären eine ähnliche Verteilung der Blutgefäße aufweisen (Abbildung 4B und Abbildung 5B), wie es ohne Verletzung zu erwarten ist. Ein ähnliches Ergebnis wird für die Verteilung der Gewebeoxygenierungskarte auf der Grundlage von PA-Bildern beobachtet, die bei zwei verschiedenen Wellenlängen aufgenommen wurden (Abbildung 4C und Abbildung 5C). Wir entschieden uns, zwei verschiedene Wellenlängen zu bewerten, basierend auf der lokalen maximalen optischen Absorption für sauerstoffarmes Hämoglobin (756 nm) und der Wellenlänge, bei der das sauerstoffarme und das sauerstoffhaltige Hämoglobin die gleiche optische Absorption aufwiesen (798 nm)²⁰. Durch die Erfassung dieser beiden Hämoglobinzustände können wir die Sauerstoffversorgung des Gewebes genau abschätzen (Abbildung 4D und Abbildung 5D).

Am Tag nach der Aufnahme des Ausgangsbildes des Gehirns führten wir eine Operation am Tier durch (pMCAO oder PT-Schlaganfall), wie in den vorherigen Abschnitten beschrieben. Zu einem bestimmten Zeitpunkt nach dem Schlaganfall wurde ein neuer Satz von Bildern aufgenommen (siehe Abbildung 2A), um die Position und Größe des Schlaganfalls zu bewerten. Die AA-Bilder von Mäusen, die pMCAO unterzogen wurden, zeigen eine bemerkenswerte Verringerung der Intensität des Signals in der rechten Seite des Kortex (Abbildung 4B). Die gleiche Region zeigt eine Verringerung der Gewebeoxygenierungskarte aus PA-Bildern, was auf einen ischämischen Bereich hindeutet (Abbildung 4D). Um unsere Ergebnisse zu validieren, entschieden wir uns, das Gehirn zu entnehmen und die TTC-Färbung unmittelbar nach der Aufnahme der Bilder des Schlaganfalltieres durchzuführen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der als Schlaganfall identifizierte Bereich im Vergleich zu unseren Ergebnissen von PAUSAT und der etablierten TTC-Färbung ähnlich ist (Abbildung 4B-E). Wir zeigen hier auch, dass PAUSAT Schlaganfallbereiche im Gehirn identifizieren kann, indem wir ein zweites Schlaganfallmodell, den PT-Schlaganfall, verwenden, der zu einem früheren Zeitpunkt nach der Schlaganfallinduktion (1 Tag) ausgewertet wird. Wie in Abbildung 5B gezeigt, konnten wir eine Region im oberen Teil der Hirnrinde mit einer reduzierten Durchblutung und einer damit einhergehenden Abnahme der Sauerstoffsättigung identifizieren (Abbildung 5D). Die Ergebnisse der TTC-Färbung stimmen mit der Position und Größe des zuvor mit PAUSAT identifizierten Schlaganfalls überein (Abbildung 5B-E).

Das Alter der abgebildeten Maus kann die Bildqualität stark beeinflussen. Der Schädel einer Maus wird mit zunehmendem Alter dicker, und da der Schädel im Vergleich zu Weichgewebe eine deutlich andere akustische Impedanz aufweist, wird ein großer Prozentsatz der Ultraschallwellen an der Schädelgrenze reflektiert. Da diese integrierten Bildgebungssysteme alle akustisch sind, führt dies bei älteren Mäusen zu einer Verringerung der Bildtiefe. Dies ist in Abbildung 6 deutlich zu sehen, wo Mäuse unterschiedlichen Alters unter den gleichen Bedingungen mit AA abgebildet wurden. Ähnliche signalarme Ergebnisse sind zu erwarten, wenn das bildgebende Verfahren nicht wie zuvor beschrieben befolgt wird.

Quantitative Analyse des Hubvolumens mittels PAUSAT
Wie in den oben genannten Ergebnissen beschrieben, nimmt PAUSAT eine Reihe von koronalen Bildern auf, die auf einen vom Benutzer beschriebenen ROI abzielen. Wir analysierten das Volumen des Schlaganfalls, indem wir die Schlagfläche innerhalb der verschiedenen koronalen Bilder und den Abstand zwischen den Bildern berechneten. Das mit PAUSAT berechnete Hubvolumen zeigt keinen statistischen Unterschied (p < 0,05) im Vergleich zu dem Hubvolumen, das auf der Grundlage eines ähnlichen Ansatzes mit TTC-Färbebildern berechnet wurde (Abbildung 7).

Abbildung 3: Einfluss der Brenntiefe des Wobbler-Schallkopfs auf die Qualität von AA-Bildern. Bilder mit mehreren Brennweiten können aufgenommen und später kombiniert werden, um die besten Bildgebungsergebnisse für das gesamte Gehirn zu erzielen. (A) AA-Koronalschnitt, der in einer tieferen Fokustiefe aufgenommen wurde. (B) Koronaler Schnitt AA, der in einer oberflächlicheren Fokustiefe aufgenommen wurde. (C) Ergebnis der Verschmelzung von Bildern mit tieferem Fokus (grün) und oberflächlich fokussierten (Magenta). (D) Ergebnis der Kombination von tiefer fokussierten und oberflächlich fokussierten Bildern mit einem Pixelskalierungswert, der mit (A) und (B) vergleichbar ist. Diese Zahl wurde von¹⁶ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Repräsentative PAUSAT-Ergebnisse eines Mausgehirns vor und nach einem pMCAO-Schlaganfall . (A) Koronale Ultraschallbilder des B-Modus zu Beginn und nach dem Schlaganfall. (B) Koronale AA-Bilder zu Beginn und nach dem Schlaganfall. (C) Basis- und post-stroke PA koronale Bilder bei 756 nm Anregung. (D) Sauerstoffsättigungskarte basierend auf 756 nm und 798 nm Anregungsbildern. (E) TTC-gefärbte Schnitte eines Mäusegehirns, die die gleiche Region des Schlaganfalls zeigen. Der Abstand zwischen den Linien am unteren Rand des Bildes beträgt 1 mm. Diese Zahl wurde von¹⁶ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Repräsentative PAUSAT-Ergebnisse einer Maus vor und nach PT-Schlaganfall. (A) Koronale Ultraschallbilder des B-Modus zu Beginn und nach dem Schlaganfall. (B) Koronale AA-Bilder zu Beginn und nach dem Schlaganfall. (C) Basis- und post-stroke PA koronale Bilder bei 756 nm Anregung. (D) Sauerstoffsättigungskarte basierend auf 756 nm und 798 nm Anregungsbildern. (E) TTC-gefärbte Schnitte eines Mäusegehirns, die die gleiche Region des Schlaganfalls zeigen. Der Abstand zwischen den Linien am unteren Rand des Bildes beträgt 1 mm. Diese Zahl wurde von¹⁶ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Einfluss des Mausalters auf die Qualität von AA-Bildern. Diese Abbildung zeigt den Unterschied in der AA-Signalintensität und der Bildtiefe, wenn Tiere unterschiedlichen Alters unter vergleichbaren Bedingungen abgebildet werden. Wie in der Abbildung zu sehen ist, liefert die Bildgebung älterer Mäuse (18 Monate) aufgrund der Größe und Dicke des Schädels im Vergleich zu jüngeren Mäusen (1,5 Monate) Bilder von geringerer Qualität, während erwachsene Mäuse ein mittleres Signal (6 Monate) zeigen. Aufgrund der großen akustischen Impedanzfehlanpassung zwischen Schädel und Hirngewebe werden Ultraschallwellen, die sich durch den Schädel ausbreiten, reflektiert und gebrochen, was zu Signalverlusten und Auflösungsverschlechterungen führt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Analyse des Volumens des ischämischen Schlaganfalls. (A) Beispiel für TTC-Schnitte aus PT-Schlaganfällen und entsprechenden TTC-segmentierten Bildern, AA-Bildern und AA-segmentierten Bildern an vergleichbaren koronalen Stellen. (B) Das auf der Grundlage von TTC- und AA-Bildern berechnete Schlagvolumen für pMCAO- und PT-Schlaganfall zeigt keine signifikanten Unterschiede (p > 0,05). Die Grafik zeigt den Mittelwert ± die Standardabweichung (S.D.) (n = 3 Tiere pro Gruppe). Diese Zahl wurde von¹⁶ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Es gibt einige wichtige Aspekte dieser Methode, die, wenn sie falsch durchgeführt werden, zu einer erheblichen Verringerung der Bildqualität und der quantitativen Analyse führen können. Das am häufigsten auftretende Ergebnis von Benutzerfehlern in PAUSAT-Bildern ist entweder ein fehlendes Signal oder eine sehr geringe Signalstärke, die beide aus verschiedenen Gründen auftreten können. Ein Grund dafür ist ein Problem mit der akustischen Kopplung. Große Luftblasen im Wasser, das den Kopf der Maus während der Bildgebung umgibt, können den Ultraschall oft daran hindern, zum oder vom Schallkopf zu gelangen, was zu einer Schattenregion im resultierenden Bild für alle drei Modalitäten des Systems führt. Dies kann verhindert werden, indem sichergestellt wird, dass genügend Wasser zwischen der Systemmembran und der abzubildenden Probe vorhanden ist. Es kann auch vorkommen, dass ein AA-Signal fehlt, aber ein überraschend hohes PA-Signal, unabhängig von den verwendeten Wellenlängen. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass das Vorhandensein von Haaren - insbesondere dunklem Haar - die Absorption des Lichts beeinträchtigt. Um dies zu vermeiden, ist es notwendig, den Kopf des Tieres zuvor rasiert zu haben, bis kein Haar mehr sichtbar ist.

In Bezug auf AA-Bilder ist ein weiteres Problem, das auftreten kann und zu einem fehlenden oder sehr schwachen Signal führen würde, eine geringe Konzentration von Mikrobläschen im Kreislaufsystem. Wenn die Mikrobläschen zu verdünnt sind oder unsachgemäß injiziert wurden, ist das resultierende Signal sehr schwach. Die retroorbitale Injektion darf nur von gut ausgebildetem Personal durchgeführt werden. Ein weiterer Grund könnte eine lange Zeitspanne zwischen der Mikrobläscheninjektion und dem Beginn der Bildgebung sein, die zu einer Verringerung der Mikrobläschen im Blutkreislauf führen kann. Um dies zu vermeiden, wird empfohlen, das System vor der Injektion der Mikrobläschen für die Bildgebung vorzubereiten, damit das Tier sofort nach der Injektion auf die PAUSAT-Systemmembran übertragen werden kann. Es ist erwähnenswert, dass alternative intravenöse Wege (z. B. Schwanzveneninjektion) auch verwendet werden können, wenn das Tier bereits auf der Membran des PAUSAT-Systems positioniert ist, wodurch die Zeit zwischen Injektion und Bildgebung verkürzt wird. Um die maximal mögliche Konzentration von Mikrobläschen aufrechtzuerhalten, wird außerdem empfohlen, die AA-Bildgebung vor der PA-Bildgebung durchzuführen.

Das PA-Signal kann auch beeinträchtigt werden, wenn die notwendigen Schritte nicht ordnungsgemäß ausgeführt werden. Eines der Probleme betrifft die Qualität des Anregungslasers. Die beiden Hauptkomponenten, die die Laserquelle beschreiben, sind die Pulsenergie und die Wellenlänge. Es wird dringend empfohlen, ein unabhängiges Leistungsmessgerät und Spektrometer zu verwenden, um diese Größen zu messen und sicherzustellen, dass sie auf die gewünschten Werte eingestellt sind. Wird ein falscher Wert angenommen, liefern die Funktionsberechnungen irreführende Ergebnisse.

Es ist auch möglich, dass die Kombination von AA- und PA-Bildern nicht richtig ausgerichtet ist. Der Hauptgrund dafür ist, dass die Koordinaten, die zwischen den Wandlern ermittelt wurden, nicht genau waren. Um dies zu verhindern, ist es wichtig, die erforderlichen Experimente vorher mit einem Phantomgitter durchzuführen, um die genauen Koordinaten für eine erfolgreiche Koregistrierung von AA- und PA-Bildern zu bestimmen. Eine weitere potenzielle Quelle für Ungenauigkeiten ist eine falsche Kalibrierung des OPO. Um dies zu vermeiden, muss der OPO mit einem unabhängigen Spektrometer korrekt kalibriert werden.

Es gibt noch erhebliche Verbesserungsmöglichkeiten, insbesondere in Bezug auf die Bildqualität der PAT-Komponente dieses integrierten Systems. Das aktuelle PAT-System basiert auf einer Scanning-Linear-Array-Konfiguration. Wir sind in der Lage, großräumige Unterschiede in der Sauerstoffversorgung von Infarkt- und gesunden Hirnregionen mit mehreren Schlaganfall-Mausmodellen zu beobachten, jedoch ist das detaillierte Gefäßsystem (Mikrogefäße) nicht zu erkennen. Es gibt zwei Hauptprobleme, die zu dieser geringen Bildqualität beitragen. Das erste ist das Problem der eingeschränkten Sicht. Um ein rekonstruiertes Vollbildbild einer Probe in PAT zu erstellen, muss der Detektor das Objekt vollständig umgeben (oder einen Raumwinkel von 4π haben). Im experimentellen Umfeld ist dies jedoch schwierig. Dies führt zu dem Problem der eingeschränkten Sicht, das dazu führt, dass Blutgefäße, die orthogonal zum Schallkopf-Array sind, nicht nachweisbar sind²¹. Es gibt Lösungen, um die Auswirkungen des Problems der eingeschränkten Sicht in linearen Array-PAT zu reduzieren, von denen die vielversprechendste die Verwendung von Mikroblasen als virtuelle Punktquellen²² ist. Das zweite Problem von Linear-Array-PAT ist die schlechte Höhenauflösung und Empfindlichkeit, die auf den schwachen Fokus der akustischen Linse zurückzuführen ist. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die Verwendung von Einzelspaltbeugung im Hardware-Design eines Linear-Array-Systems eine isotrope Auflösung und Empfindlichkeit für Linear-Array-PAT^23,24 erzeugt. Es hat sich auch gezeigt, dass Deep-Learning-Ansätze sowohl das Problem der eingeschränkten Sicht als auch die schlechte Höhenauflösung von Linear-Array-PAT^25,26,27 teilweise lösen. Die Kombination dieser Lösungen würde die Bildqualität der PAT-Komponente unseres integrierten Bildgebungssystems erheblich verbessern.

Hier haben wir ein neuartiges nicht-invasives multimodales Bildgebungsverfahren zur strukturellen und funktionellen Quantifizierung des ischämischen Schlaganfalls im präklinischen Setting vorgestellt. Durch AA ist eine eindeutige Morphologie und Perfusionskartierung von Blutgefäßen im Mäusegehirn möglich. Ein lokal definierter Signalmangel kann auf eine Infarktregion hinweisen, in der eine verminderte Durchblutung vorliegt, was die Abschätzung des Infarktvolumens nichtinvasiv und longitudinal ermöglicht. Durch PAT kann die Sauerstoffsättigung des Hämoglobins innerhalb und außerhalb der Schlaganfallregion gemessen werden, was den hypoxischen Zustand des Hirngewebes in der Infarktregion zeigt. Diese Methode der Ganzhirnbildgebung ist im Vergleich zu einigen Alternativen, wie z. B. der Kleintier-MRT, kostengünstig. Darüber hinaus ermöglicht es die Kombination von funktionellen und strukturellen Informationen in tiefen Geweben, die andere präklinische Bildgebungsgeräte nicht erreichen können. Im Vergleich zu histologischen Analysen ermöglicht diese Methode die Messung dieser Metriken im Längsschnitt und zu mehreren Zeitpunkten, anstatt an einem einzigen Endpunkt. Die Möglichkeit, dies zu tun, wird in der präklinischen Studie des ischämischen Schlaganfalls beispiellose quantitative Details liefern. Darüber hinaus kann die strukturelle und funktionelle Bildgebungsfähigkeit dieses Systems für viele präklinische Studien über den ischämischen Schlaganfall^{hinaus angewendet werden 28}. Jeder Krankheitszustand oder jedes biologische Phänomen, das das Gefäßsystem betrifft, könnte mit PAUSAT eingehend untersucht werden, was es zu einem leistungsstarken präklinischen Bildgebungswerkzeug macht, das auf viele andere präklinische Bereiche (z. B. Krebs) übertragbar ist.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 GA catheter	BD Insyte Autoguard Winged	381534	For mouse intubation
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma	T8877	Necessary for TTC-staining brain for validation
532nm Laser	Quantel	Q-smart 850	Laser used to pump the OPO for PAT
Automatic Ventilator Rovent Jr.	Kent Scientific	RV-JR	To keep mice under anesthesia during surgical procedure
Black braided silk 4-0 USP	Surgical Specialties	SP116	Used for sutures on the neck for pMCAO surgery
Bupivacaine	Hospira	0409-1159-18	Used prior to closing wounds during surgical procedure
C57BL/6 Mice	Jackson Lab	#000664	Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female)
Clear suture	Ethicon	8606	Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT
Cold Light LED	Schott	KL 1600	Needed to create PT stroke
Disposable Razor Blade	Accutec Blades	74-0002	For sectioning mouse brain
Electric drill	JSDA	JD-700	Used to expose MCA during pMCAO procedure
Electrocauterization tool	Wet-Field	Wet-Field Bipolar-RG	Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure
Hair removal gel	Veet	8282651	Used to remove hair from mouse prior to imaging
High Temperature Cautery Loop Tip	BOVIE Medical Corporation	REF AA03	Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull
IR Detector Card	Thorlabs	VRC5	Used to ensure light path is aligned
Laser Power Meter	Ophir	StarBright, P/N 7Z01580	Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging
Laser Speckle Imaging System	RWD Life Science Co.	RFLSI-III	Can be used to validate stroke surgery success
Lubricant Eye Ointment	Soothe	AB31336	Can be used to avoid drying of the eyes
Manually adjustable stage	Thorlabs	L490	Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging
Modified Vega Imaging System	Perkin Elmer	LLA00061	System containing both B-mode/AA and PAT transducers
Optical Parametric Oscillator	Quantel	versaScan-L532	Allows for tuning of excitation wavelength in a large range
Programmable Ultrasound System	Verasonics	Vantage 256	Used for PAT part of system
Rose Bengal	Sigma	330000	Necessary to induce PT stroke
Suture	LOOK	SP116	Used for permanent ligation of CCA
Temperature Contoller	Physitemp	TCAT-2	Used to maintain stable body temperature of mice during procedures
VesselVue Microbubbles	Perkin Elmer	P-4007001	Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL)