Summary
マウス肝臓用に正常体温 外生体外 肝灌流(NEVLP)システムが作成されました。このシステムはマイクロサージャリーの経験が必要ですが、再現性のある灌流結果を可能にします。マウスの肝臓を利用することで、分子経路の探索が容易になり、新規灌流液添加物が同定され、臓器修復に重点を置いた実験が可能になります。
Abstract
このプロトコルは、マウス肝臓を用いた最適化された赤血球フリーNEVLPシステムを提示します。マウス肝臓の 生体外 保存は、改変カニューレおよび従来の市販 のex vivo 灌流装置から適応された技術を採用することによって達成された。このシステムは、12時間の灌流後の保存結果を評価するために利用されました。C57BL/6Jマウスを肝ドナーとし、門脈(PV)と胆管(BD)をカニューレ挿入し、その後、温かい(37°C)ヘパリン化生理食塩水で臓器を洗い流すことによって肝臓を移植しました。次いで、移植した肝臓を灌流チャンバーに移し、正常体温酸素化機械灌流(NEVLP)に供した。流入口および出口灌流液サンプルを、灌流液分析のために3時間間隔で収集した。灌流が完了すると、組織学的分析のために肝臓サンプルが取得され、ヘマトキシリン-エオシン(HE)染色による修正スズキスコアを使用して形態学的完全性が評価されました。最適化実験の結果、(1)体重が30gを超えるマウスは、胆管(BD)のサイズが大きいため、実験に適していると見なされました。(2) 2 Fr(外径=0.66 mm)ポリウレタンカニューレは, ポリプロピレンカニューレと比較して門脈カニューレ挿入(PV)に適していた.これは、ポリウレタン素材のグリップ力が向上し、体から臓器室への移動中のカテーテルの滑りが減少したことに起因していました。(3)胆管カニューレ挿入術(BD)では,ポリプロピレンUT-03(外径=0.30mm)カニューレに比べて1Fr(外径=0.33mm)ポリウレタンカニューレの方が有効であることがわかった。この最適化されたプロトコルにより、マウスの肝臓は、組織学的構造に大きな影響を与えることなく、12時間の間首尾よく保存されました。ヘマトキシリン-エオシン(HE)染色により、肝臓のよく保存された形態学的構造が明らかになり、核がはっきりと見える主に生存肝細胞と肝類洞の軽度の拡張が特徴でした。
Introduction
肝移植は、末期肝疾患のある個人のゴールドスタンダード治療です。残念ながら、ドナー臓器の需要は利用可能な供給を上回り、大幅な不足につながっています。2021年には、約24,936人の患者が肝移植の順番待ちリストに載っていましたが、成功した移植は9,234件だけでした1。肝移植片の需要と供給の著しい格差は、ドナープールを拡大し、肝移植片のアクセシビリティを高めるための代替戦略を調査する差し迫った必要性を浮き彫りにしています。ドナープールを拡大する1つの方法は、限界ドナー2を使用することです。限界ドナーには、高齢、中等度または重度の脂肪症のドナーが含まれます。辺縁臓器の移植は好ましい結果をもたらすかもしれませんが、全体的な結果は最適ではないままです。その結果、限界ドナーの機能を高めることを目的とした治療戦略の開発が現在進行中です3,4。
戦略の1つは、機械灌流、特に正常体温酸素化機械灌流を使用して、これらの辺縁器官の機能を改善することです5。しかし、正常体温酸素化機械灌流(NEVLP)の有益な効果の根底にある分子メカニズムについての理解はまだ限られています。マウスは、遺伝子組み換え株が豊富に利用できるため、分子経路を調べるための貴重なモデルとして機能します。例えば、肝虚血再灌流障害の緩和におけるオートファジー経路の重要性は、ますます認識されています6,7。肝虚血再灌流障害における重要な分子経路の1つは、miR-20b-5p/ATG7経路8です。現在、ATGノックアウトおよび条件付きノックアウトマウス系統が多数入手可能であるが、対応するラット系統は存在しない9。
このような背景から、マウス肝移植片用の小型NEVLPプラットフォームを作製することを目的としていました。このプラットフォームは、ドナーの肝臓の機能を改善することを目的とした潜在的な遺伝子組み換え戦略の調査と評価を容易にします。さらに、システムが長期灌流に適していることが不可欠であり、一般に「臓器修復」と呼ばれる肝臓の 生体外 治療を可能にしました。
マウス肝灌流に関する関連する in vitro データの入手可能性が限られていることを考慮して、文献レビューはラットで実施された研究に焦点を当てた。2010年から2022年までの文献を「正常熱肝灌流」「ex vivo または in vitro」「ラット」などのキーワードを用いて系統的検索を行った。この検索は、げっ歯類の最適条件を特定することを目的としており、最も適切なアプローチを決定することができました。
灌流システムは、密閉されたウォータージャケット付きガラスバッファーリザーバー、ペリスタルティックローラーポンプ、酸素発生器、バブルトラップ、熱交換器、臓器室、およびクローズドサイクリングチューブシステムで構成されています(図1)。このシステムは、専用のサーモスタットマシンを使用して、37°Cの一定の灌流温度を正確に維持します。蠕動ローラーポンプは、回路全体の灌流液の流れを駆動します。灌流回路は、絶縁されたウォータージャケットリザーバーで開始されます。続いて、灌流液は酸素発生器を通って導かれ、酸素発生器は専用のガスボトルから95%の酸素と5%の二酸化炭素のガス混合物を受け取る。酸素化に続いて、灌流液はバブルトラップを通過し、そこで閉じ込められた気泡は蠕動ポンプによってリザーバーにリダイレクトされます。残りの灌流液は熱交換器を通って流れ、臓器室に入り、そこからリザーバーに戻ります。
本稿では、マウス肝臓のNEVLPを確立した経験を報告し、酸素キャリアを含まない酸素化培地を用いて行ったパイロット実験の有望な結果を共有します。
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Protocol
動物実験は、動物福祉に関する現在のドイツの規制とガイドライン、および動物研究の報告に関するARRIVEガイドラインに従って実施されました。動物実験プロトコルは、ドイツ、テューリンゲン州のテューリンガー州議会によって承認されました(承認番号:UKJ - 17 - 106)。
注:体重34 ± 4 g(平均[SEM]の平均±標準誤差)の雄C57BL / 6Jマウスを肝臓ドナーとして使用しました。それらは、制御された環境条件(湿度50%、18〜23°C)で維持され、標準的なマウス固形飼料と水に自由にアクセスできました。手術中、60呼吸/分を超える呼吸数を維持し、体温を34°C以上に保ちました。
1. 事前準備
- 操作テーブルの設定
- 滅菌用のすべての手術器具および消耗品をオートクレーブします。
- 加温ボードや電気凝固を含むすべての機器の電源を入れます。
- 25 mLヘパリン処理(2,500 U/L)生理食塩水を入れた50 mLシリンジ1本を温かいインキュベーター(37°C)に入れます。
- 手術器具、6-0シルク縫合糸、滅菌小型綿アプリケーター、獣医生理食塩水(500 mL)、および不織布ガーゼスポンジ(10 cm x 10 cm)を手術台に適切に置きます。
- 手術台に26 Gの針を置き、0.5 mLマイクロ遠心チューブの蓋に小さな穴を開けて、胆汁採取用の胆管を受け入れます。
- カニューレ(1 FrポリウレタンカニューレまたはUT-03ポリエチレンカニューレ)と胆汁収集用の滅菌済み0.5 mLマイクロ遠心チューブを操作テーブルに置きます。
- 自作門脈カニューレ
- 2 Frカニューレを鉗子で持ち、カニューレの端から1 cmの距離で30 Gの針で壁に穴を開けます。針の先端が見えるようになるまで、針をカニューレに通します。
- カニューレの先端をトリミングして、鋭い三角形にします。
- ヘパリン化生理食塩水の調製
- 最終濃度2,500 IU/mLのヘパリン化生理食塩水を25 mL調製します。
- 気泡をすべて取り除き、シリンジを40°Cのインキュベーターに入れます。
- 灌流システムのデモンストレーション
- 機械灌流システムの主要コンポーネントについては、 図1 を参照してください。
- 臓器室の設置
- 臓器室のレイアウトについては、 図2 を参照してください。
- 灌流システムのセットアップ
- 圧力監視用のラボチャートプログラムをオンにします。
- 圧力校正器と圧力センサーを臓器室レベルで接続します。
- 圧力校正器を調整して0 mmHgと読み取り、圧力制御ソフトウェアで対応する値を確認します。
- 圧力校正器を20 mmHgを読み取るように調整し、圧力制御ソフトウェアで対応する値を再度確認します。
- 水浴をオンにし、臓器室を40°Cに予熱します。
- 配管システム全体を蒸留脱イオン水でそれぞれ30分間2回洗い流し、消毒液を完全に除去します。
- システム全体で消毒液の循環を20分間開始し、徹底的な消毒を確実にします。
- 混合ガス(95%酸素(O 2)と5%二酸化炭素(CO2))をオンにします。
- 灌流液充填
- ウィリアムズE培地250 mLにウシ胎児血清50 mL、ペニシリン/ストレプトマイシン3 mL(1 mg/mL)、インスリン0.17 mL(100 IE/mL)、ヘパリン0.34 mL(5000 U/mL)、ヒドロコルチゾン0.07 mL(100 mg/2 mL)を補充して、ウィリアムズE培地を完成させます。
- 等量(150 mL)の灌流液をリザーバーと臓器室に追加して、システムをプライミングします。
注意: 充填プロセス中に無菌性を維持するために特別な注意を払う必要があります。灌流液は、閉じた再循環機灌流のこれら2つの主要コンポーネントを介して絶えずポンプで送られます。 - ペリスタルティックポンプを中速(15 mL/min)でオンにして、灌流システムに酸素化媒体をプライミングします。
2.肝摘出
- 手術前の準備
- 動物の体重を量ります。鎮痛剤ブプレノルフィン(0.3 mg / mL)(0.05 mg / kg体重)を準備します。.
- 誘導室を壁のコンセントに接続します。酸素を0.5リットル/分にします。イソフルランを3%にします。
- 深い麻酔(右反射陽性)に達するまで動物をチャンバーに入れます。
- マイクロシリンジを使用して、体重に適合した用量の鎮痛を皮下に適用する。
- 電気かみそりを使用して、腹部の皮膚の毛皮を整えます。
- マウスを操作テーブルに移し、イソフルラン気化器を2.5%までオンにして麻酔を維持します。指間足指反射をテストして麻酔の深さを確認します。
- マウス腹部の準備
- マウスを仰臥位に置きます。
- 指間反射をテストして、適切な麻酔の深さを二重に確認します。四肢すべてをテープで固定します。
- 腹部の両側を3回連続したヨウ素アルコールを使用して腋窩線中部まで消毒します。手術野の周囲を覆うために不織布滅菌ガーゼを使用してください。
- メッツェンバウムベビーハサミと外科用鉗子を使用して、マウスの腹部の剣状突起から1 cm下に3 cmの横切開を行います。
- 皮膚切開部を両側の中央腋窩線まで両側に伸ばします。
- スプリングハサミを使用して、リネアアルバに沿って2 cmの縦方向の切開を慎重に行います。
- 電気凝固とVannasスプリングはさみで腹筋層を切り取ります。
- 肝臓を電気凝固から保護するために、湿ったガーゼを慎重に置きます。
- 冠状靭帯のより良い露出のために剣状突起を引っ込めるために丸い針で6 - 0の絹縫合糸を使用してください。
- 2つの肋骨開創器を使用して、マウスの腹腔を完全に露出させます。
- 湿った綿棒で小腸を腹腔から慎重に移動させ、丘を完全に露出させます。
- 総胆管の準備
- 鋭いハサミで鷹状、横隔膜、および胃肝靭帯を横断します。
- 歯のない細かい湾曲した鉗子を使用して、総胆管を慎重に解放します。
注意: 一般的な胆管は非常に簡単に損傷し、壊れます。一度壊れると、カニューレ挿入することはできません。解剖学的位置の方向のために、湾曲した鉗子が使用されるのがより良い。 - 次のステップに備えて、2つの6-0シルク縫合ループを総胆管の上に置きます。
- 総胆管カニュレーション
- 30 Gの針で胆管を慎重に穿刺します。先のとがった湾曲した鉗子を使用して、胆管カニューレ挿入に合うように小さな穴を拡大します。
- 血管カニューレ鉗子を使用して胆管カニューレをつかみ、胆管に押し込みます。
- プリセットされた6-0縫合ループでカニューレを二重に固定します。
注:カニュレーション中、胆汁による抵抗が感じられます。力が十分に制御されていない場合、カニューレは胆汁流出の圧力によって胆道から押し出されます。カニューレの深さを慎重に調整します。深すぎると胆管を傷つけたり、深すぎると抜け落ちたりすることがあります。 - カニューレ挿入が成功した後、カニューレ内の胆汁の流れを観察します。
- 門脈の準備
- 平らな鉗子で門脈を固定し、湾曲した鉗子で結合組織を慎重に解放します。門脈の裂傷を避けるために強く引っ張らないでください。門脈が損傷すると、門脈を再カニューレすることは困難です。
- 分岐部よりもちょうど良いPVを解剖し、後で使用するために合流点近くのPVに6-0シルク縫合糸を使用して最初の縫合ループを配置します。
- PVを後で肝丘にできるだけ近づけるために、2番目の縫合ループを配置します。
- 門脈カニュレーション
- 動脈クリップを使用して遠位門脈を閉じます。
- 非常に慎重に、上記の門脈カニューレのいずれかで門脈を穿刺します。穿刺が成功した後、カニューレ内の血流がはっきりと観察できます。
- PVカニューレをあらかじめ配置された6-0縫合ループで固定します。
- 肝臓の紅潮
- イソフルランを5%に増やし、過剰量のイソフルラン吸入でマウスを安楽死させる。
- インキュベーターから予熱したヘパリン食塩水を取ります。ヘパリン化生理食塩水中に形成された気泡をすべて取り除きます。
- 予熱したヘパリン化生理食塩水でシリンジをシリンジポンプに固定します。
- シリンジポンプの延長チューブを門脈のカニューレに接続し、速度を2 mL / minに調整して、肝臓の紅潮を開始します。
- 紅潮手順の最後に肝臓の色を観察します。色が均一な黄色に変わったら、肝臓を切除します。
- 横隔膜、肝上下大静脈、下肝大静脈、肝動脈、遠位門脈、および残りの結合組織を横断する。
- 肝臓をペトリ皿に入れます。
3.肝臓とチャンバーの接続
- 肝移植
- ペトリ皿を使用して肝臓を臓器室に慎重に移します。
- 肝臓が乾燥するのを防ぐために、ペトリ皿に少量の生理食塩水を保管してください。
注意: この手順では、門脈と胆管が簡単にねじれる可能性があり、肝灌流と胆汁収集に影響を与える可能性があります。
- 門脈カニューレ接続
- 通常の生理食塩水を注射器で門脈カニューレにゆっくりと注入し、カニューレ内の気泡を排出します。
- 門脈カニューレを臓器室の灌流液流出チューブに接続します。
- 胆管カニューレ接続
- マウス胆管カニューレを臓器室に接続されているゴム製キャップのバルブに通します。
- 胆管カニューレを、蓋に小さな穴のある事前に準備された0.5mLマイクロチューブに挿入します。
- マイクロチューブを臓器室の外側の粘土の上に置きます。
4. PV圧力に応じて流量を調整します
- ペリスタルティックポンプを1mL/minからオンにします。
- 門脈圧の読み取り値をチェックして、流量を調整します。
- 流量を調整することにより、門脈圧を7〜10mmHgの生理学的範囲に維持します。
注意: 公称流量は、チューブの使用法と位置によってわずかに異なる場合があります。
5.サンプル収集
- 門脈流入管からの入口灌流液サンプルと臓器室からの出口灌流液サンプルを3時間間隔で取得します。
- 12時間の灌流期間の終わりに組織学的分析のためにすべての肝葉からサンプルを収集します。
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Representative Results
手術手技の確立
合計17匹の動物がこの実験に利用されました:門脈(PV)と胆管(BD)のカニューレ挿入を含む臓器調達プロセスを最適化するために14匹のマウスが使用され、3匹のマウスが手順を検証するために使用されました(表1)。組織学的結果(図3)を、最適な灌流条件の同定を容易にするために比較した。
灌流液の選択
以前に利用された肝細胞培養培地が、この研究のために選択された10,11。ウィリアムのE培地は当初、成熟ラット肝上皮細胞の長期in vitro培養用の血清還元培地としてウィリアムズとガンによって設計されました12。それにもかかわらず、げっ歯類肝細胞の成長および維持をサポートする上での有用性も見出されている13。ウシ胎児血清(FBS)は、細胞の成長、増殖、および生存率を促進する必須栄養素と成長因子の豊富な組成により、広く使用されている細胞培養サプリメントです14。完全なウィリアムのE培地を灌流液として使用し(表2)、20%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、5,000 U / Lヘパリン、50 U / Lインスリン、および0.010 g / Lヒドロコルチゾンを添加しました。
カニューレの選択
カニューレ挿入術では,胆汁採取のために胆管(BD)をカニューレ挿入し,続いて門脈(PV)をカニューレ挿入した。BDカニュレーションには、最初に外径0.3 mm、内径0.18 mmのUT-03ポリプロピレンチューブを使用しました。ただし、潜在的なBD損傷に関する懸念と、トリミングされた剛性のあるUT-03チップに関連する意図しないカテーテルの変位のリスクが高いため、1 Frポリウレタンチューブが優先されました。ポリウレタンチューブは、素材が柔らかく滑りにくいため、BDカニュレーションに適していると考えられていました。
最初に、門脈(PV)をカニューレ挿入するために26Gのポリプロピレン静脈内針カニューレが使用されました。しかし、針の除去とそれに続くカニューレの灌流管への付着は、肝内正弦波を閉塞する可能性のある気泡の形成をもたらした。この問題を克服するために、2 Frポリウレタンカニューレの遠位1 cmに挿入された30 Gの針を使用して留置カニューレを構築しました。次に、この自作の「針誘導カニューレ」を合流点の上の遠位PVに挿入しました。カテーテルがPV内に配置されたとき、針はゆっくりと引き抜かれ、同時にチューブを前進させた。自作カニューレの端部は、チャンバー内の灌流管に接続されていた。このカニュレーション技術で柔らかい材料を使用すると、血管の後壁が損傷するリスクが軽減されるという利点が得られました。
バリデーション研究
入口および出口灌流液サンプルを、pHおよびカリウムレベルの測定に供した。得られた結果(図4)を、次いで、最近の刊行物15、16、17で報告された知見と比較した。3つのマウス肝臓に酸素添加を灌流し、ウィリアムのE培地を12時間添加した。この期間を通して、7〜10mmHgの安定した灌流圧が連続的に記録された。平均pHは12時間の灌流を通して比較的安定しており、7.3〜7.7の範囲でした。.平均カリウムレベルも灌流期間を通じて安定しており、5.9〜6.8 mmol / Lの範囲でした(図4)。PV流量は、実験手順中のポンプチューブの使用法と位置に応じて、0.8〜1.2 mL / min/gの範囲内に維持されました。マウス肝灌流で観察されたすべての結果は、ラット肝灌流で以前に報告された観察との類似性を示しました(表3)。
組織サンプルを3つの肝臓(N = 3)から収集し、HE染色用に最適化されたプロトコルを使用して12時間の灌流を行い、その後、スライド全体をスキャンしました。各肝葉は、修正鈴木スコアを用いてスコア化した(表4)。古典的なスズキスコア18 は、核のピクノーシス、血管の剥離、および正弦波および大型血管における赤血球の存在という3つの追加パラメータを組み込むことによって増強された。各パラメータは、不在(0)、軽度(1)、中等度(2)、および重度(3)として評価されました。最終スコア0〜7は良好な保存状態を反映していると見なされ、8〜14は中程度の保存状態と見なされ、14〜21は保存状態が悪いことを示しています。
マウス肝臓の保存性は、修正鈴木スコアに基づいて評価した。2人の医療専門家が、3つの肝臓の7つの葉の形態について独立した評価を実施しました(図5、図6、図7)。各肝葉の7つの葉スコアの平均を計算しました。スコアが低いほど、肝臓の保存状態が良いことを示します。専門家による評価は、高度な一致を示しました。特に、2人の専門家によって割り当てられたスコアのわずかな不一致が核のピクノーシスの評価で観察されたが、これらの変動は全体的なスコアリング結果に大きな影響を与えなかった。
せいぜい、肝実質は比較的無傷で、よく保存された典型的な小葉構造を持ち、正常な肝臓とほとんど区別できませんでした。肝細胞は、はっきりと見える細胞膜と丸い核で生存可能であるように見えました。しかし、一部の核はピクノーシスを起こし、一部の肝類洞はわずかに拡張し、スコアは4になりました。(図3、 図6)
最悪の場合、小葉構造が歪んで、血管が実質から切り離され、合流した実質壊死が起こりました。細胞レベルでは、細胞の空胞化、および核ピクノーシスが、特に中心周辺領域で明らかになりました。さらに、軽度から中等度の空胞化が観察された。肝細胞の最大30%が壊死を起こし、最大スコアは14でした。(図3、 図7)
表1:マウス肝灌流モデルの段階的な確立。 確立過程で、カニューレのサイズ、材質、および位置の違いにより、さまざまな合併症が観察されました。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:体外臓器保存方法15、17、19、20、21、22の比較。 灌流液の選択、酸素キャリアの選択、および栄養成分の比較の最適化は、さまざまな保管条件下で非常に重要です。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:正常ラットおよびラットNEVLP 11、15、16、17、18、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31における血行動態および血液ガス分析。提供された情報は、ラット肝臓の血行動態の特徴とin vitroでの正常体温灌流の重要なパラメータを選択的に説明しています。具体的には、ラット肝灌流は、PV圧力が典型的には4〜10mmHgの範囲であり、PVに入る灌流液中の酸素分圧が80〜550mmHgの範囲であり、in vitroラット肝灌流を成功させるために必要な基準を満たす場合に最適であると考えることができる。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表4:修正スズキスコア。 この研究で使用された修正スズキスコアは、核のピクノーシス、血管の剥離、および正弦波および大型血管における赤血球の存在という3つの追加パラメーターを組み込むことにより、古典的なスズキスコアを拡張します。各パラメータには、0(欠席)、1(軽度)、2(中程度)、または3(重度)のスケールでグレードが割り当てられました。0から8の範囲の合計スコアは、良好な保存状態を示します。9〜16は中程度の保存状態を示し、17〜24は保存状態が悪いことを示します。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表5:ラットにおけるNEVLPの文献精密検査に基づく灌流液培地、灌流液量、および灌流圧力の選択(2010-2022)3,8,10,14,17,19,27,30,31,32,33,34,35,36 、37、38、
39、40、41、42、43、44、45。ラット肝臓におけるノルマザーマシン灌流は、利用される灌流液の特定の種類と量、および灌流の期間に関して、研究間で変動性を示す可能性があります。.異なる研究では、透析や大量灌流など、長期間にわたってさまざまなアプローチが採用されている場合があります。しかしながら、これらの違いにもかかわらず、門脈圧、門脈流量、および灌流液中の酸素分圧などのパラメータは、一般に、採用された様々な方法にわたって最小の変動を示す。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図1:灌流システムの概略図。重要なコンポーネントは、臓器室、サーモスタットマシン、ローラーポンプ、酸素発生器、およびリザーバーです。灌流液は、蠕動ポンプによってリザーバーから酸素発生器にポンプで送られます。酸素発生器には、95%のO2と5%のCO2の途切れることのないガスの流れがあります。灌流液はバブルトラップを通過し、そこで灌流液中に存在する気泡が捕捉され、リザーバーにポンプで戻されます。残りの灌流液は臓器室に流れ、そこでチューブは門脈に接続されます。臓器室からの灌流液の流出は、蠕動ポンプによってリザーバーに戻されます。胆汁を集めるために胆汁排液チューブが臓器室に接続されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:灌流チャンバーのクローズアップ。 臓器灌流室は、灌流液の入口と出口、バブルトラップ、熱交換器、および胆汁収集ポートで構成されています。灌流液ポンプ圧力のリアルタイム監視は、圧力センサーを使用して行われます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:正常および灌流マウス肝臓の組織学的結果。 (A)正常マウス肝形態(対照)。(B)灌流12時間後のHE染色によって視覚化された最も保存状態の良い形態の例。灌流12時間後のHE染色によって視覚化された最悪の保存形態の例。黒い矢印は空胞化を示し、赤い矢印は正弦波拡張を示し、黄色の矢印は核のピクノーシスを示し、緑の矢印は血管剥離を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:灌流液分析。 pH(A)およびカリウムレベル(B)。どちらのパラメータも12時間の観測時間を通して安定しており、一定の灌流条件を示しています この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:軽度の肝障害により、スズキスコア4-7が変更されました。 NEVLPの12時間後、肝臓の形態の半定量的評価を行った。各肝葉からのサンプルは別々に評価および等級付けされ、各肝臓の範囲と平均スコアが得られ、可能な限り最高のスコアは4でした。肝葉に応じてスコアが4〜7の範囲のよく保存された肝臓形態(平均= 5)(スコア0-7:よく保存された肝臓形態、スコア8-14適度に保存された形態、スコア15-21:保存不良の肝臓形態) この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:中程度の肝障害により、スズキスコア7-14が修正されました。 修正スズキスコアによる正常体温酸素化機械灌流の12時間後の肝臓形態の半定量的評価。スコアが7〜14(平均= 11)の範囲で適度に保存された形態。(スコア0-7:よく保存された肝臓の形態、スコア8-14は中程度に保存された形態、スコア15-21:保存不良の肝臓の形態) この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:軽度-中等度の肝障害により、修正されたスズキスコア5-11。 不均一な灌流は、異なる肝葉において軽度から中等度の保存された形態をもたらし、スコアは5〜11(平均= 8)の範囲であった。(スコア0-7:よく保存された肝臓の形態、スコア8-14は中程度に保存された形態、スコア15-21:保存不良の肝臓の形態) この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
プロトコルの重要なステップ
肝移植における2つの重要なステップは、門脈のカニューレ挿入(PV)とそれに続く胆管のカニューレ挿入(BD)です。これらのステップは、臓器摘出とその後の灌流または移植手順を成功させる上で最も重要です。
課題と解決策
PVカニュレーションには、血管壁の損傷、カテーテルの変位、挿入プロセスの実用性の3つの課題があります。PV血管壁の繊細な性質により、カニューレ挿入中に慎重に取り扱わないと、穿刺やその後の出血の影響を受けやすくなります。さらに、PVによる失血は門脈圧を低下させ、PVカニューレの挿入をより困難にします。さらに、門脈壁の損傷は、肝内血管系に空気塞栓を導入する可能性があります。したがって、PVカニュレーションプロセス中に精度と注意を払うことは、合併症のリスクを最小限に抑えるために重要です。
PVカニューレ挿入中、特に滑りやすい材料でカニューレを使用する場合、カテーテル変位のリスクが一般的な懸念事項です。ポリプロピレンと比較して、ポリウレタンカニューレの使用はPVカニューレ形成にとってより有利である。ポリウレタンの柔らかく柔軟な性質は、潜在的にその材料特性に起因するカテーテルの変位または損失のリスクを大幅に低減します。さらに、柔らかいカニューレを使用すると、血管の内皮層を損傷する可能性が最小限に抑えられます。この研究では、3種類の血管アクセスカニューレ、すなわち24 Gポリプロピレン、26 Gポリプロピレン、および2 FrポリウレタンをPVカニューレ挿入について比較しました。これらのオプションの中で、26 Gと2 Frの両方のポリウレタンカニューレは、マウスPVのサイズとのより良い互換性を示しました。26 Gカニューレは解剖学的適合性が優れていましたが、外径0.66 mmの2 Frポリウレタンカニューレは、その独自の材料特性により、意図した用途に適していると見なされ、PVからの意図しないカテーテルの外れのリスクを効果的に最小限に抑えました。
挿入の実用性に関しては、さまざまな技術がテストされました。1つの方法は、PVの近位端と遠位端をクランプし、細かいハサミで小さな穴を開け、PVカニューレを挿入することです。この手法では、同時アクションの複雑さと要件のために、追加の人の関与が必要になります。したがって、単一のマイクロ外科医が独立して手順を実行することは現実的ではありません。したがって、内側の針と外側のカニューレを備えたカテーテルが必要です。前述のように、市販の硬くて滑らかな26Gポリプロピレンカニューレを使用すると、カニューレをフラッシングシステムに接続するときに滑り落ちて気泡が形成されるリスクがあります。これらの懸念に対処するために、針カテーテルから26 Gの針を長くて柔軟なポリウレタン2 Frカニューレに挿入することによって、自己構築の「針ガイドチューブシステム」が考案されました。このアプローチには、(1)カテーテル挿入システム、(2)長くて柔軟なチューブ、(3)好ましい材料特性の3つの主な利点があります。ただし、このステップでは、血管壁に不可逆的な損傷を与える可能性があるため、前進中に針先がPV壁に接触しないように注意することが重要です。
BDカニュレーションは、血管壁の損傷、カテーテルの変位、および挿入プロセスの実用性という同じ3つの課題を提示しました。最終的に、1 Frポリウレタンカニューレは、その好ましい材料特性のために、UT-03ポリプロピレンカニューレよりも適していると見なされました。UT-03カニューレの外径(0.30 mm)は、1 Fr感熱ポリウレタンチューブ(0.33 mm)と比較してわずかに小さいにもかかわらず、ポリウレタン材料は剛性があり、曲がりにくいです。一方、1 Frカニューレは柔らかく柔軟性があり、挿入が容易であるため、私たちの好ましい選択肢となりました。ただし、BDサイズが非常に小さく、より大きな2 Frカニューレに対応できない場合は、UT-03カニューレが実行可能な代替手段のままです。このような場合、BDからのカニューレの変位を防ぐために特別な注意を払う必要があります。
文献レビュー(表5)に要約されているように、実験者19、41、42、46のほとんどは、1〜3mL / min / g肝臓の門脈流速を使用しました。しかしながら、流量は、生理学的門脈圧を4〜10mmHg28の範囲に維持するように調整されるべきである。PV圧力が高いと、正弦波拡張および血管剥離を引き起こす可能性があります。低PV圧力と低PV流量は、低流量の低酸素化をもたらし、その後、中帯から中心周囲壊死を引き起こす可能性があります。PV流量の操作は、PV圧力を調整する機能を果たし、これは使用されるカニューレおよび肝臓のサイズに応じて変化し得るため、PV流量をわずかに調整する必要がある。そこで本研究では,肝臓の流量1 mL/min/gで灌流を開始し,同時に血圧変換器を用いてPV圧をモニターし,流量を調整することで生理的PV圧を維持した。
NEVLPモデルの開発中に、灌流液に洗浄赤血球を添加することにより、灌流された肝臓への酸素供給をさらに改善する試みがなされた。それにもかかわらず、赤血球の有意な沈降が大きなチャンバーおよびリザーバーで観察され、それによって灌流中の臓器への酸素キャリアの送達が減少した。さらに、赤血球の損傷は、シリコンチューブを圧縮することによって灌流液を駆動する蠕動灌流ポンプの機械的作用によって引き起こされました。両方の理由により、この実験で赤血球を使用しないという決定が容易になりました。パーフルオロカーボンベースの酸素キャリアは、これらの問題を解決することができるかもしれない47。
灌流中の肝移植片の生存率を評価するために、マウス胆汁を3時間間隔で収集した。それにもかかわらず、マウス胆汁の粘度が高いため、カテーテルを介して胆汁を収集することは困難です。これは、BDに配置された微細な1Frポリウレタンカテーテルによって誘発される毛細管力によって最初に補償されます。しかし、実験の最初の1時間以内に採取できた胆汁液は約20μLしか得られませんでした。カニューレを通して排出する代わりに、胆嚢の逆行性充填が観察された。
12時間の灌流期間の終わりに、胆嚢は透明な胆汁で満たされ、機械灌流中の活発な胆汁産生を示唆しました。これは、より大きなチューブを胆嚢に入れることで打ち消す可能性があります。
その間、保存の結果を決定するために、肝細胞および小葉構造の組織学的損傷を評価した。同じ肝臓内であっても、保存は不均一であることが観察された。構造変化の不均一性は、灌流が肝臓全体で不均一であったことを示唆しています(図5、図6、図7)。さらに、組織学的所見は、機械灌流中にマウス肝移植片の構造的完全性を最低12時間維持することが実行可能であるという証拠を提供する。ただし、無傷の肝組織学の存在は評価に役立つだけで、肝臓の機能と生存率を明確に判断することはできません。細胞損傷の究極の症状としての壊死は、後の段階まで容易に観察できない可能性があることに注意する必要があります。したがって、組織学的評価のみに依存することは、肝臓の機能状態および生存率の包括的な理解を提供しない可能性がある。肝臓の全体的な状態を確認するには、機能アッセイ、生化学的マーカー、代謝活性の評価など、他の補完的なアッセイと評価が必要です。
良好な保存は、12時間の灌流後に達成された。ただし、臓器修復に必要な灌流時間をさらに延長するには、いくつかの問題に対処する必要があります。まず、12時間を超える長期間の灌流時間を達成するには、クリーンな状態だけでなく、無菌状態を維持する必要があることに注意する必要があります。ただし、これらの最初の実験では、無菌性を確保すると手順がさらに複雑になるため、無菌状態ではなくクリーンな状態を維持することに焦点が当てられました。第二に、より長い灌流は、Herman Tolboom22によって説明されているように、蓄積された有毒な代謝廃棄物を除去するために透析ユニットを追加する必要がある可能性があります。彼らは、総容量55〜60 mLのシステムを使用して、10 gのラット肝臓を4時間灌流しました。この研究では、マウスの肝臓のサイズが約1 gと小さいにもかかわらず、総容量300 mLの比較的大きなリザーバーを利用しました。この構成により、50倍の追加の希釈係数が得られました。驚くべきことに、この設定では12時間の灌流期間中に有害な影響は観察されませんでした。第三に、より長い灌流はまた、Dondossola et al.47およびJägers et al.48によって記述されているように、適切な酸素供給を確保するために、せいぜい人工ヘモグロビンの形で酸素キャリアを添加することを必要とするであろう。
NEVLPに基づく「非虚血性」肝移植の開発は、間違いなく虚血再灌流障害の問題を解決または予防するための新しいアイデアと方法をもたらしました。しかし、NEVLPは臓器保存を改善するための非常に有望な概念であり、臓器保存を臓器修復に拡張するためのその潜在的な応用です47。
現在、機械灌流の3つの異なる技術が実験的および臨床的に使用されている。主な違いは、低体温機械灌流、亜母性機械灌流、および常温機械灌流の動作温度です(表2)。その他の違いには、保存溶液、灌流液溶液、および酸素キャリアの添加の選択が含まれます(表5)。
NEVLPは、(1)臓器が常温に維持され、(2)酸素化され、(3)代謝的に完全に供給されるため、主に有利です。このシステムは、診断評価、介入療法、そして最終的には臓器修復のための優れたプラットフォームを提供します49。しかし、NEVLPは生体外臓器支援技術に大きな課題をもたらします。NEVLPの課題は、生理学的に近い状態を反映することです。最近まで、サイズが小さく、標準的な評価基準がないため、限られた数のげっ歯類NEVLP研究のみが実施されていました25、26、27、28、29、30、31。
ここでは、マウスモデルが12時間の保存時間を可能にする有効なモデルであることが実証されています。比較すると、ほとんどのラット研究は6時間以下の灌流時間を報告しています28,33。さらに、小動物の使用は、豊富な試薬の入手可能性と低い実験コストのために、大型動物と比較して分子研究にとって有利である。例えば、マウスは現在、ATG遺伝子ファミリーのノックアウトモデルを試験するための好ましい選択肢であり、特に肝臓における虚血再灌流障害のシグナル伝達経路を研究するための好ましい選択肢である8,50。
NEVLPに関するラット肝臓での実験により、正常体温機械灌流保存は、低温保存と比較して肝細胞損傷の減少と移植後早期生存率の改善に関連していることが明らかになりました31,40,51,52,53,54。ラット肝臓を用いたNEVLPは、灌流液への薬物または細胞の添加を研究するのにも適している。印象的な例は、ヘムオキシゲナーゼ-1修飾間葉系幹細胞を正常体温機械灌流と組み合わせて使用し、Wntシグナル伝達経路を介した肝移植片の品質を改善したXuan Tian26の研究です。Haojie Wang(39歳)は最近の研究で、骨髄間葉系幹細胞を灌流液に加えることで、短時間灌流のためのラットのNEVLPの品質を大幅に改善できることを確認しました。DCD肝臓を用いた研究では、骨髄間葉系幹細胞とNEVLPを組み合わせることで、肝正洞鬱血と内皮損傷が抑制されました。間葉系幹細胞の添加は、肝内マクロファージの活性化と細胞間接着を妨げました。さらに、間葉系幹細胞の添加は、エンドセリン-1/内皮一酸化窒素バランスを調節し、肝臓灌流および微小循環を改善した。
マウスは、NEVLPに関しては、特にトランスジェニックまたは遺伝子組み換え肝臓に焦点を当てた分子研究の文脈において、ラットよりも明確な利点を提供します。しかしながら、動物のサイズが小さいため、この手順は、マイクロ外科医37にとって、より大きく、しかし管理可能な課題を提起する。
組織学的評価のための等級付けシステム
組織学的評価は、移植片の形態学的完全性に対する灌流条件の影響を決定するために決定的である。
鈴木スコアは肝病理を評価する研究で一般的に利用されていますが、このスコアリングシステムは、生体外肝保存で観察された特定の所見を適切に捉えていない可能性があることが指摘されています。この制限に対処するために、保存された肝臓組織の包括的な評価を強化するために4つの追加基準が導入されました(表4)。第一に、核ピクノーシス評価を含めることは、細胞損傷を示す貴重なパラメータとして役立つため、実施された。第二に、肝小葉の損傷を意味する血管および肝細胞の剥離の評価が追加の基準として組み込まれました。最後に、正弦波における赤血球の存在の等級付けは、不均一なフラッシングおよび灌流の指標として利用されました。これらの補足基準を組み込むことにより、保存された肝臓組織の状態のより微妙で正確な評価が達成され、生体外肝臓保存の効果をより深く理解できるようになりました。
肝細胞の空胞化55 は、基質使用、エネルギー消費、微小管崩壊、およびタンパク質合成の阻害における変化の後に生じる。肝細胞の核は、大きな液胞によって細胞の周辺に向かって移動することを余儀なくされています。このプロセスはしばしば核ピクノーシスを伴います。この研究では、12時間の恒温機械灌流は、不均一な灌流を示唆する対照と比較して、肝細胞の異なる程度の空胞化をもたらしました。
肝細胞コード間の拡張した正弦波の存在は、この研究で顕著でした。この現象は主に肝静脈流出閉塞から生じ、肝実質内の血管うっ滞および鬱血を引き起こす。このマウス肝臓モデルでは、臓器のサイズが小さいために一貫した門脈灌流圧を維持することに関連する課題が、肝類洞の拡張の観察に寄与する可能性があります。
壊死性変化は通常、細胞クラスター、局所領域、または特定のゾーンに現れます。よく灌流された門脈周囲領域は、中心周囲領域と比較して肝細胞の比較的良好な保存を示した。二血管肝灌流は、ラット肝臓20において実証されるように、肝動脈のサイズが小さいためにマウス肝臓においてより大きな課題を提示する。したがって、マウス肝臓の観察された不均一な灌流は、少なくとも部分的には、この制限に起因する可能性があります。
これらの観察結果は、NEVLPを受けているマウス肝臓に限定されるものではなく、明示的に説明されていないかもしれませんが、他のNEVLP研究からの組織学的画像で視覚化することもできます。
マウスNEVLPの重要性と応用可能性
マウス肝臓のNEVLPは、挑戦的ですが実行可能な手順です。この技術を最大限に活用し、NEVLPの有益な効果の根底にあるメカニズムを解明するには、さらなる努力が必要です。私たちの知識を高めることは、この技術の進歩的な進化を促進し、臓器の保存を超えて「臓器修復」の領域に移行します。
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Disclosures
開示すべき金銭的利益相反はありません。
Acknowledgments
この論文の執筆を通して、私は多くの支援と支援を受けました。特に、チームメイトのXinPei Chenの素晴らしい協力と私の手術中の忍耐強いサポートに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100x15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT - 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
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