Summary
Et normoterm ex vivo leverperfusion (NEVLP) system blev oprettet til muselever. Dette system kræver erfaring med mikrokirurgi, men giver mulighed for reproducerbare perfusionsresultater. Evnen til at udnytte muselever letter undersøgelsen af molekylære veje til at identificere nye perfusatadditiver og muliggør udførelse af eksperimenter med fokus på organreparation.
Abstract
Denne protokol præsenterer et optimeret erythrocytfrit NEVLP-system ved hjælp af muselever. Ex vivo-konservering af muselever blev opnået ved at anvende modificerede kanyler og teknikker tilpasset fra konventionelt kommercielt ex vivo-perfusionsudstyr. Systemet blev brugt til at evaluere bevaringsresultaterne efter 12 timers perfusion. C57BL/6J-mus fungerede som leverdonorer, og leveren blev plantet ved at kanylere portalvenen (PV) og galdegangen (BD) og efterfølgende skylle organet med varmt (37 °C) hepariniseret saltvand. Derefter blev de udplantede lever overført til perfusionskammeret og udsat for normoterm oxygeneret maskinperfusion (NEVLP). Indløbs- og udløbsperfusatprøver blev indsamlet med 3 timers mellemrum til perfusatanalyse. Efter afslutning af perfusionen blev leverprøver opnået til histologisk analyse med morfologisk integritet vurderet under anvendelse af modificeret Suzuki-score gennem hæmatoxylin-Eosin (HE) farvning. Optimeringseksperimenterne gav følgende resultater: (1) mus, der vejer over 30 g, blev anset for mere egnede til eksperimentet på grund af den større størrelse af deres galdegang (BD). (2) en 2 Fr (udvendig diameter = 0,66 mm) polyurethankanyle var bedre egnet til kanylering af portalvenen (PV) sammenlignet med en polypropylenkanyle. Dette blev tilskrevet polyurethanmaterialets forbedrede greb, hvilket resulterede i reduceret kateterglidning under overførslen fra kroppen til orgelkammeret. (3) til kanylering af galdegangen (BD) blev en 1 Fr (udvendig diameter = 0,33 mm) polyurethankanyle fundet mere effektiv sammenlignet med polypropylen UT - 03 (ydre diameter = 0,30 mm) kanyle. Med denne optimerede protokol blev muselever med succes bevaret i en varighed på 12 timer uden væsentlig indvirkning på den histologiske struktur. Hematoxylin-Eosin (HE) farvning afslørede en velbevaret morfologisk arkitektur i leveren, kendetegnet ved overvejende levedygtige hepatocytter med tydeligt synlige kerner og mild udvidelse af hepatiske sinusoider.
Introduction
Levertransplantation repræsenterer guldstandardbehandlingen for personer med leversygdom i slutstadiet. Desværre overstiger efterspørgslen efter donororganer det tilgængelige udbud, hvilket fører til en betydelig mangel. I 2021 var ca. 24.936 patienter på venteliste til et levertransplantat, mens kun 9.234 transplantationer blev udført med succes1. Den betydelige forskel mellem udbud og efterspørgsel efter levertransplantater understreger det presserende behov for at undersøge alternative strategier for at udvide donorpuljen og forbedre tilgængeligheden af levertransplantater. En måde at udvide donorpuljen på er at bruge marginale donorer2. Marginale donorer omfatter dem med fremskreden alder, moderat eller svær steatose. Selvom transplantation af marginale organer kan give gunstige resultater, forbliver de samlede resultater suboptimale. Som følge heraf er udviklingen af terapeutiske strategier, der tager sigte på at forbedre marginaldonorernes funktion, i øjeblikket i gang 3,4.
En af strategierne er at bruge maskinperfusion, især normoterm oxygeneret maskinperfusion, for at forbedre funktionen af disse marginale organer5. Der er dog stadig en begrænset forståelse af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for de gavnlige virkninger af normoterm oxygeneret maskinperfusion (NEVLP). Mus, med deres rigelige tilgængelighed af genetisk modificerede stammer, tjener som værdifulde modeller til undersøgelse af molekylære veje. For eksempel er betydningen af autofagiveje til at afbøde leveriskæmi-reperfusionsskade i stigende grad blevet anerkendt 6,7. En vigtig molekylær vej i leveriskæmi-reperfusionsskaden er miR-20b-5p / ATG7-vejen8. I øjeblikket er der en række ATG-knockout- og betingede knock-out-musestammer tilgængelige, men ingen tilsvarende rottestammer9.
Baseret på denne baggrund var målet at generere en miniaturiseret NEVLP-platform til muselevertransplantater. Denne platform vil lette udforskningen og evalueringen af potentielle genetisk modificerede strategier, der har til formål at forbedre donorleverens funktionalitet. Derudover var det vigtigt, at systemet var egnet til langvarig perfusion, hvilket muliggør ex vivo-behandling af leveren, almindeligvis omtalt som "organreparation".
I betragtning af den begrænsede tilgængelighed af relevante in vitro-data om perfusion af muselever fokuserede litteraturgennemgangen på studier udført på rotter. En systematisk litteratursøgning fra 2010 til 2022 blev udført ved hjælp af nøgleord som "normoterm leverperfusion", "ex vivo eller in vitro" og "rotter". Denne søgning havde til formål at identificere optimale forhold hos gnavere, så vi kunne bestemme den mest hensigtsmæssige tilgang.
Perfusionssystemet består af et forseglet vandkappet glasbufferreservoir, en peristaltisk rullepumpe, en oxygenator, en boblefælde, en varmeveksler, et orgelkammer og et lukket cykelslangesystem (figur 1). Systemet sikrer præcis vedligeholdelse af en konstant perfusionstemperatur på 37 °C ved hjælp af en dedikeret termostatisk maskine. Den peristaltiske rullepumpe driver strømmen af perfusat gennem kredsløbet. Perfusionskredsløbet starter ved det isolerede vandkappede reservoir. Derefter ledes perfusatet gennem oxygenatoren, som modtager en gasblanding af 95% ilt og 5% kuldioxid fra en dedikeret gasflaske. Efter iltning passerer perfusatet gennem boblefælden, hvor eventuelle indesluttede bobler omdirigeres tilbage til reservoiret af den peristaltiske pumpe. Det resterende perfusat strømmer gennem varmeveksleren og kommer ind i orgelkammeret, hvorfra det vender tilbage til reservoiret.
Her rapporterer vi vores erfaringer med at etablere en NEVLP til muselever og deler de lovende resultater af et piloteksperiment udført ved hjælp af det iltede medium uden iltbærere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg blev udført i henhold til gældende tyske regler og retningslinjer for dyrevelfærd og ARRIVE-retningslinjerne for rapportering af dyreforsøg. Dyreforsøgsprotokollen blev godkendt af Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Thüringen, Tyskland (godkendelsesnummer: UKJ - 17 - 106).
BEMÆRK: C57BL/6J-hanmus, der vejede 34 ± 4 g (gennemsnitlig ± standardfejl for den gennemsnitlige [SEM]), blev anvendt som leverdonorer. De blev vedligeholdt under kontrollerede miljøforhold (50% fugtighed og 18 - 23 °C) med fri adgang til standard musechow og vand. Under hele det kirurgiske indgreb blev respirationsfrekvensen på over 60 vejrtrækninger/min opretholdt, og kropstemperaturen blev holdt over 34 °C.
1. Forberedelse
- Opsætning af operationstabellen
- Autoklave alle kirurgiske instrumenter og forbrugsstoffer til steriliseringsformål.
- Tænd for alt udstyr, inklusive varmebrættet og elektrokoagulation.
- Anbring en 50 ml sprøjte med 25 ml hepariniseret (2.500 E/L) saltvand i en varm inkubator (37 °C).
- Placer de kirurgiske instrumenter, 6 - 0 silkesutur, steril lille bomuldsapplikator, veterinær saltvand (500 ml) og ikke-vævede gazesvampe (10 cm x 10 cm) på operationsbordet korrekt.
- Anbring en 26 G kanyle på operationsbordet for at skabe et lille hul i låget på 0,5 ml mikrocentrifugerøret til modtagelse af galderøret til galdeopsamling.
- Anbring kanylen (1 Fr polyurethankanyle eller UT - 03 polyethylenkanyle) og et steriliseret 0,5 ml mikrocentrifugerør til galdeopsamling på operationsbordet.
- Selvfremstillet portal venekanyle
- Hold 2 Fr kanylen med tang og punktere væggen med en 30 G nål i en afstand af 1 cm fra kanylens ende. Tryk nålen gennem kanylen, indtil spidsen af nålen bliver synlig.
- Trim spidsen af kanylen, hvilket resulterer i en skarp trekant.
- Fremstilling af hepariniseret saltvand
- Forbered 25 ml hepariniseret saltvand med en slutkoncentration på 2.500 IE / ml.
- Fjern alle luftbobler og anbring sprøjten i inkubatoren for 40 °C.
- Demonstration af perfusionssystemet
- Se figur 1 for hovedkomponenterne i maskinens perfusionssystem.
- Opstilling af orgelkammeret
- Se figur 2 for orgelkammerets indretning.
- Opsætning af perfusionssystemet
- Tænd for laboratoriediagramprogrammet til trykovervågning.
- Tilslut trykkalibrator og tryksensor på orgelkammerniveau.
- Juster trykkalibratoren til at læse 0 mmHg, og kontroller den tilsvarende værdi på trykreguleringssoftwaren.
- Juster trykkalibratoren til at læse 20 mmHg, og kontroller igen den tilsvarende værdi på trykreguleringssoftwaren.
- Tænd for vandbadet, og forvarm orgelkammeret til 40 °C.
- Skyl hele VVS-systemet to gange med destilleret deioniseret vand i 30 minutter hver, hvilket sikrer fuldstændig fjernelse af desinficeringsopløsningen.
- Start cirkulationen af desinfektionsopløsningen gennem hele systemet i en varighed på 20 minutter for at sikre grundig desinfektion.
- Tænd for gasblandingen (95% ilt (O2) og 5% kuldioxid (CO2).
- Perfusat påfyldning
- Supplement 250 ml Williams 'E-medium med 50 ml føtalt bovint serum, 3 ml penicillin / streptomycin (1 mg / ml), 0,17 ml insulin (100 IE / ml), 0,34 ml heparin (5000 E / ml) og 0,07 ml hydrocortison (100 mg / 2 ml) for at forberede det komplette Williams 'E-medium.
- Tilsæt lige store mængder (150 ml) perfusat til reservoiret og orgelkammeret for at prime systemet.
BEMÆRK: Der skal lægges særlig vægt på at opretholde sterilitet under påfyldningsprocessen. Perfusatet pumpes konstant gennem disse to nøglekomponenter i den lukkede recirkulationsmaskineperfusion. - Tænd for den peristaltiske pumpe ved medium hastighed (15 ml/min) for at klargøre perfusionssystemet med det iltede medium.
2. Levereksplantation
- Forberedelse før operationen
- Væg dyret. Forbered det smertestillende middel buprenorphin (0,3 mg/ml) (0,05 mg/kg legemsvægt).
- Tilslut induktionskammeret med stikkontakten. Skru ilt til 0,5 l / min. Drej isofluran til 3%.
- Placer dyret i kammeret, indtil dyb anæstesi (oprettende reflekspositiv) er nået.
- Brug en mikrosprøjte til at anvende legemsvægttilpasset dosis analgesi subkutant.
- Brug en elektrisk barbermaskine til at trimme pelsen på mavehuden.
- Overfør musen til operationsbordet, og tænd isofluranfordamperen til 2,5% for at opretholde anæstesi. Bekræft dybden af anæstesi ved at teste den interdigitale tårefleks.
- Forberedelse af musens underliv
- Placer musen i liggende stilling.
- Test interdigital refleks for at dobbeltbekræfte den passende dybde af anæstesi. Fastgør alle fire lemmer med tape.
- Desinficer begge sider af maven til den midterste aksillære linje ved hjælp af tre på hinanden følgende runder jodalkohol. Brug ikke-vævet steriliseret gasbind til at dække området omkring det kirurgiske felt.
- Lav et 3 cm tværgående snit 1 cm under xiphoiden i musens abdominale område ved hjælp af Metzenbaum baby saks og kirurgiske tang.
- Udvid hudsnittet bilateralt til den midaxillære linje på begge sider.
- Lav forsigtigt et 2 cm langsgående snit langs linea alba ved hjælp af fjedersaks.
- Skær gennem mavemuskellaget med elektrokoagulation og Vannas fjedersaks.
- Placer forsigtigt et stykke vådt gasbind for at beskytte leveren mod elektrokoagulation.
- Brug en 6 - 0 silkesutur med den runde nål til at trække xiphoidprocessen tilbage for bedre eksponering af koronarbåndet.
- Brug to ribben retraktorer til fuldt ud at udsætte musens bukhule.
- Flyt forsigtigt tyndtarmen ud af bukhulen med en våd vatpind for fuldt ud at udsætte hilum.
- Fælles galdegang forberedelse
- Transekter de falciforme, phreniske og gastrohepatiske ledbånd med skarp saks.
- Frigør forsigtigt den fælles galdegang ved hjælp af fine buede tang uden tænder.
BEMÆRK: Den fælles galdegang beskadiges meget let og går i stykker. Når den går i stykker, kan den ikke kanyleres. På grund af retningen af den anatomiske position er buede tang bedre at bruge. - Placer to 6 - 0 silkesutursløjfer over den fælles galdegang som forberedelse til næste trin.
- Fælles galdegangskanulering
- Punktering forsigtigt galdegangen med en 30 G nål. Brug spidse buede tang til at forstørre det lille hul, så det passer til galdegangskanuleringen.
- Brug karkanyleringstang til at gribe fat i galdegangskanulen og skubbe den ind i galdegangen.
- Fastgør kanylen dobbelt med de forudindstillede 6 - 0 sutursløjfer.
BEMÆRK: Under kanyleringen mærkes modstand ved galde. Hvis kraften ikke er godt kontrolleret, vil kanylen blive skubbet ud af galdevejen ved trykket af galdeudstrømningen. Juster forsigtigt kanylens dybde. Hvis det er for dybt, kan det beskadige galdegangen, og hvis det ikke er dybt nok, kan det glide ud. - Overhold galdestrømmen i kanylen efter vellykket kanylering.
- Forberedelse af portalvene
- Klem portalvenen med flade tang og frigør forsigtigt bindevævet med buede tang. Træk ikke hårdt for at undgå at forårsage rivning af portalvenen. Når portalvenen er beskadiget, er det vanskeligt at genkannulere portalvenen.
- Disseker PV lige bedre end bifurcationen, og placer den første sutursløjfe ved hjælp af 6 - 0 silkesutur på PV tæt på sammenløbet til senere brug.
- Placer den anden sutursløjfe til senere fiksering af PV så tæt på leverhylsteret som muligt.
- Kanylering af portalvene
- Brug et arterielt klip til at lukke den distale portalvene.
- Meget omhyggeligt punkteres portalvenen med en af de ovennævnte portalvenekanyler. Blodgennemstrømningen kan tydeligt observeres i kanylen efter en vellykket punktering.
- Fastgør PV-kanylen med den forudplacerede 6 - 0 sutursløjfe.
- Lever rødme
- Forøg isofluran til 5% og aflive musen med en overdosis isofluraninhalation.
- Tag forvarmet heparinsaltopløsning fra inkubatoren. Fjern alle luftbobler dannet inde i det hepariniserede saltvand.
- Fastgør sprøjten med forvarmet hepariniseret saltvand i sprøjtepumpen.
- Tilslut sprøjtepumpens forlængerrør til kanylen i portalvenen, juster hastigheden til 2 ml / min, og start leverskylningen.
- Overhold leverens farve ved afslutningen af skylleproceduren. Punktafgifter leveren, når farven bliver til en homogen gul.
- Transekter membranen, suprahepatisk ringere vena cava, infrahepatisk vena cava, leverarterie, distal portalvene og eventuelt resterende bindevæv.
- Læg leveren i petriskålen.
3. Lever- og kammerforbindelse
- Overførsel af lever
- Overfør forsigtigt leveren til orgelkammeret ved hjælp af en petriskål.
- Opbevar en lille mængde saltvand i petriskålen for at forhindre, at leveren tørrer ud.
BEMÆRK: Portalvene og galdegang kan let vrides under denne procedure, hvilket kan påvirke leverperfusion og galdeopsamling.
- Portal vene kanyle forbindelse
- Tilsæt langsomt normalt saltvand i portalvenekanylen med en sprøjte for at evakuere luftboblerne i kanylen.
- Tilslut portalvenekanylen til perfusatudstrømningsrøret i orgelkammeret.
- Galdegang kanyle tilslutning
- Før musens galdegangskanule gennem ventilen på en gummihætte, der er forbundet med orgelkammeret.
- Indsæt galdegangskanulen i et forberedt 0,5 ml mikrorør med et lille hul i låget.
- Placer mikrorøret på ler uden for orgelkammeret.
4. Juster strømningshastigheden i henhold til PV-tryk
- Tænd for den peristaltiske pumpe fra 1 ml/min.
- Kontroller portalens venetrykaflæsning for at justere strømningshastigheden.
- Oprethold portalvenetrykket i det fysiologiske område mellem 7 - 10 mmHg ved at justere strømningshastigheden.
BEMÆRK: Den nominelle strømningshastighed kan variere lidt afhængigt af brugen og placeringen af rørene.
5. Indsamling af prøver
- Der udtages indløbsperfusatprøver fra portalvenens indstrømningsrør og udløbsperfusatprøver fra orgelkammeret med 3 timers mellemrum.
- Saml prøver fra alle leverlobes til histologisk analyse ved afslutningen af perfusionsperioden på 12 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etablering af kirurgisk procedure
I alt 17 dyr blev brugt til dette forsøg: 14 mus blev ansat til at optimere organudtagningsprocessen, herunder kanylering af portalvenen (PV) og galdegangen (BD), mens 3 mus blev brugt til at validere proceduren (tabel 1). Histologiske resultater (figur 3) blev sammenlignet for at lette identifikationen af den optimale perfusionstilstand.
Udvælgelse af perfusat
Et tidligere anvendt hepatocytkulturmedium blev valgt til denne undersøgelse10,11. Williams E-medium blev oprindeligt designet af Williams og Gunn som et serumreduceret medium til langvarig in vitro-dyrkning af modne rotteleverepitelceller12. Ikke desto mindre har det også fundet nytte i at støtte vækst og vedligeholdelse af gnaverehepatocytter 13. Føtalt bovin serum (FBS) er et udbredt cellekulturtilskud på grund af dets rige sammensætning af essentielle næringsstoffer og vækstfaktorer, der letter cellevækst, proliferation og levedygtighed14. Komplet Williams E-medium blev anvendt som perfusat (tabel 2), som suppleres med 20% føtalt bovint serum, 1% penicillin/streptomycin, 5.000 E/l heparin, 50 E/l insulin og 0,010 g/l hydrocortison.
Valg af kanyle
Kanyleringsproceduren involverede først kanylering af galdegangen (BD) til galdevæskeopsamling, efterfulgt af kanylering af portalvenen (PV). Til BD-kanylering blev der oprindeligt anvendt et UT-03 polypropylenrør med en ydre diameter på 0,3 mm og en indvendig diameter på 0,18 mm. På grund af bekymringer vedrørende potentiel BD-skade og den højere risiko for utilsigtet kateterforskydning forbundet med den trimmede og stive UT-03-spids blev der imidlertid foretrukket 1 Fr polyurethanrør. Polyuretanrørene med deres blødere materiale og reducerede glathed blev anset for mere egnede til BD-kanylering.
Oprindeligt blev en 26 G polypropylen intravenøs nålekanyle brugt til kanylering af portalvenen (PV). Imidlertid resulterede fjernelsen af nålen og efterfølgende fastgørelse af kanylen til perfusionsrøret i dannelsen af bobler, som havde potentialet til at blokere de intrahepatiske sinusoider. For at overvinde dette problem blev en indbygget kanyle konstrueret ved hjælp af en 30 G nål indsat i den distale 1 cm af en 2 Fr polyurethankanyle. Denne selvfremstillede "nålestyrede kanyle" blev derefter indsat i den distale PV over sammenløbet. Da kateteret blev placeret i PV, blev nålen langsomt trukket tilbage, samtidig med at røret blev ført frem. Enden af den selvfremstillede kanyle var forbundet med perfusionsrøret inde i kammeret. Brug af et blødt materiale i denne kanyleringsteknik gav en fordel ved at reducere risikoen for skade på fartøjets bagvæg.
Valideringsundersøgelser
Indløbs- og udløbsperfusatprøver blev underkastet bestemmelse af pH- og kaliumniveauer. De opnåede resultater (figur 4) blev derefter sammenlignet med de resultater, der blev rapporteret i nylige publikationer15,16,17. Tre muselever blev perfuseret med iltet og suppleret med Williams E-medium i 12 timer. I hele denne periode blev der kontinuerligt registreret et stabilt perfusionstryk på 7 - 10 mmHg. Den gennemsnitlige pH var relativt stabil i hele 12 timers perfusionen og lå mellem 7,3 og 7,7. De gennemsnitlige kaliumniveauer var også stabile i hele perfusionsperioden og lå mellem 5,9 og 6,8 mmol/l (figur 4). PV-strømningshastigheden blev holdt inden for et område på 0,8 - 1,2 ml/min/g afhængigt af brugen og placeringen af pumperør under forsøgsprocedurerne. Alle resultater observeret i museleverperfusion viste ligheder med tidligere rapporterede observationer i rotteleverperfusion (tabel 3).
Vævsprøver blev indsamlet fra tre lever (N = 3) og blev udsat for 12 timers perfusion ved hjælp af den optimerede protokol til HE-farvning efterfulgt af heldiasscanning. Hver leverlap blev scoret ved hjælp af en modificeret Suzuki-score (tabel 4). Den klassiske Suzuki score18 blev forstærket ved at inkorporere tre yderligere parametre: pyknosis af kerner, frigørelse af kar og tilstedeværelse af erytrocytter i sinusoider og store kar. Hver parameter blev klassificeret som fraværende (0), mild (1), moderat (2) og svær (3). En endelig score på 0 - 7 blev anset for at afspejle god bevaring, 8 - 14 blev taget som moderat bevaring, og 14 - 21 indikerede dårlig bevaring.
Konservering af museleveren blev vurderet ud fra den modificerede Suzuki-score. To medicinske eksperter gennemførte en uafhængig vurdering af morfologien af de syv lapper i de tre lever (figur 5, figur 6, figur 7). Gennemsnittet af de syv lap-scorer for hver leverlap blev beregnet; Lavere score indikerer en bedre bevaret lever. Eksperternes vurderinger viste en høj grad af overensstemmelse. Især selvom der blev observeret små forskelle i de scorer, der blev tildelt af de to eksperter, i vurderingen af pyknosis af kerner, påvirkede disse variationer ikke de samlede scoringsresultater signifikant.
I bedste fald var leverparenchymen relativt intakt med en velbevaret typisk lobulær struktur, der næppe kunne skelnes fra en normal lever. Hepatocytter syntes levedygtige med tydeligt synlige cellemembraner og runde kerner. Imidlertid gennemgik nogle kerner pyknosis, og nogle hepatiske sinusoider blev let udvidet, hvilket resulterede i en score på 4. (Figur 3, figur 6)
I værste fald blev den lobulære struktur forvrænget, med fartøjer løsrevet fra parenchymen og sammenflydende parenkymisk nekrose. På cellulært niveau blev cellulær vakuolisering og kerneryknosis tydelige, især i den pericentrale region. Desuden blev der observeret mild til moderat vakuolisering. Op til 30 % af hepatocytterne gennemgik nekrose, hvilket resulterede i en maksimal score på 14. (Figur 3, figur 7)
Tabel 1: Trin for trin etablering af en museleverperfusionsmodel. Forskellige komplikationer blev observeret under etableringsprocessen på grund af forskelle i kanylestørrelse, materiale og positionering. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Sammenligning af in vitro organkonserveringsmetoder 15,17,19,20,21,22. Optimering af perfusatvalg, iltbærervalg og sammenligning af ernæringsmæssige komponenter er afgørende under forskellige opbevaringsforhold. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 3: Hæmodynamik og blodgasanalyse hos normale rotter og rotter NEVLP 11,15,16,17,18,20,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31. De givne oplysninger beskriver selektivt de hæmodynamiske egenskaber ved rottelever og nøgleparametre for normoterm perfusion in vitro. Specifikt kan rotteleverperfusionen betragtes som optimal, når PV-trykket typisk varierer fra 4 til 10 mmHg, og partialtrykket af ilt i perfusat, der kommer ind i PV, varierer fra 80 til 550 mmHg, hvilket opfylder de nødvendige kriterier for vellykket in vitro rotteleverperfusion. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 4: Ændret Suzuki-score. Den modificerede Suzuki-score, der anvendes i denne undersøgelse, udvider den klassiske Suzuki-score ved at inkorporere tre yderligere parametre: pyknosis af kerner, frigørelse af kar og tilstedeværelsen af erytrocytter i sinusoider og store kar. Hver parameter blev tildelt en karakter på en skala fra 0 (fraværende), 1 (mild), 2 (moderat) eller 3 (alvorlig). Den samlede score, der spænder fra 0 til 8, indikerer god bevarelse; 9 til 16 foreslår moderat bevaring, og 17 til 24 indikerer dårlig bevaring. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 5: Valg af perfusatmedium, perfusatvolumen og perfusionstryk baseret på en litteraturoparbejdning af NEVLP hos rotter (2010-2022)3,8,10,14,17,19,27,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38,
39,40,41,42,43,44,45. Normothermisk maskinperfusion i rottelever kan udvise variabilitet på tværs af undersøgelser med hensyn til den specifikke type og volumen af perfusat, der anvendes, samt varigheden af perfusion. Forskellige undersøgelser kan anvende forskellige tilgange, såsom dialyse eller højvolumenperfusion, i længere perioder. På trods af disse forskelle viser parametre som portaltryk, portalvenestrømningshastighed og partialtryk af ilt i perfusatet generelt minimal variation på tværs af de forskellige anvendte metoder. Klik her for at downloade denne tabel.
Figur 1: Skematisk diagram over perfusionssystemet. Nøglekomponenterne er orgelkammeret, termostatmaskinen, rullepumpen, oxygenatoren og reservoiret. Perfusatet pumpes fra reservoiret af en peristaltisk pumpe ind i en oxygenator. Der er en uafbrudt gasstrøm på 95% O2 og 5% CO2 i oxygenatoren. Perfusatet passerer gennem boblefælden, hvor eventuelle luftbobler, der er til stede i perfusat, fanges og pumpes tilbage til reservoiret. Det resterende perfusat strømmer til orgelkammeret, hvor røret er forbundet med portalvenen. Perfusatudstrømningen fra orgelkammeret ledes tilbage til reservoiret af den peristaltiske pumpe. Et galdedrænrør er forbundet til orgelkammeret for at opsamle galde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Nærbillede af perfusionskammeret. Orgelperfusionskammeret består af et perfusat indløb og udløb, en boblefælde, en varmeveksler og en galdeopsamlingsport. Realtidsovervågning af perfusatpumpens tryk udføres ved hjælp af en tryksensor. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Histologiske resultater af normale og perfunderede muselever. (A) Normal muselevermorfologi (kontrol). (B) Eksempel på bedst bevarede morfologi som visualiseret ved HE-farvning efter 12 timers perfusion. (C). Eksempel på værst bevarede morfologi som visualiseret ved HE-farvning efter 12 timers perfusion. Den sorte pil angiver vakuolisering, den røde pil peger på sinusformet dilatation, den gule pil viser pyknosis af kerner og den grønne pil angiver vaskulær løsrivelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Perfusatanalyse. Ph (A) og kaliumniveauer (B). Begge parametre er stabile i hele observationstiderne på 12 timer, hvilket indikerer konstante perfusionsbetingelser Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Mindre leverskader, der resulterer i en modificeret Suzuki-score 4-7. Efter 12 timers NEVLP blev der udført en semikvantitativ vurdering af levermorfologi. Prøver fra hver leverlap blev vurderet og klassificeret separat, hvilket resulterede i et interval og en gennemsnitlig score for hver lever, hvor den højest mulige score var 4. Velbevaret levermorfologi med en score fra 4-7 afhængigt af leverlap (gennemsnit = 5) (Score 0-7: velbevaret levermorfologi, score 8-14 moderat bevaret morfologi, score 15-21: dårligt bevaret levermorfologi) Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Moderat leverskade, der resulterer i en modificeret Suzuki-score 7-14. Semikvantitativ vurdering af levermorfologi efter 12 timers normoterm oxygeneret maskinperfusion i henhold til den modificerede Suzuki-score. Moderat bevaret morfologi med en score fra 7 til 14 (gennemsnit = 11). (Score 0-7: velbevaret levermorfologi, score 8-14 moderat bevaret morfologi, score 15-21: dårligt bevaret levermorfologi) Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Mindre - moderat leverskade, der resulterer i en modificeret Suzuki-score 5-11. Den inhomogene perfusion resulterede i mindre til moderat bevaret morfologi i forskellige leverlobes med scorer fra 5 til 11 (gennemsnit = 8). (Score 0-7: velbevaret levermorfologi, score 8-14 moderat bevaret morfologi, score 15-21: dårligt bevaret levermorfologi) Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i protokollen
De to afgørende trin i levereksplantation er kanylering af portalvenen (PV) og den efterfølgende kanylering af galdegangen (BD). Disse trin er af afgørende betydning for at sikre vellykket organudtagning og efterfølgende perfusions- eller transplantationsprocedurer.
Udfordringer og løsninger
PV-kanylering giver tre udfordringer: skade på beholdervæggen, forskydning af kateteret og praktisk anvendelighed af indsættelsesprocessen. Den sarte karakter af PV-beholdervæggen gør den modtagelig for punktering og efterfølgende blødning, hvis den ikke håndteres omhyggeligt under kanylering. Desuden reducerer ethvert blodtab fra PV portaltrykket, hvilket gør indsættelse af PV-kanylen mere udfordrende. Desuden kan en skade på portalens venøse væg indføre luftemboli i det intrahepatiske vaskulære system. Derfor er det afgørende at udvise præcision og forsigtighed under PV-kanyleringsprocessen for at minimere risikoen for komplikationer.
Under PV-kanylering er risikoen for kateterforskydning et almindeligt problem, især når man bruger kanyler med glatte materialer. I sammenligning med polypropylen er brugen af polyurethankanyler mere gunstig til PV-kanylering. Den bløde og bøjelige karakter af polyurethan reducerer risikoen for kateterforskydning eller tab betydeligt, hvilket potentielt kan tilskrives dets materialeegenskaber. Derudover minimerer brugen af en blød kanyle sandsynligheden for at beskadige endotellaget af blodkar. I undersøgelsen blev tre typer vaskulære adgangskanyler, nemlig 24 G polypropylen, 26 G polypropylen og 2 Fr polyurethan, sammenlignet for PV-kanylering. Blandt disse muligheder viste både 26 G og 2 Fr polyurethankanyler bedre kompatibilitet med størrelsen på musens PV. Mens 26 G-kanylen udviste bedre anatomisk kompatibilitet, blev 2 Fr polyurethankanylen med en ydre diameter på 0,66 mm anset for egnet til den tilsigtede anvendelse på grund af dens unikke materialeegenskaber, hvilket effektivt minimerer risikoen for utilsigtet kateterløsrivelse fra PV.
Med hensyn til anvendeligheden af indsættelse blev forskellige teknikker testet. En måde er at klemme de proksimale og distale ender af PV, skære et lille hul med en fin saks og indsætte PV-kanylen. Denne teknik kræver involvering af en ekstra person på grund af kompleksiteten og kravet om samtidige handlinger. Derfor er det ikke muligt for en enkelt mikrokirurg at udføre proceduren uafhængigt. Derfor er der brug for et kateter med en indre nål og en ydre kanyle. Som beskrevet før medfører brug af den kommercielt tilgængelige stive og glatte 26 G polypropylenkanyle risikoen for at glide ud og risikere dannelse af luftbobler, når kanylen tilsluttes skyllesystemet. For at løse disse problemer blev der udtænkt et selvkonstrueret "nålestyret rørsystem" ved at indsætte en 26 G nål fra et nålekateter i en lang og bøjelig polyurethan 2 Fr-kanyle. Denne fremgangsmåde giver tre vigtige fordele: (1) et kateter-indsættelsessystem, (2) et langt og fleksibelt rør og (3) gunstige materialeegenskaber. I løbet af dette trin er det dog vigtigt at udvise forsigtighed for at forhindre, at nålespidsen kommer i kontakt med PV-væggen, mens den bevæger sig fremad, da dette kan forårsage uoprettelig skade på beholdervæggen.
BD-kanylering præsenterede de samme tre udfordringer: skade på beholdervæggen, forskydning af kateteret og praktisk anvendelighed af indsættelsesprocessen. I sidste ende blev 1 Fr polyurethankanylen anset for mere egnet end UT - 03 polypropylenkanylen på grund af dens gunstige materialeegenskaber. På trods af den lidt mindre ydre diameter af UT - 03 kanylen (0,30 mm) sammenlignet med 1 Fr termofølsomt polyurethanrør (0,33 mm) er polyurethanmaterialet stift og mindre tilbøjeligt til bøjning. På den anden side er 1 Fr-kanylen, der er blød og fleksibel, lettere indsættelse og blev dermed vores foretrukne valg. Men i tilfælde, hvor BD-størrelsen er usædvanlig lille og ikke kan rumme den større 2 Fr-kanyle, forbliver UT - 03-kanylen et levedygtigt alternativ. I sådanne tilfælde skal der lægges særlig vægt på at forhindre forskydning af kanylen fra BD.
Som opsummeret i litteraturgennemgangen (tabel 5) brugte de fleste af eksperimenterne 19,41,42,46 en portalstrømningshastighed på 1 - 3 ml / min / g lever. Strømningshastigheden skal dog justeres for at opretholde det fysiologiske portaltryk i området 4 - 10 mmHg28. Højt PV-tryk kan forårsage sinusformet dilatation og vaskulær løsrivelse. Lavt PV-tryk og lav PV-strømningshastighed kan resultere i hypooxygenering med lavt flow med efterfølgende midtzonal til pericentral nekrose. Manipulationen af PV-strømningshastigheden tjener funktionen til at regulere PV-trykket, som kan variere afhængigt af den anvendte kanyle og leverens størrelse, hvilket nødvendiggør mindre justeringer af PV-strømningshastigheden. Så i denne undersøgelse blev perfusion startet ved en strømningshastighed på 1 ml / min / g lever, og samtidig blev PV-trykket overvåget ved hjælp af en blodtrykstransducer for at opretholde fysiologisk PV-tryk ved at justere strømningshastigheden.
Under udviklingen af NEVLP-modellen blev der forsøgt yderligere at forbedre iltforsyningen til den perfunderede lever ved at tilføje vaskede røde blodlegemer til perfusat. Ikke desto mindre blev signifikant sedimentering af erytrocytter observeret i det store kammer og reservoir, hvorved tilførslen af iltbærere til organet under perfusion blev reduceret. Desuden blev skader på erytrocytter forårsaget af den mekaniske virkning af den peristaltiske perfusionspumpe, som driver perfusatet ved at komprimere et siliciumrør. Begge grunde lettede vores beslutning om ikke at bruge røde blodlegemer i dette eksperiment. Perfluorcarbonbaserede iltbærere kan muligvis løse disse problemer47.
For at vurdere levertransplantatets levedygtighed under perfusion blev musegaldevæske opsamlet med 3 timers mellemrum. Ikke desto mindre er det vanskeligt at opsamle galde via kateteret på grund af den høje viskositet af musegaldevæske. Dette kompenseres oprindeligt af kapillærkræfterne induceret af det fine 1 Fr polyurethankateter placeret i BD. Imidlertid kunne kun ca. 20 μL galdevæske opsamles inden for den første time af eksperimentet. I stedet for at dræne gennem kanylen blev retrograd fyldning af galdeblæren observeret.
I slutningen af den 12 timers perfusionsperiode blev galdeblæren fyldt med klar galdevæske, hvilket tyder på aktiv galdeproduktion under maskinperfusion. Dette kan potentielt modvirkes ved at placere et større rør i galdeblæren.
I mellemtiden blev den histologiske skade af den hepatiske cellulære og lobulære struktur vurderet for at bestemme resultatet af bevarelse. Det blev observeret, at selv inden for samme lever var bevarelsen inhomogen. Inhomogeniteten af de strukturelle ændringer tyder på, at perfusionen var heterogen i hele leveren (figur 5, figur 6, figur 7). Desuden giver de histologiske fund bevis for, at det er levedygtigt at bevare muselevertransplantatets strukturelle integritet i mindst 12 timer under maskinperfusion. Tilstedeværelsen af intakt leverhistologi kan dog kun hjælpe med vurderingen, men kan ikke definitivt bestemme leverens funktion og levedygtighed. Det skal bemærkes, at nekrose, som den ultimative manifestation af cellulær skade, muligvis ikke let kan observeres før et senere stadium. Således kan det at stole udelukkende på histologisk vurdering muligvis ikke give en omfattende forståelse af leverens funktionelle status og levedygtighed. Andre supplerende assays og evalueringer er nødvendige for at fastslå leverens generelle tilstand, herunder funktionelle assays, biokemiske markører og vurdering af metabolisk aktivitet.
God bevarelse blev opnået efter 12 timers perfusion. Men yderligere forlængelse af perfusionstiden som muligvis nødvendig for organreparation kræver nogle problemer. For det første skal det bemærkes, at opnåelse af langvarige perfusionsvarigheder på over 12 timer ville kræve opretholdelse af sterile forhold snarere end blot rene forhold. I disse indledende eksperimenter var fokus imidlertid på at opretholde rene forhold snarere end sterile forhold, da sikring af sterilitet ville introducere yderligere kompleksiteter til proceduren. For det andet ville længere perfusion muligvis kræve, at der blev tilføjet en dialyseenhed, som beskrevet af Herman Tolboom22, for at fjerne akkumulerende giftige metaboliske affaldsprodukter. De brugte et system med et samlet volumen på 55 - 60 ml til at perfusere en rottelever på 10 g i 4 timer. I denne undersøgelse blev et relativt stort reservoir med et samlet volumen på 300 ml udnyttet på trods af den lille størrelse af museleveren, som vejer ca. 1 g. Denne konfiguration resulterede i en yderligere fortyndingsfaktor på 50 gange. Bemærkelsesværdigt blev der ikke observeret nogen skadelige virkninger i løbet af 12 timers perfusionsperioden med denne opsætning. For det tredje ville længere perfusion også kræve tilsætning af iltbærere, i bedste fald i form af kunstigt hæmoglobin for at sikre tilstrækkelig iltforsyning, som beskrevet af Dondossola et al.47 og Jägers et al.48.
Udviklingen af "ikke-iskæmisk" levertransplantation baseret på NEVLP har utvivlsomt bragt nye ideer og metoder til løsning eller endog forebyggelse af problemet med iskæmi-reperfusionsskade. NEVLP er imidlertid et meget lovende koncept til forbedring af organbevarelse og dets potentielle anvendelse til at udvide organkonservering til organreparation47.
I øjeblikket anvendes tre forskellige teknikker til maskinperfusion eksperimentelt og klinisk. Hovedforskellen er arbejdstemperaturen: hypotermisk maskinperfusion, subnomormisk maskinperfusion og normoterm maskinperfusion (tabel 2). Andre forskelle omfatter valg af konserveringsopløsning, perfusatopløsning og tilsætning af iltbærere (tabel 5).
NEVLP er primært en fordel, fordi (1) organet opretholdes ved sin normale temperatur, (2) det iltes og (3) det metabolisk leveres fuldt ud. Systemet giver en fremragende platform til diagnostisk evaluering, interventionsterapi og i sidste ende organreparation49. NEVLP udgør imidlertid en stor udfordring for ex vivo-organstøtteteknologien. Udfordringen for NEVLP er at spejle den næsten fysiologiske tilstand. Indtil for nylig blev der på grund af den lille størrelse og manglen på standardevalueringskriterier kun udført et begrænset antal gnaver-NEVLP-undersøgelser 25,26,27,28,29,30,31.
Det er her blevet demonstreret, at musemodellen er en gyldig model, der tillader en bevaringstid på 12 timer. Til sammenligning har de fleste rotteundersøgelser rapporteret perfusionstider på 6 timer eller mindre28,33. Derudover er brugen af små dyr en fordel for molekylære undersøgelser sammenlignet med store dyr på grund af tilgængeligheden af rigelige reagenser og de lavere forsøgsomkostninger. For eksempel er mus i øjeblikket en foretrukken mulighed for at teste knockout-modeller af ATG-genfamilien, især til at studere signalveje for iskæmi-reperfusionsskade i leveren 8,50.
Forsøg på rottelever vedrørende NEVLP har afsløret, at normoterm maskinperfusionskonservering er forbundet med reduceret hepatocellulær skade og forbedret tidlig overlevelse efter transplantation sammenlignet med kuldekonservering 31,40,51,52,53,54. NEVLP ved hjælp af rottelever er også velegnet til at studere tilsætninger af lægemidler eller celler til perfusat. Et imponerende eksempel er undersøgelsen af Xuan Tian26, der brugte hæmoxygenase-1 modificerede mesenkymale stamceller kombineret med normoterm maskinperfusion for at forbedre kvaliteten af levertransplantater via Wnt-signalvejen. Haojie Wang,39, har bekræftet i sin nylige undersøgelse, at tilføjelse af knoglemarvsmesenkymale stamceller til perfusatet i høj grad kan forbedre kvaliteten af NEVLP hos rotter til kortvarig perfusion. I deres undersøgelse ved hjælp af DCD-lever hæmmede mesenkymale stamceller fra knoglemarv kombineret med NEVLP hepatisk sinusformet overbelastning og endotelskade. Tilsætningen af mesenkymale stamceller forhindrede intrahepatisk makrofagaktivering og intercellulær adhæsion. Desuden regulerede tilsætningen af mesenkymale stamceller endothelin-1 / endotelnitrogenoxidbalancen for at forbedre leverperfusion og mikrocirkulation.
Mus tilbyder en klar fordel i forhold til rotter, når det kommer til NEVLP, især i forbindelse med molekylære undersøgelser med fokus på transgene eller genetisk modificerede lever. På grund af dyrets lille størrelse udgør proceduren imidlertid en større, men håndterbar udfordring for mikrokirurgen37.
Klassificeringssystem til histologisk vurdering
Den histologiske vurdering er afgørende for at bestemme virkningen af perfusionsbetingelser på transplantatets morfologiske integritet.
Mens Suzuki-scoren almindeligvis anvendes i undersøgelser, der vurderer leverpatologi, er det blevet bemærket, at dette scoringssystem muligvis ikke i tilstrækkelig grad fanger de specifikke fund, der observeres i ex-vivo leverbevarelse. For at imødegå denne begrænsning blev der indført fire yderligere kriterier for at forbedre den omfattende evaluering af bevaret levervæv (tabel 4). For det første blev inkluderingen af nuklear pyknosis vurdering implementeret, da det tjener som en værdifuld parameter, der indikerer cellulær skade. For det andet blev evalueringen af kar- og hepatocytløsning, hvilket betyder skade på leverlobule, indarbejdet som et yderligere kriterium. Endelig blev klassificeringen af erytrocyternes tilstedeværelse i sinusoider anvendt som en indikator for heterogen rødme og perfusion. Ved at inkorporere disse supplerende kriterier blev der opnået en mere nuanceret og præcis vurdering af det bevarede levervævs tilstand, hvilket gav en dybere forståelse af virkningerne af ex-vivo leverbevarelse.
Hepatocytvakuolisering55 forekommer efter ændringer i substratbrug, energiforbrug, mikrotubulusopløsning og hæmning af proteinsyntese. Hepatocytens kerne tvinges til at skifte mod periferien af cellen af store vakuoler. Denne proces ledsages ofte af nuklear pyknosis. I denne undersøgelse førte 12 timers normoterm maskinperfusion til forskellige grader af vakuolisering af hepatocytter sammenlignet med kontrollen, hvilket tyder på inhomogen perfusion.
Tilstedeværelsen af dilaterede sinusoider mellem hepatocytledninger var bemærkelsesværdig i denne undersøgelse. Dette fænomen stammer primært fra hepatisk venøs udstrømningsobstruktion, hvilket fører til vaskulær stasis og overbelastning i leverparenchymen. I denne muselevermodel kan udfordringerne forbundet med at opretholde et konsistent portalperfusionstryk på grund af organets lille størrelse bidrage til den observerede udvidelse af hepatiske sinusoider.
Nekrotiske ændringer manifesterer sig typisk i celleklynger, regionale områder eller specifikke zoner. Det velperfunderede periportalområde udviste relativt bedre bevarelse af hepatocytter sammenlignet med det pericentrale område. Dual-kar leverperfusion, som påvist i rottelever20, udgør en større udfordring i muselever på grund af den lille størrelse af leverarterien. Følgelig kan den observerede inhomogene perfusion af museleveren, i det mindste delvist, tilskrives denne begrænsning.
Disse observationer er ikke eksklusive for muselever, der gennemgår NEVLP, men kan også visualiseres i histologiske billeder fra andre NEVLP-studier, selvom de muligvis ikke er eksplicit beskrevet.
Betydning og potentielle anvendelser af mus NEVLP
NEVLP af muselever er en udfordrende, men gennemførlig procedure. Der er behov for en yderligere indsats for at udnytte denne teknologi bedst muligt til at belyse den mekanisme, der ligger til grund for den gavnlige virkning af NEVLP. Forbedring af vores viden vil lette den progressive udvikling af denne teknologi og overføre den ud over organbevarelse mod området "organreparation".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ingen økonomiske interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Under hele udarbejdelsen af dette papir har jeg modtaget megen støtte og hjælp. Jeg vil især gerne takke min holdkammerat XinPei Chen for hans vidunderlige samarbejde og patientstøtte under min operation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100x15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT - 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
References
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
- Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. Transplantation. 103 (1), 78-90 (2019).
- Cheng, N., et al. Pharmacological activating transcription factor 6 activation is beneficial for liver retrieval with ex vivo normothermic mechanical perfusion from cardiac dead donor rats. Frontiers in Surgery. 8, 665260 (2021).
- Porte, R. J. Improved organ recovery after oxygen deprivation. Nature. 608 (7922), 273-274 (2022).
- Goumard, C., et al. Ex-Vivo Pharmacological Defatting of the Liver: A Review. Journal of Clinical Medicine. 10 (6), 1253 (2021).
- Mao, B., Yuan, W., Wu, F., Yan, Y., Wang, B.
- Hale, A. N., Ledbetter, D. J., Gawriluk, T. R., Rucker, E. B. 3rd Autophagy: regulation and role in development. Autophagy. 9 (7), 951-972 (2013).
- Tang, B., Bao, N., He, G., Wang, J. Long noncoding RNA HOTAIR regulates autophagy via the miR-20b-5p/ATG7 axis in hepatic ischemia/reperfusion injury. Gene. 686, 56-62 (2019).
- Kuma, A., Komatsu, M., Mizushima, N.
- van der, V. alk J. Fetal bovine serum-A cell culture dilemma. Science. 375 (6577), 143-144 (2022).
- Haque, O., et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology (Singapore World Science). 8 (1-2), 27-36 (2020).
- Op den Dries, S., et al. Normothermic machine perfusion reduces bile duct injury and improves biliary epithelial function in rat donor livers. Liver Transplantation. 22 (7), 994-1005 (2016).
- Izamis, M. L., et al. Machine perfusion enhances hepatocyte isolation yields from ischemic livers. Cryobiology. 71 (2), 244-255 (2015).
- Gassner, J. M. G. V., et al. Improvement of normothermic ex vivo machine perfusion of rat liver grafts by dialysis and kupffer cell inhibition with glycine. Liver Transplantation. 25 (2), 275-287 (2019).
- Casado, J., et al. Rat splanchnic net oxygen consumption, energy implications. The Journal of Physiology. 431, 557-569 (1990).
- Tolboom, H., et al. A model for normothermic preservation of the rat liver. Tissue Engineering. 13 (8), 2143-2151 (2007).
- Yamada, S., et al. Effects of short-term normothermic and subnormothermic perfusion after cold preservation on liver transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 52 (6), 1639-1642 (2020).
- Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
- Tolboom, H., et al. Sequential cold storage and normothermic perfusion of the ischemic rat liver. Transplant Proceeding. 40 (5), 1306-1309 (2008).
- Daemen, M. J., et al. Liver blood flow measurement in the rat. The electromagnetic versus the microsphere and the clearance methods. Journal of Pharmacological Methods. 21 (4), 287-297 (1989).
- Koo, A., Liang, I. Y. Microvascular filling pattern in rat liver sinusoids during vagal stimulation. The Journal of physiology. 295, 191-199 (1979).
- Beal, E. W., et al. [D-Ala2, D-Leu5] Enkephalin improves liver preservation during normothermic ex vivo perfusion. Journal of Surgical Research. 241, 323-335 (2019).
- Birnie, J. H., Grayson, J. Observations on temperature distribution and liver blood flow in the rat. The Journal of Physiology. 116 (2), 189-201 (1952).
- Silitonga, M., Silitonga, P. M. Haematological profile of rats (Rattus norvegicus) induced BCG and provided leaf extract of Plectranthus amboinicus Lour Spreng). AIP Conference Proceedings. 1868, 090008090008 (2017).
- Jacob Filho, W., et al. Reference database of hematological parameters for growing and aging rats. Aging Male. 21 (2), 145-148 (2018).
- Tian, X., et al. Heme oxygenase-1-modified bone marrow mesenchymal stem cells combined with normothermic machine perfusion repairs bile duct injury in a rat model of DCD liver transplantation via activation of peribiliary glands through the Wnt pathway. Stem Cells International. 2021, 9935370 (2021).
- Yang, L., et al. Normothermic machine perfusion combined with bone marrow mesenchymal stem cells improves the oxidative stress response and mitochondrial function in rat donation after circulatory death livers. Stem Cells Development. 29 (13), 835-852 (2020).
- Wang, L., He, H. W., Zhou, X., Long, Y. Ursodeoxycholic Acid (UDCA) promotes lactate metabolism in mouse hepatocytes through cholic acid (CA) - farnesoid x receptor (FXR) pathway. Current Molecular Medicine. 20 (8), 661-666 (2020).
- Akateh, C., Beal, E. W., Whitson, B. A., Black, S. M. Normothermic ex-vivo liver perfusion and the clinical implications for liver transplantation. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 6 (3), 276-282 (2018).
- Westerkamp, A. C., et al. Metformin preconditioning improves hepatobiliary function and reduces injury in a rat model of normothermic machine perfusion and orthotopic transplantation. Transplantation. 104 (9), e271-e280 (2020).
- Nösser, M., et al. Development of a rat liver machine perfusion system for normothermic and subnormothermic conditions. Tissue Engineering. Part A. 26 (1-2), 57-65 (2020).
- Yao, J., et al. Extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate rat hepatic ischemia-reperfusion injury by suppressing oxidative stress and neutrophil inflammatory response. FASEB Journal. 33 (2), 1695-1710 (2019).
- Haque, O., et al. The effect of blood cells retained in rat livers during static cold storage on viability outcomes during normothermic machine perfusion. Scientific Reports. 11 (1), 23128 (2021).
- Gillooly, A. R., Perry, J., Martins, P. N. First report of siRNA uptake (for RNA interference) during ex vivo hypothermic and normothermic liver machine perfusion. Transplantation. 103 (3), e56-e57 (2019).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of visualized experiments. (136), e57541 (2018).
- Claussen, F., et al. Dual versus single vessel normothermic ex vivo perfusion of rat liver grafts using metamizole for vasodilatation. PLoS One. 15 (7), (2020).
- Yang, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells combine with normothermic machine perfusion to improve rat donor liver quality-the important role of hepatic microcirculation in donation after circulatory death. Cell and Tissue Research. 381 (2), 239-254 (2020).
- Wu, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modified with heme oxygenase-1 alleviate rejection of donation after circulatory death liver transplantation by inhibiting dendritic cell maturation in rats. International Immunopharmacology. 107, 108643 (2022).
- Lonati, C., et al. Quantitative Metabolomics of Tissue, Perfusate, and Bile from Rat Livers Subjected to Normothermic Machine Perfusion. Biomedicines. 10 (3), (2022).
- Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890 (2019).
- Abraham, N., et al. Two compartment evaluation of liver grafts during acellular room temperature machine perfusion (acRTMP) in a rat liver transplant model. Frontiers in Medicine (Lausanne). 9, 804834 (2022).
- Scheuermann, U., et al. Sirtuin-1 expression and activity is diminished in aged liver grafts. Scientific Reports. 10 (1), 11860 (2020).
- Scheuermann, U., et al. Damage-associated molecular patterns induce inflammatory injury during machine preservation of the liver: potential targets to enhance a promising technology. Liver Transplantation. 25 (4), 610-626 (2019).
- Carnevale, M. E., et al. The novel N, N-bis-2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid-gluconate-polyethylene glycol-hypothermic machine perfusion solution improves static cold storage and reduces ischemia/reperfusion injury in rat liver transplant. Liver Transplantation. 25 (9), 1375-1386 (2019).
- Von,, Horn, C., Zlatev, H., Pletz, J., Lüer, B., Minor, T. Comparison of thermal variations in post-retrieval graft conditioning on rat livers. Artificial Organs. 46 (2), 239-245 (2022).
- Tomizawa, M., et al. Oncostatin M in William's E medium is suitable for initiation of hepatocyte differentiation in human induced pluripotent stem cells. Molecular Medicine Reports. 15 (5), 3088-3092 (2017).
- Dondossola, D., et al. Human red blood cells as oxygen carriers to improve ex-situ liver perfusion in a rat model. Journal of Clinical medicine. 8 (11), (2019).
- Jägers, J., Wrobeln, A., Ferenz, K. B. Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology. European Journal of Physiology. 473 (2), 139-150 (2021).
- Jia, J., et al. A promising ex vivo liver protection strategy: machine perfusion and repair. Surgery and Nutrition. 8 (2), 142-143 (2019).
- Jennings, H., et al. The immunological effect of oxygen carriers on normothermic ex vivo liver perfusion. Frontiers in Immunology. 13, 833243 (2022).
- Kim, J. S., et al. Carbamazepine suppresses calpain-mediated autophagy impairment after ischemia/reperfusion in mouse livers. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 600-610 (2013).
- Imber, C. J., et al. Advantages of normothermic perfusion over cold storage in liver preservation. Transplantation. 73 (5), 701-709 (2002).
- Tolboom, H., et al. Recovery of warm ischemic rat liver grafts by normothermic extracorporeal perfusion. Transplantation. 87 (2), 170-177 (2009).
- Rigo, F., Navarro-Tableros, V., De Stefano, N., Calleri, N., Romagnoli, A. Ex vivo normothermic hypoxic rat liver perfusion model: an experimental setting for organ recondition and pharmacological intervention. Methods in Molecular Biology. 2269, 139-150 (2021).
- van Dyk, J. C., Pieterse, G. M., van Vuren, J. H. Histological changes in the liver of Oreochromis mossambicus (Cichlidae) after exposure to cadmium and zinc. Ecotoxicology and Environmental Safety. 66 (3), 432-440 (2007).
