对活体组织进行实时分析可产生重要的功能和机理数据。本文描述了协议和关键变量,以确保通过一种新型的无泵多通道流体系统准确和可重复地生成数据,该系统可以维护和评估各种组织和细胞模型。
许多用于研究组织功能和细胞生物学的 体外 模型需要培养基流动,以提供足够的氧合和维持功能和活力所需的最佳细胞条件。为此,我们开发了一种多通道流式培养系统,以维持组织和细胞的培养状态,并通过在线传感器和/或收集流出部分来持续评估功能和活力。该系统将耗氧率的 8 通道连续光学传感与内置馏分收集器相结合,可同时测量代谢物的产生率和激素分泌。尽管它能够维持和评估广泛的组织和细胞模型,包括胰岛、肌肉和下丘脑,但在这里我们描述了它的工作原理和实验制剂/方案,我们用于研究分离的小鼠视网膜、小鼠视网膜色素上皮 (RPE)-脉络膜-巩膜和培养的人 RPE 细胞的生物能量调节。系统设计的创新,如无泵流体流动,大大简化了多通道流动系统的操作。视频和图像说明了如何组装、准备仪器进行实验,以及如何将不同的组织/细胞模型加载到围灌注室中。此外,还描述和讨论了为方案和组织特异性实验选择条件的指南,包括设置正确的流速与组织比率以获得一致和稳定的培养条件,以及准确测定消耗量和生产率。最佳组织维护和多个参数的实时评估相结合,产生了信息量很大的数据集,这些数据集将对眼睛生理学研究和治疗视力受损的药物发现具有很大的实用性。
围灌注系统在生命科学领域有着悠久的历史。特别是,对于胰岛分泌功能的研究,它们已被用于表征胰岛素分泌响应促泌剂的动力学1。除了收集流出部分用于随后的激素和代谢物测定外,还集成了实时传感器,主要用于检测耗氧量2,3,4。由于缺乏生理学相关方法来评估眼睛各种分离成分(包括视网膜、视网膜色素上皮 (RPE)-脉络膜-巩膜和培养的 RPE 细胞)的代谢调节和失调,因此更好地理解介导眼部疾病机制的广泛努力受到限制。为培养细胞设计的静态系统已适用于组织5,但组织需要流动才能充分氧合。流动系统已成功准确且可重复地测量视网膜和 RPE-脉络膜-巩膜对耗氧率 (OCR) 的实时响应,并且组织保持代谢稳定超过 8 小时,从而允许涉及多种测试化合物的高度信息方案 4,6,7,8,9 .尽管如此,流体系统的操作历来需要定制的设备和训练有素的技术人员进行非标准化方法。在大多数实验室中,这种系统尚未被采用为标准方法。BaroFuse 是一种新开发的流体系统,它不依赖泵,而是依靠气体压力来驱动流经多个通道和组织室(图 1)。对每个通道进行OCR连续监测,并使用基于板的馏分收集器收集流出物,以便随后对内容物进行分析。重要的是,该仪器的组织围灌注室旨在容纳各种几何形状和大小的组织。
该仪器的核心是流体系统,其中流体从密封的加压储液罐通过小内径 (ID) 管(在流体回路中产生最显着的流动阻力)向上驱动,进入容纳组织的玻璃组织室。介质储液模块 (MRM) 的压力由连接到装有气体混合物(通常为 21% O 2、5% CO 2、平衡 N 2)的气瓶的低压和高压调节器提供,储液罐由容纳组织室组件 (TCA) 的围灌室模块 (PCM) 从顶部密封。流量由电阻管的长度和内径以及低压调节器的压力设置控制。连接到组织室顶部的流出管将流体输送到废物容器(连续称重以自动确定流速)或由馏分收集器控制的 96 孔板的孔中。O 2 检测系统可测量涂在组织下游每个玻璃组织室内部的 O2 敏感染料的寿命。然后,此信息用于连续计算 OCR。整个流体系统位于温控外壳中,储气罐、馏分收集器和计算机是仪器的主要组件(图 2A)。最后,运行仪器的软件用于控制其操作(包括进样测试化合物的制备和定时、流量测量系统和馏分收集器定时),以及处理和绘制 OCR 数据和其他补充测量。
在本文中,我们描述了使用流体系统围灌注和评估眼睛各种分离成分的 OCR 和乳酸生成率 (LPR) 的协议。LPR 是反映糖酵解速率的参数,与 OCR 高度互补,其中该对占细胞中碳水化合物产生能量的两个主要分支10。由于最好通过观看程序来了解组织制备并将其加载到组织室中,因此该视频将有助于说明在设置和操作过程中执行的几个关键步骤,这些步骤仅通过文本不容易传达。
协议的描述分为8个部分,对应于实验的不同阶段(图2B):1.实验前准备;2.围灌液的制备/平衡;3.仪器设置;4.组织平衡;5.实验方案;6、仪器故障;7. 数据处理;和 8.流出分数的测定。
由于生物能量学在细胞功能和眼睛各种成分的维持的各个方面都很重要,因此迫切需要研究其调节的方法。特别是,神经视网膜和RPE依赖于代谢来产生能量以及细胞内和细胞间信号传导14,15,16,17。由于它们的高氧化能力,眼睛的分离组织在静态条件下不能很好地维持18,19,因此对眼睛的分离成分的研究需要能够维持和评估代谢过程的流动系统。流体系统旨在从各种组织类型生成 OCR 和 LPR 数据,在本文中,我们提出了详细的协议,这些协议被发现可以产生最佳结果。
使用流动系统生成可靠数据的主要决定因素包括在39°C下对基于CO2的介质/缓冲液进行预平衡(以确保周融合液不会被溶解气体过饱和,从而在实验过程中脱气)。特别是,储存在4°C的培养基或KRB缓冲液将相对于37°C过饱和,如果预平衡时间不足,则在实验过程中将脱气。此外,由于撕裂或组织分离不完全,或将组织暴露在少量碳酸氢盐缓冲液中太长时间,不得因组织过度隔离而对装入组织室的组织造成创伤。O2检测的温度控制、流量稳定性和可靠性变化不大,这些因素对故障率的影响不大。
该仪器有八个同时运行的流道/组织室,从两个储液器中供应外融合液,每个储液器有四个组织室。为了获得最准确的 OCR 时程,动力学曲线通过未加载组织的腔室进行基线校正。因此,典型的实验方案将涉及两组三个组织室。方案通常分为两类:一类是每侧不同的测试化合物方案(例如,MRM一侧的药物/载体,另一侧的载体);第二种是在MRM两侧使用相同的测试化合物注射方案,但在MRM的每一侧使用不同的组织或组织模型。在本文中,通过未暴露于任何测试化合物的组织将寡霉素和FCCP对视网膜的影响与OCR进行了比较,并在相同的方案和条件下同时评估了两个组织,以确定组织特异性行为。后者在本研究中通过显示在同一实验中 RPE-脉络膜-巩膜相对于视网膜的代谢率动态范围增加来说明。其他报告描述了更广泛的研究设计,包括测量不同的 O2 水平对 OCR 和 LPR 的影响,以及燃料、药物和毒素的浓度依赖性20,21。此外,尽管我们将流出分数的分析限制在乳酸的测量和LPR的计算上,但如果测定流出分数中的多种化合物和化合物类别,例如激素、神经递质、细胞信号和可以离开细胞的代谢物,则实验的信息内容会大大增加20,22,23.
离体视网膜或RPE-脉络膜-巩膜的加载很简单,一旦分离出,只需用镊子将这些组织放入组织室的顶部,然后让其下沉到熔块中。在滤器插件上培养的 RPE 细胞在培养 4-8 周后产生适当的极化和 RPE 成熟标志物。如果要保持 RPE 成熟度和极化,一旦附着在跨孔膜上,去除用于活细胞分析的 RPE 是不可行的24。围灌注室可以容纳用手术刀切割的transwell膜条,同时浸没在缓冲液中并快速插入组织室。尽管切割滤条已被置于静态系统24中,但没有其他流体方法来评估这些重要的细胞类型。RPE细胞的反应比视网膜或RPE-脉络膜-巩膜更快、更动态,部分原因可能是RPE细胞的顶端和基底都立即进入,这些细胞被配置为膜插入物上的单层。
确保数据具有最高信噪比的另一个因素是选择加载到围灌注室中的组织相对于流速的最佳比例。相对于流速而言,组织太少会导致流入和流出之间的溶解 O2 浓度差异非常小且难以可靠测量。相反,如果流动太慢,则 O2 的浓度会变得如此之低,以至于组织会受到缺氧的影响。尽管如此,气体压力驱动的液体流量可以保持在低至 5 mL/min 的流速下,只需少量组织即可进行准确的 OCR 和 LPR 测量。在此所示的实验中,使用约20 mL / min /通道,适用于一个视网膜,两个RPE脉络膜硬化或360,000个RPE细胞。为了最大限度地减少延迟和分散组织暴露于注射的测试化合物的系统效应,提供了多种尺寸的组织室,以便组织量(和流速)与适当的腔室尺寸相匹配。
本文中显示的分析数据以两种方式表示:相对于速率的绝对幅度,或相对于稳态或基线的分数变化。重点是说明对测试化合物的反应的测量。然而,流体系统非常适合在围灌注分析(如基因修饰)之前评估和比较组织治疗的效果。如果分析了处理对测试化合物归一化反应的影响,则测试处理是否与对照不同是最可靠的。如果分析需要绝对量级,则如果在同一围灌注实验中进行预处理标本的评估和对照,则预处理标本分析的统计功效将最大化。
除搅拌器外,所有与液体接触的部件均由制造商作为消耗品提供,并已消毒。这些部件不应重复使用,因为由于清洁不彻底和表面污染,实验偶尔会丢失。设置开始时的系统是无菌的。然而,将培养基添加到MRM中,并在非无菌条件下将组织加载到腔室中。我们已经测量了系统中的 OCR,该系统由无菌部件组装而成,但实验本身是在非无菌条件下进行的。细菌积累到具有可测量的OCR(未发表的结果)大约需要14小时。如果使用的方案少于 10 小时左右,则细菌的积累和由此引起的任何影响都可以忽略不计。
许多研究人员使用的仪器旨在测量单层细胞静态孵育下的 OCR,具有相对较高的通量25,26。相比之下,我们在本文中测试和描述的流体仪器通过确保足够的 O2 输送来维持组织,这对于组织标本中存在的更大扩散距离至关重要。此外,它能够收集分数,允许与 OCR 并行评估多个参数,这大大增强了研究它们之间关系的能力。最后,可以控制溶解气体浓度(如 O 2 和 CO 2),从而增加使用碳酸氢盐基介质和缓冲液进行实验的持续时间,使用户能够研究 O2 的影响。应该指出的是,这两种方法的局限性是无法研究测试化合物的洗脱,这是其他围灌注系统所具有的功能 4,27,28。在确定最佳分析模式时,另一个考虑因素是流体系统比静态系统使用更多的介质和测试化合物。尽管由于可以使用的低流速,当前的流体系统将额外费用降至最低。
总体而言,描述了使用新的流量/评估仪器进行实验的协议的详细说明。使用视网膜和RPE-脉络膜-巩膜生成的数据概括了以前使用更难使用(且不易获得)的系统获得的结果。研究还表明,该系统可以维持和评估附着在transwell膜上的RPE细胞,这是一个非常重要的细胞模型,由于细胞的脆弱性,以前没有用流动系统进行过分析。该协议的主要部分包括 75 分钟的设置时间,然后是 90 分钟的平衡期和实验协议,使其适合不专门从事流体系统操作的实验室的常规使用。虽然我们专注于测量组织对测试化合物的急性反应,但该系统非常适合比较来自各种来源的组织,例如经过基因改变或经过测试处理/条件的动物模型或细胞模型。此外,可以对流出部分进行的检测范围很广,包括代谢物、细胞信号分子和分泌的激素/神经递质,以及通过质谱对馏分和组织进行的多组分分析。
The authors have nothing to disclose.
这项研究由美国国立卫生研究院 (R01 GM148741 IRS)、U01 EY034591、R01 EY034364、BrightFocus 基金会、预防失明研究 (J.R.C.) 和 R01 EY006641、R01 EY017863 和 R21 EY032597 (J.B.H.) 资助。
BIOLOGICAL SAMPLES | |||
C57BL/6J mice | Envigo Harlan (Indianapolis, IN) | N/A | |
REAGENTS | |||
FCCP | Sigma-Aldrich | C2920L9795 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270G | |
KCN | Sigma-Aldrich | 60178 | |
Lactate | MilliporeSigma | L6661 | |
Oliigomycin A | Sigma-Aldrich | 75351L9795 | |
CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING | |||
Beuthanasia-D | Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ | N/A | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital | Virbac | RXEUTHASOL | |
Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | 12303C | |
Hank’s Buffered Salt Solution | GIBCO | 14065056 | |
Krebs Ringer Bicarbonate (KRB) | Thermo Fisher Scientific | J67795L9795 | |
Matrigel | ThermoFisher | #CB-40230 | |
Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
ROCKi | Selleck Chemicals | Y-27632 | |
Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25-200-072 | |
SUPPLIES | |||
Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2 | Praxair Distribution, Inc | N/A | |
Transwell filters | MilliporeSigma | 3470 | |
COMMERCIAL ASSAYS | |||
Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit | ThermoFisher | A22189 | |
Glucose Oxidase from Aerococcus viridans | Invitrogen (Carlsbad, CA) | A22189L9795 | |
Lactate Oxidase | Sigma-Aldrich | L9795 | |
EQUIPMENT | |||
BaroFuse Multi-Channel Perifusion system | EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA | Model 001-08 | |
Synergy 4 Fluorometer | BioTek (Winooski, VT) | S4MLFPTA |