Summary
이 작업은 허혈성 뇌졸중의 비침습적 이미징을 위한 다중 모드 초음파 기반 이미징 플랫폼의 사용을 보여줍니다. 이 시스템은 광음향 영상을 통한 혈액 산소화의 정량화와 음향 혈관 조영술을 통한 뇌의 관류 장애를 허용합니다.
Abstract
여기에 제시된 것은 광음향, 초음파 및 혈관 조영 단층 촬영(PAUSAT)의 세 가지 음향 기반 영상 기술을 통합하는 새로 개발된 비침습적 영상 시스템을 사용한 실험적 허혈성 뇌졸중 연구입니다. 이 세 가지 양식을 결합하면 뇌의 다중 스펙트럼 광음향 단층 촬영(PAT), 혈액 산소화, 뇌 조직의 고주파 초음파 영상 및 대뇌 혈액 관류의 음향 혈관 조영술을 획득하는 데 도움이 됩니다. 다중 모드 이미징 플랫폼을 사용하면 뇌졸중 후 전체 마우스 뇌의 대뇌 관류 및 산소 공급 변화를 연구할 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 두 가지 허혈성 뇌졸중 모델인 영구 중대뇌동맥 폐색(pMCAO) 모델과 광혈전(PT) 모델을 평가했습니다. PAUSAT는 뇌졸중 전후의 동일한 마우스 뇌를 이미지화하고 두 뇌졸중 모델을 정량적으로 분석하는 데 사용되었습니다. 이 이미징 시스템은 손상되지 않은 조직(반대측)에 비해 뇌졸중 경색 영역(동측)에서 현저히 감소된 혈액 관류 및 산소 공급을 포함하여 허혈성 뇌졸중 후 뇌 혈관 변화를 명확하게 보여줄 수 있었습니다. 결과는 레이저 스페클 조영 이미징과 트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 염색으로 확인되었습니다. 또한, 두 뇌졸중 모델 모두에서 뇌졸중 경색 부피를 측정하고 TTC 염색에 의해 실측 자료로 검증했습니다. 이 연구를 통해 우리는 PAUSAT가 허혈성 뇌졸중의 비침습적 및 종단적 전임상 연구에서 강력한 도구가 될 수 있음을 입증했습니다.
Introduction
혈액은 산소(헤모글로빈 단백질을 통해)와 기타 중요한 영양소를 우리 몸의 조직으로 운반합니다. 조직을 통한 혈액의 흐름이 중단되면 (허혈), 조직에 심각한 손상이 발생할 수 있으며, 그 중 가장 즉각적인 영향은 산소 부족 (저산소증)으로 인한 것입니다. 허혈성 뇌졸중은 뇌의 특정 영역으로의 혈류가 중단 된 결과입니다. 허혈성 뇌졸중으로 인한 뇌 손상은 혈관이 막힌 후 몇 분 이내에 발생할 수 있으며 종종 쇠약하고 지속적인 영향을 미칠 수 있습니다 1,2. 허혈성 뇌졸중 후 생리병리를 평가하고 새로운 치료법을 확인 및 테스트하기 위한 매우 가치 있는 전략은 실험실에서 소동물 모델을 사용하는 것입니다. 실험실에서 발견된 치료법은 임상용으로 전환되어 환자의 삶을 개선하는 것을 목표로 합니다. 그러나 생물의학 연구에서 동물의 사용은 Russell과 Burch의 3R 원칙(대체, 감소 및 정제)에 따라 신중하게 평가되어야 합니다.3. 감소 구성 요소의 목적은 데이터 수집을 손상시키지 않으면서 동물 수를 줄이는 것입니다. 이를 염두에 두고, 비침습적 영상을 통해 병변의 진화를 종단적으로 평가할 수 있다는 것은 필요한 동물의 수를 줄이는 데 큰 이점을 제공할 뿐만 아니라 각 동물로부터 얻은 정보를 최대화할 수 있다4.
광음향 단층 촬영(PAT)은 광학 흡수 대비와 초음파 영상공간 해상도를 결합한 하이브리드 영상 방식이다5. PAT의 이미징 메커니즘은 다음과 같습니다. 여기 레이저 펄스가 이미징되는 대상에 조명됩니다. 타겟이 여기 레이저의 파장에서 빛을 흡수한다고 가정하면 온도가 증가합니다. 이러한 급격한 온도 상승은 대상의 열탄성 팽창을 초래합니다. 팽창으로 인해 초음파가 대상에서 전파됩니다. 여러 위치에서 초음파를 감지함으로써 파동이 대상에서 검출기로 전파되는 데 필요한 시간을 재구성 알고리즘을 통해 이미지를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 심부 조직 영역에서 광학 흡수를 감지하는 PAT의 능력은 조직의 서로 다른 음향 임피던스의 경계를 감지하는 초음파 영상과 PAT를 구별합니다5. 가시광선 및 근적외선 스펙트럼에서 유기체에 풍부한 주요 흡수율 생체 분자는 헤모글로빈, 지질, 멜라닌 및 물입니다7. 뇌졸중 연구에서 특히 흥미로운 것은 헤모글로빈입니다. 옥시헤모글로빈과 데옥시헤모글로빈은 광학 흡수 스펙트럼이 다르기 때문에 PAT는 다중 여기 레이저 파장과 함께 사용하여 단백질의 두 상태의 상대적 농도를 결정할 수 있습니다. 이를 통해 헤모글로빈(sO2)의 산소 포화도 또는 혈액 산소화가 경색 영역 8,9의 내부 및 외부에서 정량화될 수 있습니다. 이것은 허혈 후 손상된 뇌 조직의 산소 수준을 나타낼 수 있기 때문에 허혈성 뇌졸중에서 중요한 척도입니다.
음향 혈관조영술(Acoustic angiography, AA)은 생체 내에서 맥관 구조의 형태를 영상화하는데 특히 유용한 조영증강 초음파 영상법이다 10. 이 방법은 이미징 대상의 순환계에 주입된 미세 기포와 함께 이중 요소 워블러 변환기(저주파 요소 및 고주파 요소)의 사용에 의존합니다. 트랜스듀서의 저주파 소자는 마이크로버블의 공진 주파수(예를 들어, 2MHz)로 전송하기 위해 사용되는 반면, 고주파 소자는 마이크로버블의 초고조파 신호(예를 들어, 26MHz)를 수신하기 위해 사용된다. 공진 주파수에서 여기될 때, 마이크로버블은 강한 비선형 반응을 가지며, 그 결과 주변 신체 조직이 생성하지 않는 초고조파 신호가 생성된다11. 고주파 소자로 수신함으로써 마이크로 버블 신호만 감지할 수 있습니다. 미세 기포가 혈관에 국한되어 있기 때문에 결과는 혈관 형태의 혈관 조영 이미지입니다. AA는 순환계를 통해 흐르는 미세 기포가 막힌 혈관을 통해 흐를 수 없기 때문에 허혈성 뇌졸중을 영상화하는 강력한 방법입니다. 이를 통해 AA는 경색 영역을 나타내는 허혈성 뇌졸중으로 인해 관류되지 않은 뇌 영역을 감지할 수 있습니다.
전임상 허혈성 뇌졸중 연구는 일반적으로 뇌졸중의 위치와 중증도를 평가하기 위해 조직학 및 행동 검사를 사용합니다. 트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 염색은 뇌졸중 경색 부피를 측정하는 데 사용되는 일반적인 조직학적 분석입니다. 그러나, 동물을 안락사시켜야 하기 때문에 종점에서만 사용할 수 있다12. 행동 검사는 여러 시점에서 운동 기능 장애를 판정하는 데 사용될 수 있지만, 정량적인 해부학적 또는 생리학적 값을 제공할 수는 없다13. 생물 의학 영상은 허혈성 뇌졸중의 영향을 비침습적 및 세로적으로 연구하기 위한 보다 정량적인 접근 방식을 제공합니다 9,14,15. 그러나 기존 이미징 기술(예: 소동물 자기 공명 영상[MRI])은 비용이 많이 들거나 구조적 및 기능적 정보를 동시에 제공할 수 없거나 침투 깊이가 제한될 수 있습니다(대부분의 광학 이미징 기술).
여기에서는 광음향, 초음파 및 혈관 조영 단층 촬영(PAUSAT, 그림 1의 시스템 다이어그램 참조)을 결합하여 허혈성 뇌졸중 후 혈액 관류 및 산소 공급에 대한 보완적인 구조적 및 기능적 정보를 제공합니다16. 이는 부상의 심각성을 평가하고 치료에 대한 회복 또는 반응을 모니터링하는 데 있어 두 가지 중요한 측면입니다. 이러한 통합 이미징 방법을 사용하면 각 동물이 얻는 정보의 양을 증가시켜 필요한 동물의 수를 줄이고 허혈성 뇌졸중에 대한 잠재적 치료법 연구에서 더 많은 정보를 제공할 수 있습니다.
그림 1: PAUSAT 다이어그램. (A) PAT에 사용되는 레이저 및 OPO를 포함한 PAUSAT 시스템의 전체 개략도. (B) 두 개의 초음파 변환기를 포함한 PAUSAT 시스템의 내부 모습. 이중 소자 워블러 트랜스듀서는 B 모드 초음파와 AA 모두에 사용되며 선형 배열 트랜스듀서는 PAT에 사용됩니다. 두 트랜스듀서 모두 동일한 2D 전동 스테이지에 장착되어 스캔을 통해 체적 데이터를 생성할 수 있습니다. 이 수치는16에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
모든 동물 시술은 듀크 대학 의료 센터 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 미국 공중 보건국의 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 관한 정책에 따라 수행되었습니다. 수컷 및 암컷 C57BL/6J 마우스( 재료 표 참조)를 이 연구에 사용했습니다. 뇌졸중 모델 그룹당 최소 3마리의 동물을 영상화했습니다. 이 프로토콜에서 따르는 워크플로에 대해서는 그림 2 를 참조하십시오.
그림 2: 뇌졸중에 적용된 PAUSAT 영상의 실험 절차 요약. Biorender.com 로 제작되었습니다. 그림은 (A) 두 가지 주요 스트로크 모델(pMCAO 및 PT 스트로크)에서 시작하는 이미징 절차의 워크플로를 보여줍니다. (B) 동물을 PAUSAT 멤브레인에 배치하기 전에 미세 기포의 역궤도 주입을 수행해야 합니다. (C) 이 설정에는 지속적인 마취를 제공하는 마스크와 동물의 체온을 안정적으로 유지하기 위한 가열 패드가 필요합니다. 동물의 몸은 가열 패드 위에 놓이고 머리는 시스템의 멤브레인에 놓입니다. (D) 이미지 획득 순서도 그림에 표시됩니다. (E) TTC 염색은 본 연구의 결과를 검증하기 위해 수행된다. DPI: 부상 후 일수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 스트로크 마우스 모델 유도
- 총경동맥(CCA) 결찰을 동반한 영구 중대뇌동맥 폐색(pMCAO).
참고: 간단히 말해서 우측 CCA의 영구 결찰과 우측 중대뇌동맥(MCA)의 후방 전기소작술을 수행합니다17. 이 절차는 뇌의 오른쪽 피질에서 뇌 혈류를 제한하여 허혈성 뇌졸중을 일으킨다18.- 의식 상실(페달 반사 상실로 인식됨)까지 30% O 2/70% N2에 5.0% 이소플루란의 흡입 혼합물을 사용하여 유도 챔버에서 마취를 유도합니다.
- 20G 카테터 (재료 표)를 사용하여 동물을 삽관하고 자동 인공 호흡기에 연결하십시오. 동물의 체중을 기준으로 유속을 설정하고 30% O 2/70% N 2에서 1.5%-2.0% 이소플루란을 사용하여 동물을 마취된 상태로 유지합니다.
- 가열 램프와 온도 조절 장치에 연결된 직장 프로브를 사용하여 동물의 체온을 37 °C로 유지합니다.
- 마우스의 눈에 윤활제 눈 연고를 한 방울 떨어 뜨립니다.
- 동물을 앙와위 자세로 놓고 헤어 트리머를 사용하여 목 부위에서 머리카락을 제거하십시오.
- 먼저 포비돈 요오드가 함유 된 면봉을 사용한 다음 70 % 에탄올이 함유 된 멸균 패드를 사용하여 피부 부위를 청소하십시오. 이 작업을 세 번 수행합니다.
- 동물의 뒤쪽 발을 약간 꼬집어 마취의 깊이와 통증이 없는지 확인하십시오.
- 목 중간선에 0.8cm의 시상 절개를 하고 오른쪽 CCA를 노출시킵니다.
- 4-0 실크 봉합사를 주 실을 구성하는 더 얇은 실로 분리하여 CCA 결찰을 위한 봉합사를 준비합니다. 서브스레드 중 하나의 길이를 1.5cm로 사용하여 CCA를 영구적으로 결찰합니다.
알림: 매듭을 조인 후 매듭까지 1-2mm 거리에서 연장선을 절단하여 여분의 실을 제거합니다. - 상처를 봉합하기 전에 부피바카인 한 방울을 바르십시오.
- 중단된 4-0 실크 수술용 봉합사를 사용하여 절개 부위를 닫고 감염을 예방하기 위해 표면에 3중 항생제 연고를 바릅니다.
- 마우스를 움직여 동물의 몸의 오른쪽 측면을 노출시킵니다.
-
헤어 트리머를 사용하여 귀와 눈 사이의 머리카락을 제거합니다.
-
포비돈 요오드가 함유된 면봉을 사용하여 수술 부위를 소독한 다음 70% 에탄올이 함유된 멸균 패드를 사용하여 수술 부위를 소독합니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
-
수술 부위를 고정하기 위해 멸균 드레이프를 놓습니다. 그런 다음 동물의 오른쪽 눈과 귀 사이를 0.5cm 절개하여 두개골과 측두근 사이의 관절을 노출시킵니다.
- 소작 루프를 사용하여 근육을 소작하여 두개골에서 분리하고 MCA 영역을 노출시킵니다.
- 0.2mm2 창을 뚫어 전기 드릴을 사용하여 MCA를 노출시키고 MCA에 전기 소작을 사용하여 혈류를 차단합니다.
알림: 80% 전력 강도에서 단일 펄스로 MCA를 소작하기에 충분합니다. - 27G 바늘에 부착된 1mL 주사기를 사용하여 수술 부위에 부피바카인(재료 표) 한 방울을 바릅니다.
- 중단된 6-0 투명 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 피부 절개 부위를 닫고 감염을 예방하기 위해 표면에 3중 항생제 연고를 바릅니다.
- 수술 완료 후 온도를 조절한 인큐베이터(32°C)로 동물을 옮기고 동물이 회복될 수 있도록 합니다.
- 2 시간 후, 동물을 집 케이지로 옮기고 음식과 물을 임의로 제공하십시오.
- 광혈전 뇌졸중(PT 뇌졸중)
참고: 간단히 말해서 PT 뇌졸중은 뇌의 혈관 내에서 로즈 벵골을 비추어 수행됩니다. 로즈 벵골은 복강 내 투여되며, 몸 전체에 잘 분포되면(5분) 녹색 차가운 빛으로 조명되어 로즈 벵골을 활성화시켜 활성 산소 종(ROS)을 생성합니다. 이러한 ROS는 내피 세포의 막을 손상시켜 조명된 전체 영역 내에 혈전을 생성하고 국소 대뇌 혈류 장애를 유발합니다19.- 의식 상실(페달 반사 상실로 인식됨)까지 30% O 2/70% N2에 5.0% 이소플루란의 흡입 혼합물을 사용하여 유도 챔버에서 마취를 유도합니다.
- 동물을 정위 프레임으로 설정하고, 마스크를 사용하여 동물을 마취된 상태로 유지하고 30% O2/70%N2 중 1.5%-2.0% 이소플루란을 유지합니다.
- 온수 재순환 히터와 직장 탐침을 사용하여 동물을 37°C로 유지하여 동물의 체온을 측정합니다.
- 마우스의 눈에 윤활제 눈 연고를 한 방울 떨어 뜨립니다.
- 헤어 트리머를 사용하여 동물의 머리를 면도하십시오.
- 면도한 두피 부위를 먼저 포비돈 요오드가 함유된 면봉을 사용한 다음 70% 에탄올이 함유된 멸균 패드를 사용하여 세 번 세척합니다.
- 동물의 뒤쪽 발을 약간 꼬집어 통증이 없는지 확인하십시오.
- 메스를 이용하여 두피의 중간선에 1.4cm의 시상 절개를 하고 두개골을 노출시킵니다.
- 날카로운 연필을 사용하여 브레그마에서 오른쪽으로 1.5mm의 표시를하십시오.
- 2.5mm 표시의 중앙에 직경 1.5mm의 원형 핀홀을 놓습니다.
알림: 원형 핀홀이 포함된 정사각형은 양면 검은색 테이프를 사용하고 언급된 크기의 단일 구멍 펀치 도구를 사용하여 중앙에 직경 2.5mm의 구멍을 만들어 만들 수 있습니다. - 원형 핀홀에 녹색 차가운 조명을 놓습니다., 조명과 핀홀 사이의 간격을 최소화합니다.
- 빛이 퍼지지 않도록 알루미늄 호일로 해당 부위를 덮으십시오.
- 설정이 준비되면 동물에게 10mg/kg 로즈 벵갈(1x 인산염 완충 식염수[PBS]에 10mg/mL)을 복강 주사하고 5분 동안 기다립니다.
- 5분 후 차가운 광원(강도: 4.25)을 켜고 15분 동안 노출을 유지합니다.
- 다음으로, 차가운 빛을 끄고 육안으로 (주변 영역보다 하얗게 예상되는 영역) 또는 외부 장치를 사용하여 뇌 혈류를 측정합니다 (예 : 레이저 스페클 대비 이미징 사용) (재료 표, 5.1 단계 참조).
- 27G 바늘에 부착된 1mL 주사기를 사용하여 수술 부위에 부피바카인(재료 표) 한 방울을 바릅니다.
- 중단된 6-0 투명 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 피부 절개 부위를 닫고 감염을 예방하기 위해 표면에 3중 항생제 연고를 바릅니다.
- 수술 완료 후 온도를 조절한 인큐베이터(32°C)로 동물을 옮기고 동물이 회복될 수 있도록 합니다.
- 2 시간 후, 동물을 집 케이지로 옮기고 음식과 물을 임의로 제공하십시오.
2. 이미징을 위한 PAUSAT 준비
- 532nm 레이저를 켜고 예열을 위해 15분 동안 그대로 두십시오.
- 마취 된 동물을위한 이미징 플랫폼을 준비하십시오.
- 맞춤형 r을 배치amp (그림 2C) 수동으로 조정 가능한 s에 부착tage(재료 표) 이미징 멤브레인 옆에.
- 맞춤형 r에 연결된 호흡 튜브가 있는 마우스 치아 홀더를 부착합니다.amp 및 램프 표면에 가열 패드를 고정합니다.
- 레이저가 예열된 후 카드를 광섬유 번들 입력 앞에 놓고 레이저 광이 번들에 들어가는지 확인하여 근적외선 감지기 카드(재료 표)를 사용하여 레이저 경로와 광섬유 번들로의 커플링이 잘 정렬되었는지 확인합니다.
알림: 필요에 따라 레이저 경로 미러를 조정하여 레이저 입력이 광섬유 번들 입력의 중앙에 오도록 합니다.
3. PAUSAT를 위한 동물 준비
참고: PAUSAT는 PT 뇌졸중 수술 후 1일 또는 pMCAO 수술 후 3일 후에 시행됩니다. 이미징을 위해 PAUSAT를 준비하는 것(2단계)은 약 20분이 소요되며 PAUSAT를 위해 동물을 준비하기 직전에 수행해야 합니다.
- 의식 상실(페달 반사 상실로 인식됨)까지 30% O 2/70% N2와 혼합된 5% 이소플루란의 흡입 혼합물을 사용하여 유도 챔버에서 마취를 유도합니다.
- 동물을 치아 홀더와 마스크로 가열 된 플랫폼으로 옮기고 30 % O 2 / 70 % N 2 에서 1.5 % -2.0 % 이소 플루 란으로 마취를 유지합니다.
- 가열 램프와 온도 조절 장치에 연결된 직장 프로브를 사용하여 동물의 체온을 37 °C로 유지하십시오.
- 전기 면도기를 사용하여 동물의 머리 꼭대기에 있는 머리카락을 다듬습니다. 눈 근처부터 귀 뒤까지의 영역을 포함합니다.
- 상업용 제모 크림을 바르면 동물의 머리 꼭대기에 있는 털을 면도하여 남은 짧은 털을 완전히 제거합니다. 피부에 5-6분 동안 그대로 둔 다음 물에 적신 면봉으로 크림을 완전히 제거할 수 있도록 닦아냅니다. 피부에 머리카락이 없어 질 때까지 반복하십시오.
참고: 수술 후 1일 후 영상 촬영의 경우 수술을 시작하기 전에 다음 단계를 수행할 수 있습니다. PT 뇌졸중 후 1 일째에 생략 할 수 있습니다. 수술 후 며칠 후에 PAUSAT 이미지 획득을 수행할 때 이 단계를 수행해야 합니다. - 동물과 시스템이 이미징을 위해 준비되면 동물을 시스템의 플랫폼으로 옮기기 직전에 27G 바늘을 사용하여 스톡 농도(재료 표)의 마이크로버블 용액 100μL를 역궤도로 주입합니다.
참고: 기포가 혈류에서 순환하면 상당한 신호 손실 없이 이미지를 촬영할 수 있는 시간이 제한되어 있습니다(~10분). - 마우스의 눈에 눈 보호 로션을 한 방울 떨어 뜨립니다.
알림: 이물질이 동물의 혈류에 도달하는 것을 방지하기 위해 안와 후부 주사를 수행할 때까지 눈 윤활제를 바르지 않는 것이 좋습니다. 따라서 제모 크림 도포는 눈에 너무 가까이 가지 않도록 천천히 조심스럽게 수행해야 합니다(단, 뇌졸중이 예상되는 관심 영역을 노출시키기에 충분함). 헤어 크림 제거는 미리 물에 적신 면봉으로 수행되어 크림이 떨어지는 것을 방지하여 눈을 손상시킬 수 있습니다.
4. 파우샛 이미징
참고: 이것은 뇌졸중 후 뇌의 반대쪽 및 측측 영역을 이미지화하기 위해 수행됩니다
- 마우스를 통합 PAUSAT(Table of Materials) 이미지 플랫폼으로 옮기고 마우스를 맞춤형 램프의 앙와위 위치에 놓습니다(그림 2C).
- 음향 결합을 위해 이미징 창 표면에 충분한 증류수를 채웁니다.
참고: 3D 프린터를 사용하여 인쇄된 옵션 램프는 이미지 획득 중에 동물의 몸이 젖는 것을 방지하고 동물의 편안함을 향상시키는 것이 좋습니다. 또한 안정적인 체온을 유지하는 데 도움이 됩니다. 또한 램프를 수동 스테이지(재료 표)에 부착하여 마우스 헤드를 기준으로 이중 요소 워블러 변환기의 초점 깊이를 조정할 수 있습니다. 사용자 램프 설계 파일은 작성자의 요청에 따라 사용할 수 있습니다. - 마우스 헤드를 치아 홀더에 고정하고 적절한 마취와 공기 흐름을 보장합니다.
- 가열 램프와 온도 조절 장치에 연결된 직장 프로브를 사용하여 동물의 체온을 37 °C로 유지합니다.
- 이미징 응용 프로그램(재료 표)을 열고 B 모드 초음파로 이동합니다.
- 라이브 초음파 창을 사용하여 마우스 헤드를 원하는 위치로 수동으로 조정합니다.
- 라이브 초음파 창을 사용하여 스테이지의 높이를 조정하여 변환기의 초점 깊이(19mm)가 이미지화할 영역의 대략 중간에 오도록 합니다.
- B 모드 초음파를 사용한 이미징
- B 모드에서 초음파 전송 주파수 값을 조정합니다(이 연구에서는 16MHz 사용).
- 이미징 응용 프로그램에 저장 디렉토리 정보를 입력합니다.
- 플로팅 박스를 사용하여 뇌의 B 모드 스캔을 위해 원하는 영역을 선택합니다.
- Acquire Static 버튼을 누릅니다.
- 이미지 획득이 완료되면 애플리케이션에서 스캔 결과를 확인하여 원하는 영역이 이미지화되었는지 확인합니다.
참고: AA의 혈류에 충분히 높은 농도의 미세 기포가 남아 있도록 B 모드 이미징 획득에서 불필요한 지연을 피하십시오.
- AA를 사용한 이미징
- 이미지 획득으로 돌아갑니다.
- 이미징 응용 프로그램에서 Acoustic Angiography 모드로 변경합니다(재료 표).
- 원하는 스캔 프로토콜 매개 변수를 입력하십시오 (가장 중요한 것은 프레임 간격과 위치 당 프레임 수이며,이 연구를 위해 각각 0.2mm 및 10으로 설정됨).
- Acquire Static 버튼을 누릅니다.
참고: AA 획득은 B 모드 초음파보다 오래 걸립니다. - 스캔이 완료되면 Image Analysis (이미지 분석)에서 스캔 결과를 확인하여 이미지 품질이 예상과 같은지 확인합니다.
참고: AA 모드의 경우 뇌 내부의 다른 초점 깊이에서 두 번째 스캔을 반복하고 나중에 적절한 후처리로 이미지를 재결합하여 보다 대표적인 전뇌 볼륨을 얻을 수 있습니다( 그림 3 참조).
- 광음향 단층 촬영을 이용한 이미징
- OPO(Optical Parametric Oscillator) 애플리케이션(재료 표)을 열고 756nm로 설정합니다.
알림: OPO는 쉽게 보정에서 벗어날 수 있으므로 실험 전에 독립적인 분광계를 사용하여 OPO가 올바르게 보정되었는지 확인하십시오. - 선형 배열 변환기를 이전에 결정된 좌표로 수동으로 변환하여 워블러 볼륨과 선형 어레이 볼륨이 자동으로 공동 등록되도록 합니다.
참고: 팬텀 그리드를 사용한 공동 등록 실험을 미리 수행하여 스테이지를 변환하는 데 필요한 정확한 거리를 결정하여 두 변환기의 결과 데이터가 3D로 공동 등록되도록 하는 것이 중요합니다. - 레이저 응용 프로그램을 열고 532nm 레이저를 켭니다.
- 레이저 파워 미터를 사용하여 레이저 출력의 에너지를 측정하고 원하는 에너지인지 확인합니다(이 연구에는 펄스당 ~10mJ가 사용됨).
- PAT에 대해 원하는 스캔 매개변수(0.4mm 스텝 크기, 20mm 스캔 길이 및 위치당 평균 10프레임)를 선택합니다.
- 초음파 데이터 수집 시스템 MATLAB 프로그램(재료 표)을 열고 실행 버튼을 누릅니다.
- 시작 버튼을 눌러 PAT 스캔을 획득합니다.
- 스캔이 완료되면 MATLAB 저장 프로그램을 엽니다. 저장 이름을 원하는 파일 이름으로 변경하고 실행 버튼을 누릅니다.
- OPO 파장을 798nm로 변경하고 4.10.3에서 4.10.8까지 단계를 반복합니다.
참고: 종단 연구의 경우 동물을 인큐베이터에 넣고 몇 시간 동안 관찰하여 회복할 수 있도록 하는 것이 좋습니다(1.1.18 및 1.1.19 단계에 따름). 결과 검증이 필요한 경우 PAUSAT 이미징 직후 섹션 5를 계속하십시오.
- OPO(Optical Parametric Oscillator) 애플리케이션(재료 표)을 열고 756nm로 설정합니다.
5. 선택 사항: 결과 검증
- 레이저 스페클 조영 영상(LSCI).
- 30% O 2/70% N 2 에서 1.5%-2.0% 이소플루란을 사용하여 동물을 마취시킵니다.
- 동물을 정위 프레임으로 설정하고 마스크와 위에서 언급 한 흡입 마취를 사용하여 동물을 마취시킵니다.
- 온수 재순환 히터와 직장 탐침을 사용하여 동물을 37°C로 유지하여 동물의 체온을 측정합니다.
- 마우스의 눈에 눈 보호 로션을 한 방울 떨어 뜨립니다.
- 동물의 뒤쪽 발을 약간 꼬집어 통증이 없는지 확인하십시오.
- 헤어 트리머를 사용하여 동물의 두피에있는 머리카락을 제거하십시오.
- 포비돈 요오드가 함유된 면봉을 사용하여 수술 부위를 소독한 다음 70% 에탄올이 함유된 멸균 패드를 사용하여 수술 부위를 소독합니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
- 두피의 중간 라인에 1.4mm 시상 절개를하고 두개골을 노출시킵니다. 집게를 사용하여 두피를 잡고 스캔할 뇌 영역을 차지하지 않도록 합니다.
- 두개골에 식염수 몇 방울을 바르고 레이저 스페클 조영 시스템 장치(재료 표)를 동물의 머리 위에 놓습니다.
- File 메뉴에서 장치를 하위 메뉴인 Working Mode에 포함된 Online 모드로 설정합니다.
- 파일 메뉴와 저장 설정 하위 메뉴에서 기본 이미지 저장 폴더를 선택합니다.
- 광원 메뉴에서 유도 레이저("레이저 켜짐")와 백색광("백색광 켜짐")을 연결하여 이미징 창을 올바른 위치에 배치합니다.
- Setting( 설정 ) 메뉴에서 확대 설정(Magnification settings)을 선택하고 커서를 수동으로 2.5로 이동한 다음 Apply(적용 ) 및 OK(확인 )를 눌러 설정을 저장합니다.
- 메인 페이지의 상단 하위 메뉴에 있는 초점 표시줄을 수동으로 이동하여 초점을 조정합니다.
- Setting( 설정 ) 메뉴에서 Pseudo Color Threshold Setting(의사 색상 임계값 설정)을 선택하고 원하는 대로 임계값을 조정한 다음 Apply(적용 ) 및 OK( 확인 )를 눌러 설정을 저장합니다.
- 이미지를 캡처하기 전에 광원 메뉴에서 유도 레이저("레이저 꺼짐")와 백색광("백색광 꺼짐")을 분리합니다.
- 메인 페이지의 상단 하위 메뉴에서 재생 기호를 선택하여 이미지를 캡처합니다.
- 트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 염색
- 30% O 2/70% N2 중 5% 이소플루란을 사용하여 동물을 심층 마취시킨다.
- 동물이 호흡을 멈추면 날카로운 가위로 목을 베십시오.
- 머리 주위의 모든 피부와 목 부위의 근육을 제거하십시오.
- 두개골의 후두 부분이 정수리 뼈에 도달 할 때까지 시상 절단을하십시오.
- 혈관 아래 왼쪽과 오른쪽을 수평으로 절단(~5mm)합니다. 직선 집게를 사용하여 두개골의 후두골을 제거하십시오.
- 두개골의 전두엽 봉합사를 절단(~5mm)합니다.
- 두개골의 정중선(반구 사이)에 시상 절단(~10-15mm)을 하고 완전히 분리되었는지 확인합니다.
- 크기 #7 곡선 가위를 사용하여 두개골의 정수리 왼쪽과 오른쪽 뼈를 중앙에서 측면으로 제거합니다.
- 얼음처럼 차가운 5x PBS 1mL로 채워진 용기에 뇌를 옮기고 10분 동안 얼음 위에 두십시오.
- 뇌를 스테인리스 스틸 뇌 매트릭스(1mm 두께 섹션)로 옮깁니다.
- 일회용 면도날을 사용하여 뇌를 1mm 관상 절편으로 절개합니다(재료 표).
- 칼날을 옆으로 잡고 얼음처럼 차가운 1x PBS로 채워진 용기에 옮깁니다.
- 블레이드에서 섹션을 하나씩 조심스럽게 분리합니다.
- 뇌 조각을 1x PBS에 5mL의 2% TTC(재료 표, 3)가 들어 있는 직경 70mm 페트리 접시에 옮깁니다.
- 실온(R/T)의 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다.
- 15분 후 TTC를 버리고 포르말린 3mL로 교체한 후 R/T에서 최소 30분 동안 암실에서 배양합니다.
- 마지막으로, 뇌 조각을 투명 플라스틱 필름에 옮기고 향후 측정을 위한 참조로 스캔 이미지의 자를 포함하여 샘플을 스캔합니다.
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Representative Results
뇌의 혈관 형태 영상
AA는 공진 주파수에서 순환계의 미세 기포를 여기시키고 미세 기포의 초고조파 응답을 수신하여 혈관 형태 이미지를 생성합니다. 수동으로 조정 가능한 스테이지에 부착된 맞춤형 램프(그림 2C)를 사용하여 두 가지 다른 초점 깊이에서 AA 모드로 마우스 두뇌를 이미지화할 수 있습니다. 더 깊은 영역을 목표로 삼으면 더 많은 표면 영역(예: 대뇌 피질)이 더 낮은 분해능과 신호 강도를 나타내며(그림 3A), 그 반대의 경우도 마찬가지입니다(그림 3B). 그러나 두 개의 초점 깊이를 획득하고 결합함으로써 AA 이미지는 전체 관상 단면에 대한 정보를 제공할 수 있습니다(그림 3C, D). 또한 PAUSAT는 전동 스테이지를 사용하여 3차원을 따라 스캔함으로써 사용자가 정의한 관심 영역(ROI)을 포괄하는 일련의 관상 이미지를 등록할 수 있습니다. 이러한 일련의 이미지를 정렬하여 전체 뇌의 3D 표현 또는 사용자가 정의한 ROI를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 PAUSAT에 의해 획득된 이미지 편집의 3D 정보를 사용하여 다른 정량적 측정(예: 스트로크 볼륨)을 분석할 수 있음을 보여주는 추가 결과도 여기에 제공됩니다.
허혈성 뇌졸중 전후의 해부학적 및 기능적 평가
전임상 연구에서 PAUSAT 시스템의 잠재력을 설명하기 위해 여기에서 분석된 허혈성 뇌졸중 모델 중 하나인 pMCAO 또는 PT 뇌졸중을 받은 두 그룹의 동물을 연구했습니다. 이 두 스트로크 모델은 허혈성 영역이 생성되는 원리가 다릅니다. 간단히 말해서, pMCAO 모델에서 중대뇌 동맥은 전기 소작되어 이 동맥에서 뇌로의 혈액 공급을 차단합니다. 이 손상은 주변 조직이 허혈성이되어 뇌졸중의 영향을받는 부위를 확대하는 2 차 손상을 유발합니다. 뇌졸중 후 3일째에 pMCAO 뇌졸중 뇌를 영상화하기로 결정했는데, 이는 뇌졸중의 영향을 받을 것으로 예상되는 최대 면적에 도달하는 시간이기 때문입니다. 그러나 PT 뇌졸중에서는 뇌졸중의 영향을 받는 조직의 최대 면적이 첫날 이후에 달성되므로 뇌졸중이 수행된 후 1일째에 PT 뇌졸중을 이미지화하기로 결정했습니다. 우리 연구에서 이러한 시점을 선택했지만 PAUSAT는 원하는 시점에서 뇌졸중의 종단 모니터링에 사용할 수 있습니다.
먼저, 동물 머리의 정확한 위치를 확인하고 두개골과 뇌 사이의 공간적 한계를 식별하기 위해 B 모드 스캔을 획득했습니다(그림 4A 및 그림 5A). 영상화된 뇌의 가장 앞쪽 부분에는 두개골의 전두엽 봉합사가 기준점으로 포함됩니다. 왼쪽(반대쪽; CL) 및 우측(ipsilateral; IL) 반구는 뇌졸중 부위를 위치시키기 위해 다음 연구에서 정의되었다. AA 이미지는 순환하는 미세 기포의 신호를 표적으로 하여 혈관 구조에 관한 정보를 제공했습니다. 우리의 결과는 손상되지 않은 뇌(기준선)에서 두 반구가 손상이 없을 때 예상대로 유사한 혈관 분포를 나타낸다는 것을 보여줍니다(그림 4B 및 그림 5B). 두 개의 서로 다른 파장에서 얻은 PA 이미지를 기반으로 한 조직 산소화 맵 분포에 대해 유사한 결과가 관찰됩니다(그림 4C 및 그림 5C). 우리는 탈산소화 헤모글로빈에 대한 국소 최대 광학 흡수(756nm)와 탈산소화 및 산소화 헤모글로빈이 동일한 광흡수(798nm)를 나타내는 파장을 기반으로 두 가지 다른 파장을 평가하기로 결정했습니다20. 이 두 가지 상태의 헤모글로빈을 포착함으로써 조직 산소화를 정확하게 추정할 수 있습니다(그림 4D 및 그림 5D).
뇌에서 기준선 이미지를 획득한 다음 날, 우리는 이전 섹션에서 설명한 대로 동물에 대한 수술(pMCAO 또는 PT 뇌졸중)을 수행했습니다. 스트로크의 위치와 크기를 평가하기 위해 스트로크 후 특정 시점(그림 2A 참조)에서 새로운 이미지 세트를 획득했습니다. pMCAO에 노출된 마우스에서 얻은 AA 이미지는 피질의 오른쪽 측면에서 신호 강도의 현저한 감소를 보여줍니다(그림 4B). 동일한 영역은 PA 이미지에서 조직 산소화 맵의 감소를 보여주며, 이는 허혈성 영역을 시사합니다(그림 4D). 결과를 검증하기 위해 뇌졸중 동물로부터 이미지를 얻은 직후 뇌를 채취하고 TTC 염색을 수행하기로 결정했습니다. 우리의 결과는 뇌졸중으로 확인된 영역이 PAUSAT 및 잘 확립된 TTC 염색에 의한 결과와 비교할 때 유사하다는 것을 보여줍니다(그림 4B-E). 우리는 또한 여기에서 PAUSAT가 뇌졸중 유도 후 더 이른 시점(1일)에 평가된 뇌졸중의 두 번째 모델인 PT 뇌졸중을 사용하여 뇌의 뇌졸중 영역을 식별할 수 있음을 보여줍니다. 그림 5B에서 볼 수 있듯이, 우리는 혈류 공급이 감소하고 그에 따른 산소 포화도가 감소하는 피질의 상부 영역을 식별할 수 있었습니다(그림 5D). TTC 염색에서 얻은 결과는 이전에 PAUSAT에 의해 식별된 뇌졸중의 위치 및 크기와 일치합니다(그림 5B-E).
이미지화되는 마우스의 수명은 이미지 품질에 큰 영향을 줄 수 있습니다. 쥐의 두개골은 나이가 들면서 두꺼워지고, 두개골은 연조직에 비해 음향 임피던스가 크게 다르기 때문에 초음파의 많은 부분이 두개골 경계에서 반사됩니다. 이러한 통합 이미징 시스템은 모두 음향 기반이기 때문에 나이가 많은 마우스의 이미징 깊이가 감소합니다. 이것은 그림 6에서 명확하게 볼 수 있으며, 여기서 세 가지 다른 연령의 마우스가 동일한 조건에서 AA로 이미지화되었습니다. 이전에 설명된 대로 이미징 절차를 따르지 않는 경우에도 유사한 낮은 신호 결과가 예상됩니다.
PAUSAT에 의한 박출량의 정량적 분석
상술한 결과들에서 설명된 바와 같이, PAUSAT는 사용자에 의해 기술된 ROI를 타겟팅하는 일련의 관상 이미지들을 캡처한다. 서로 다른 관상 영상 내의 박출 면적과 영상 사이의 거리를 계산하여 박출량을 분석했다. PAUSAT에 의해 계산된 박출량은 TTC 염색 이미지를 사용하여 유사한 접근법을 기반으로 계산된 박출량과 비교하여 통계적 차이(p < 0.05)를 나타내지 않습니다(그림 7).
그림 3: 워블러 트랜스듀서의 초점 심도가 AA 이미지 품질에 미치는 영향. 여러 초점 깊이의 이미지를 획득하고 나중에 결합하여 최상의 전뇌 영상 결과를 생성할 수 있습니다. (A) 더 깊은 초점 깊이에서 획득한 AA 관상 섹션. (B) 더 표면적인 초점 깊이에서 획득한 AA 관상 절편. (C) 더 깊은 초점(녹색)과 더 표면적으로 초점이 맞춰진(자홍색) 이미지를 융합한 결과입니다. (D) (A) 및 (B)에 필적하는 픽셀 스케일 값으로 더 깊은 초점과 더 표면적으로 초점이 맞춰진 이미지를 결합한 결과. 이 수치는16에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: pMCAO 뇌졸중 전후 마우스 뇌의 대표적인 PAUSAT 결과 . (A) 기준선 및 뇌졸중 후 B 모드 초음파 관상 영상. (B) 기준선 및 뇌졸중 후 AA 관상 영상. (C) 756nm 여기에서의 기준선 및 뇌졸중 후 PA 관상 이미지. (D) 756nm 및 798nm 여기 이미지를 기반으로 한 산소 포화도 맵. (E) 동일한 뇌졸중 영역을 보여주는 마우스 뇌의 TTC 염색 섹션. 이미지 하단의 선 사이의 거리는 1mm를 나타냅니다. 이 수치는16에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: PT 뇌졸중 전후의 마우스의 대표적인 PAUSAT 결과 . (A) 기준선 및 뇌졸중 후 B 모드 초음파 관상 영상. (B) 기준선 및 뇌졸중 후 AA 관상 영상. (C) 756nm 여기에서의 기준선 및 뇌졸중 후 PA 관상 이미지. (D) 756nm 및 798nm 여기 이미지를 기반으로 한 산소 포화도 맵. (E) 동일한 뇌졸중 영역을 보여주는 마우스 뇌의 TTC 염색 섹션. 이미지 하단의 선 사이의 거리는 1mm를 나타냅니다. 이 수치는16에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 마우스 수명이 AA 이미지 품질에 미치는 영향. 이 그림은 비슷한 조건에서 서로 다른 연령의 동물을 이미지화할 때 AA 신호 강도와 이미징 깊이의 차이를 보여줍니다. 그림에서 볼 수 있듯이 나이가 많은 마우스(18개월) 이미징은 어린 마우스(1.5개월)에 비해 두개골의 크기와 두께로 인해 낮은 품질의 이미지를 생성하는 반면 성인 마우스는 중간 신호(6개월)를 나타냅니다. 두개골과 뇌 조직 사이의 큰 음향 임피던스 불일치로 인해 두개골을 통해 전파되는 초음파가 반사 및 굴절되어 신호 손실 및 해상도 저하를 초래합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 허혈성 뇌졸중의 부피 분석. (A) 유사한 관상 위치에서 PT 스트로크 및 해당 TTC 분할 이미지, AA 이미지 및 AA 분할 이미지의 TTC 섹션의 예. (B) pMCAO 및 PT 스트로크에 대한 TTC 및 AA 이미지를 기반으로 계산된 스트로크 볼륨으로 유의미한 차이가 없습니다(p > 0.05). 그래프는 평균 ± 표준 편차(S.D.)를 보여줍니다. (n = 그룹당 3마리). 이 수치는16에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 방법에는 잘못 수행할 경우 이미지 품질과 정량 분석이 크게 저하될 수 있는 몇 가지 중요한 측면이 있습니다. PAUSAT 이미지에서 사용자 오류의 가장 일반적으로 발생하는 결과는 신호 부족 또는 매우 낮은 신호 강도이며, 둘 다 다양한 이유로 발생할 수 있습니다. 그러한 이유 중 하나는 음향 커플 링의 문제입니다. 이미징 중 마우스 머리를 둘러싼 물의 큰 기포는 종종 초음파가 변환기로 이동하거나 변환기에서 이동하는 것을 차단하여 시스템의 세 가지 방식 모두에 대한 결과 이미지에 그림자 영역을 유발할 수 있습니다. 이는 시스템 멤브레인과 이미징할 샘플 사이에 충분한 물이 존재하도록 함으로써 방지할 수 있습니다. 또한 AA 신호가 부족하지만 사용된 파장과 무관하게 놀라울 정도로 높은 PA 신호가 발생할 수도 있습니다. 이것은 빛의 흡수를 방해하는 머리카락, 특히 검은 머리카락의 존재 때문일 수 있습니다. 이를 피하려면 머리카락이 육안으로 식별 할 수있을 때까지 동물의 머리를 미리 면도해야합니다.
AA 이미지와 관련하여 발생할 수 있고 신호가 부족하거나 매우 낮은 또 다른 문제는 순환계에 존재하는 낮은 농도의 미세 기포입니다. 미세 기포가 너무 희석되거나 부적절하게 주입되면 결과 신호가 매우 약해집니다. 역궤도 주입은 잘 훈련된 직원만 수행해야 합니다. 또 다른 이유는 미세 기포 주입과 이미징 시작 사이의 오랜 시간 때문일 수 있으며, 이는 혈류의 미세 기포를 감소시킬 수 있습니다. 이를 방지하기 위해 미세 기포를 주입하기 전에 이미징 시스템을 준비하여 주입 직후 동물을 PAUSAT 시스템 멤브레인으로 옮길 수 있도록 하는 것이 좋습니다. 동물이 이미 PAUSAT 시스템 멤브레인에 위치하면 대체 정맥 주사 경로(예: 꼬리 정맥 주사)를 사용하여 주사와 이미징 사이의 시간을 단축할 수 있다는 점을 언급할 가치가 있습니다. 추가적으로, 가능한 최대 마이크로버블 농도를 유지하기 위해, PA 이미징 전에 AA 이미징을 수행하는 것도 권장된다.
필요한 단계가 제대로 수행되지 않은 경우에도 PA 신호가 영향을 받을 수 있습니다. 문제 중 하나는 여기 레이저의 품질과 관련이 있습니다. 레이저 소스를 설명하는 두 가지 주요 구성 요소는 펄스 에너지와 파장입니다. 독립적인 전력계와 분광계를 사용하여 이러한 양을 측정하고 원하는 값으로 설정되었는지 확인하는 것이 좋습니다. 잘못된 값을 가정하면 함수 계산에서 잘못된 결과를 제공합니다.
AA 및 PA 이미지가 결합될 때 정렬되지 않을 수도 있습니다. 그 주된 이유는 변환기 사이에 설정된 좌표가 정확하지 않았기 때문입니다. 이를 방지하려면 AA 및 PA 이미지의 성공적인 공동 등록을 위한 정확한 좌표를 결정하기 위해 미리 팬텀 그리드를 사용하여 필요한 실험을 수행하는 것이 중요합니다. 부정확성의 또 다른 잠재적 원인은 OPO의 잘못된 보정 때문입니다. 이를 완화하려면 독립적인 분광계를 사용하여 OPO를 올바르게 보정해야 합니다.
특히 이 통합 시스템의 PAT 구성 요소의 이미지 품질과 관련하여 상당한 개선 영역이 남아 있습니다. 현재 PAT 시스템은 스캐닝 선형 어레이 구성을 기반으로 합니다. 우리는 여러 뇌졸중 마우스 모델을 사용하여 경색과 뇌의 건강한 영역의 산소 공급에서 대규모 차이를 관찰할 수 있지만 자세한 혈관 구조(미세혈관)는 볼 수 없습니다. 이 낮은 이미지 품질에 기여하는 두 가지 주요 문제가 있습니다. 첫 번째는 제한된 시야 문제입니다. PAT에서 샘플의 전체 보기 재구성 이미지를 생성하려면 검출기가 물체를 완전히 둘러싸야 합니다(또는 입체각이 4π여야 함). 그러나 실험 환경에서는 이것이 어렵습니다. 이로 인해 시야 제한 문제가 발생하여, 트랜스듀서 어레이와 직교하는 혈관이 검출될 수 없게 된다(21). 선형 배열 PAT에서 제한된 시야 문제의 영향을 줄이기 위한 솔루션이 존재하며, 그 중 가장 유망한 것은 가상 포인트 소스(22)로서 마이크로버블을 사용하는 것이다. 선형 배열 PAT의 두 번째 문제는 음향 렌즈의 초점이 약하기 때문에 고도 해상도와 감도가 낮다는 것입니다. 그러나 선형 어레이 시스템의 하드웨어 설계에서 단일 슬릿 회절을 사용하면 선형 어레이 PAT23,24에 대한 등방성 분해능과 감도가 생성되는 것으로 나타났습니다. 딥 러닝 접근 방식은 또한 선형 배열 PAT25,26,27의 제한된 뷰 문제와 열악한 고도 분해능을 부분적으로 해결하는 것으로 나타났습니다. 이러한 솔루션의 조합은 통합 이미징 시스템의 PAT 구성 요소의 이미지 품질을 크게 향상시킬 것입니다.
여기에서 우리는 전임상 환경에서 허혈성 뇌졸중의 구조적 및 기능적 정량화를 위한 새로운 비침습적 다중 모드 이미징 방법을 제시했습니다. AA를 통해 마우스 뇌의 혈관에 대한 명확한 형태 및 관류 매핑이 가능합니다. 국부적으로 정의된 신호 부족은 혈액 관류가 감소하는 경색 영역을 나타낼 수 있으며, 이를 통해 경색 부피를 비침습적으로 및 세로로 추정할 수 있습니다. PAT를 통해 뇌졸중 부위 안팎에서 헤모글로빈의 산소포화도를 측정하여 경색 부위의 뇌 조직의 저산소 상태를 알 수 있습니다. 이 전뇌 영상 방법은 작은 동물 MRI와 같은 일부 대안에 비해 비용이 저렴합니다. 또한 다른 전임상 이미징 장치가 달성할 수 없는 심부 조직의 기능적 및 구조적 정보를 결합할 수 있습니다. 조직학적 분석과 비교하여 이 방법을 사용하면 단일 종점이 아닌 여러 시점에서 이러한 메트릭을 종단적으로 측정할 수 있습니다. 그렇게 할 수 있는 능력은 허혈성 뇌졸중의 전임상 연구에서 전례 없는 정량적 세부 사항을 제공할 것입니다. 또한, 이 시스템의 구조적 및 기능적 이미징 기능은 허혈성 뇌졸중 이후의 많은 전임상 연구에 적용될 수 있다28. 혈관계에 영향을 미치는 모든 질병 상태 또는 생물학적 현상은 PAUSAT를 사용하여 심층적으로 연구할 수 있으므로 다른 많은 전임상 분야(예: 암)로 번역할 수 있는 강력한 전임상 영상 도구가 됩니다.
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Disclosures
저자는 이 작업에 대한 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 기술 지원에 대해 SonoVol Inc.의 엔지니어링 팀에 감사드립니다. 이 연구는 미국 심장 협회 협력 과학 상 (18CSA34080277)이 J. Yao와 W. Yang에게 부분적으로 후원했습니다. 미국 국립 보건원 (NIH)은 R21EB027981, R21 EB027304, RF1 NS115581 (BRAIN Initiative), R01 NS111039, R01 EB028143; 미국 국립 과학 재단 (NSF) CAREER 상 2144788; Chan Zuckerberg Initiative Grant (2020-226178), J. Yao에게; NIH는 W. Yang에게 R21NS127163와 R01NS099590 부여합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 GA catheter | BD Insyte Autoguard Winged | 381534 | For mouse intubation |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 | Necessary for TTC-staining brain for validation |
| 532nm Laser | Quantel | Q-smart 850 | Laser used to pump the OPO for PAT |
| Automatic Ventilator Rovent Jr. | Kent Scientific | RV-JR | To keep mice under anesthesia during surgical procedure |
| Black braided silk 4-0 USP | Surgical Specialties | SP116 | Used for sutures on the neck for pMCAO surgery |
| Bupivacaine | Hospira | 0409-1159-18 | Used prior to closing wounds during surgical procedure |
| C57BL/6 Mice | Jackson Lab | #000664 | Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female) |
| Clear suture | Ethicon | 8606 | Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT |
| Cold Light LED | Schott | KL 1600 | Needed to create PT stroke |
| Disposable Razor Blade | Accutec Blades | 74-0002 | For sectioning mouse brain |
| Electric drill | JSDA | JD-700 | Used to expose MCA during pMCAO procedure |
| Electrocauterization tool | Wet-Field | Wet-Field Bipolar-RG | Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure |
| Hair removal gel | Veet | 8282651 | Used to remove hair from mouse prior to imaging |
| High Temperature Cautery Loop Tip | BOVIE Medical Corporation | REF AA03 | Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull |
| IR Detector Card | Thorlabs | VRC5 | Used to ensure light path is aligned |
| Laser Power Meter | Ophir | StarBright, P/N 7Z01580 | Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging |
| Laser Speckle Imaging System | RWD Life Science Co. | RFLSI-III | Can be used to validate stroke surgery success |
| Lubricant Eye Ointment | Soothe | AB31336 | Can be used to avoid drying of the eyes |
| Manually adjustable stage | Thorlabs | L490 | Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging |
| Modified Vega Imaging System | Perkin Elmer | LLA00061 | System containing both B-mode/AA and PAT transducers |
| Optical Parametric Oscillator | Quantel | versaScan-L532 | Allows for tuning of excitation wavelength in a large range |
| Programmable Ultrasound System | Verasonics | Vantage 256 | Used for PAT part of system |
| Rose Bengal | Sigma | 330000 | Necessary to induce PT stroke |
| Suture | LOOK | SP116 | Used for permanent ligation of CCA |
| Temperature Contoller | Physitemp | TCAT-2 | Used to maintain stable body temperature of mice during procedures |
| VesselVue Microbubbles | Perkin Elmer | P-4007001 | Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL) |
References
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