Summary
Real-time analyse van levend weefsel levert belangrijke functionele en mechanistische gegevens op. Dit artikel beschrijft de protocollen en kritische variabelen om te zorgen voor een nauwkeurige en reproduceerbare generatie van gegevens door een nieuw en pompvrij meerkanaals fluïdisch systeem dat een breed scala aan weefsel- en celmodellen onderhoudt en beoordeelt.
Abstract
Veel in vitro modellen die worden gebruikt om weefselfunctie en celbiologie te onderzoeken, hebben een stroom van media nodig om voldoende zuurstof en optimale celomstandigheden te bieden die nodig zijn voor het behoud van functie en levensvatbaarheid. Daartoe hebben we een meerkanaals stroomkweeksysteem ontwikkeld om weefsel en cellen in kweek te houden en continu de functie en levensvatbaarheid te beoordelen door middel van in-line sensoren en/of het verzamelen van uitstroomfracties. Het systeem combineert 8-kanaals, continue optische detectie van het zuurstofverbruik met een ingebouwde fractiecollector om tegelijkertijd de productiesnelheid van metabolieten en hormoonsecretie te meten. Hoewel het in staat is om een breed scala aan weefsel- en celmodellen te onderhouden en te beoordelen, waaronder eilandjes, spieren en hypothalamus, beschrijven we hier de werkingsprincipes en de experimentele preparaten/protocollen die we hebben gebruikt om bio-energetische regulatie van geïsoleerd muizennetvlies, retinaal pigmentepitheel (RPE)-choroïde-sclera van muizen en gekweekte menselijke RPE-cellen te onderzoeken. Innovaties in het ontwerp van het systeem, zoals pomploze vloeistofstroom, hebben geleid tot een sterk vereenvoudigde werking van een meerkanaals stromingssysteem. Er worden video's en afbeeldingen getoond die illustreren hoe het instrument moet worden geassembleerd, voorbereid op een experiment en hoe de verschillende weefsel-/celmodellen in de perifusiekamers moeten worden geladen. Daarnaast worden richtlijnen voor het selecteren van omstandigheden voor protocol- en weefselspecifieke experimenten afgebakend en besproken, inclusief het instellen van de juiste verhouding tussen stroomsnelheid en weefsel om consistente en stabiele kweekomstandigheden en nauwkeurige bepalingen van consumptie- en productiesnelheden te verkrijgen. De combinatie van optimaal weefselonderhoud en real-time beoordeling van meerdere parameters levert zeer informatieve datasets op die van groot nut zullen zijn voor onderzoek in de fysiologie van het oog en de ontdekking van geneesmiddelen voor de behandeling van verminderd gezichtsvermogen.
Introduction
Perifusiesystemen hebben een lange geschiedenis in de levenswetenschappen. In het bijzonder voor de studie van de secretoire functie door eilandjes, zijn ze gebruikt om de kinetiek van insulinesecretie te karakteriseren als reactie op secretagogen1. Naast het verzamelen van uitstroomfracties voor latere bepaling van hormonen en metabolieten, zijn real-time sensoren ingebouwd, voornamelijk voor de detectie van zuurstofverbruik 2,3,4. Wijdverbreide inspanningen om mechanismen die oogziekten mediëren beter te begrijpen, zijn beperkt door een gebrek aan fysiologisch relevante methoden om metabole regulatie en ontregeling van de verschillende geïsoleerde componenten van het oog te beoordelen, waaronder het netvlies, retinale pigmentepitheliale (RPE)-choroïde-sclera en gekweekte RPE-cellen. Statische systemen die zijn ontworpen voor gekweekte cellen zijn aangepast voor weefsel5, maar weefsel heeft stroming nodig voor voldoende zuurstofvoorziening. Flowsystemen zijn succesvol geweest in het nauwkeurig en reproduceerbaar meten van real-time reacties in zuurstofverbruik (OCR) door het netvlies en RPE-choroide-sclera, en de weefsels blijven metabolisch stabiel gedurende meer dan 8 uur, waardoor zeer informatieve protocollen met meerdere testverbindingen mogelijk zijn 4,6,7,8,9 . Desalniettemin heeft de werking van fluïdische systemen van oudsher een op maat gemaakt apparaat en opgeleid technisch personeel in niet-gestandaardiseerde methodologieën vereist. Dergelijke systemen zijn in de meeste laboratoria niet als standaardmethode aangenomen. De BaroFuse is een nieuw ontwikkeld fluïdisch systeem dat niet afhankelijk is van pompen, maar van gasdruk om de stroom door meerdere kanalen en weefselkamers te drijven (Figuur 1). Elk kanaal wordt continu gecontroleerd op OCR en de uitstroom wordt opgevangen met een plaatgebaseerde fractiecollector voor latere analyse van de inhoud. Belangrijk is dat de weefselperifusiekamers voor het instrument zijn ontworpen om weefsels van verschillende geometrieën en groottes te huisvesten.
Het hart van het instrument is het fluïdische systeem, waarbij de stroom wordt aangedreven van een verzegeld, onder druk staand reservoir door slangen met een kleine binnendiameter (ID) (die bijdragen aan de belangrijkste stromingsweerstand in het vloeistofcircuit) naar de glazen weefselkamers die het weefsel huisvesten. De druk naar de mediareservoirmodule (MRM) wordt geleverd door lagedruk- en hogedrukregelaars die zijn aangesloten op een gasfles die een mengsel van gassen bevat (meestal 21% O 2, 5% CO 2, balans N2), en het reservoir wordt van bovenaf afgesloten door de perifusiekamermodule (PCM) die de weefselkamerassemblages (TCA's) bevat. Het debiet wordt geregeld door de lengte en ID van de weerstandsbuizen en de drukinstelling van een lagedrukregelaar. Uitstroombuizen die zijn aangesloten op de bovenkant van weefselkamers leveren vloeistof aan een afvalcontainer (die continu wordt gewogen voor automatische bepaling van het debiet) of aan putten van een plaat met 96 putjes die wordt bestuurd door de fractiecollector. Het O2-detectiesysteem meet de levensduur van eenO2-gevoelige kleurstof die aan de binnenkant van elk van de glazen weefselkamers stroomafwaarts van het weefsel is geschilderd. Deze informatie wordt vervolgens gebruikt om de OCR continu te berekenen. Het gehele fluidics-systeem bevindt zich in een temperatuurgecontroleerde behuizing en de gastank, de fractiecollector en de computer zijn de belangrijkste componenten van het instrument (Figuur 2A). Ten slotte dient de software die het instrument bestuurt om de werking ervan te regelen (inclusief de voorbereiding en timing van geïnjecteerde testverbindingen, het stroommeetsysteem en de timing van de fractiecollector), evenals het verwerken en grafieken maken van de OCR-gegevens en andere aanvullende metingen.
In dit artikel beschrijven we de protocollen voor het gebruik van het fluïdische systeem om OCR en lactaatproductiesnelheid (LPR) voor verschillende geïsoleerde componenten van het oog te perifuseren en te beoordelen. LPR is een parameter die de glycolytische snelheid weerspiegelt en die zeer complementair is aan OCR, waarbij het paar verantwoordelijk is voor de twee belangrijkste takken van energieopwekking uit koolhydraten in de cel10. Aangezien de voorbereiding van het weefsel en het laden ervan in de weefselkamers het beste kan worden geleerd door de procedure te bekijken, zal de video helpen bij het illustreren van verschillende van de kritieke stappen die worden uitgevoerd tijdens het instellen en bedienen en die niet gemakkelijk kunnen worden overgebracht door tekst alleen.
De beschrijving van het protocol is opgedeeld in 8 secties die overeenkomen met verschillende fasen van het experiment (Figuur 2B): 1. pre-experimentele voorbereiding; 2. bereiding/evenwicht van het perifusaat; 3. Opzetten van het instrument; 4. weefselevenwicht; 5. experimenteel protocol; 6. instrument defect; 7. Gegevensverwerking; en 8. Analyse van uitstroomfracties.
Protocol
Alle procedures voor het oogsten van weefsel van ratten en muizen zijn goedgekeurd door de University of Washington Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Pre-experimentele voorbereiding
OPMERKING: De volgende taken moeten ten minste een dag voor het experiment worden voltooid.
- Ontwerpen van het experimentele protocol
- Toewijzing van weefselplaatsing in kanalen: Kies een weefsel- of celmodel dat in 3 van de 4 kanalen aan elke kant van de MRM moet worden geplaatst. Aan elke kant wordt één weefselkamer gebruikt zonder weefsel dat kan worden gebruikt voor basislijncorrectie.
- Rangschik de monsters met behulp van een van de twee typische ontwerpen - verschillende protocollen voor testverbindingen aan elke kant (bijv. kanalen aan de ene kant van de MRM ontvangen testverbindingen terwijl de kanalen aan de andere kant als controle fungeren); hetzelfde injectieprotocol voor testverbindingen aan beide zijden van de MRM, maar verschillende weefsels of weefselmodellen versus controle aan weerszijden van de MRM.
- Selectie van debiet en weefselhoeveelheid voor optimale OCR-meting: Pas het debiet aan totdat de verandering in levensduurverhouding maal 100 ongeveer 3 is.
OPMERKING: Typische hoeveelheden weefsel en bijbehorende stroomsnelheden worden weergegeven in tabel 1 voor componenten van het oog, waar het instrument het beste functioneert bij stroomsnelheden tussen 6-80 μL/min/kanaal. - Berekening van het vereiste media/buffervolume: Bereken het volume van de media die aan het begin van het experiment aan elk MRM-inzetstuk moet worden toegevoegd als
VolumeMRM = 30 ml + duur van het protocol (in min) x debiet (in ml/min) x 4 kanalen (Eq.1)
Bijvoorbeeld, bij 0,01 ml/min zal een 60 ml startvolume MRM een 12,5 uur protocol mogelijk maken (waarbij 30 ml zal worden uitgeput, terwijl 30 ml zal overblijven), terwijl bij 0.04 ml/min, 90 ml startvolumeMRM een 6 uur protocol mogelijk zal maken (met 30 ml overblijvend). - Injectieprotocol voor testverbindingen: Selecteer de testverbindingen om te beoordelen, de te testen concentratie (meestal gekozen om een bijna maximale respons op te leveren of als concentratieafhankelijkheden) en de duur van de blootstelling. Houd rekening met de oplosbaarheid en vul voorraden aan in het gewenste oplosmiddel zoals water, DMSO of ethanol.
- Selecteer de timing van injecties en volgende injecties, zodat de respons een stabiele toestand bereikt voordat een volgend middel wordt toegevoegd. Pas bij het herhalen van protocollen de timing van injecties aan, zodat het gemiddelde van meerdere tijdskuren kan worden genomen.
OPMERKING: De hier gebruikte verbindingen zijn afkomstig van een eerdere mitochondriale (Mito) stresstest 11 en zowel oligomycine als carbonylcyanide 4-(trifluormethoxy)fenylhydrazon (FCCP) vereisen DMSO, zowel in de voorraadoplossingen als in het uiteindelijke perifusaat. - Uitstroombemonsteringstijden: Selecteer de gewenste fractie-verzamelintervallen (van 1-60 min/monster), waarbij snellere bemonsteringsfrequenties worden gekozen voor snelle veranderingen en langere tijdsintervallen worden gekozen naarmate de stationaire toestand wordt benaderd. Gebruik voldoende putvolumes (0,3 tot 1,5 ml) om overlopen tijdens het bemonsteringsinterval te voorkomen (kies volumes die groter zijn dan het debiet x het tijdsinterval).
OPMERKING: De bemonsteringstijden zijn afhankelijk van de keuze van het protocol, maar voor een Mito-stresstest hebben we gewoonlijk intervallen van 5 minuten gebruikt tijdens de basislijn en intervallen van 15 minuten tijdens de injecties (-15, -10, -5, 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, waarbij elke keer het begin van het bemonsteringsinterval is). - Voer de hierboven beschreven geselecteerde waarden voor testverbindingen en fractieverzameling in de gebruikersinterface (UI) in, die grafische weergaven van deze informatie genereert. Exporteer en verspreid bestanden voor groepsevaluatie en discussies (aanvullende figuur 1).
- Leg de accessoires en verbruiksonderdelen klaar
- Vermeld de benodigdheden die door de fabrikant zijn geleverd en aseptisch zijn voorverpakt, waaronder: TCA's (pakket van 8), uitstroomslangen (pakket van 8 buizen), injectieslangen van testverbindingen (2), pincetten, slangklemmen (3), MRM, MRM-inzetstukken (2), roerstaven (2) en spoelslangen (geplaatst in een biologische veiligheidskast).
- Gebruik wegwerponderdelen die in contact komen met vloeistof niet opnieuw, omdat dit zal leiden tot een toename van het falen van experimenten. Hergebruik de pincet en roerstaven door ze tussen de experimenten door schoon te maken en in de autoclaaf te zetten.
2. Bereiding en balancering van perifusaat (Tijd: 30 min exclusief incubatietijd)
- Bereid het medium of de Krebs-Ringer-bicarbonaatbuffer (KRB) de dag ervoor voor op basis van berekeningen uit vergelijking 1, meestal 200 ml, en incubeer vervolgens een nacht in een incubator van 39 °C/5% CO2 in T225-weefselkweekkolven met niet meer dan 90 ml in elke kolf.
- Bij gebruik van commercieel bereide KRB of media (opgewarmd tot kamertemperatuur), bereid het perifusaat op de ochtend van het experiment en plaats het gedurende ten minste 1 uur in de 5% CO2 -incubator. Bereid alle oplossingen aseptisch voor.
OPMERKING: Alle vloeistoffen en onderdelen van het fluidics-systeem die in contact komen met vloeistof zijn aan het begin van het experiment steriel. De assemblage van het systeem en het laden van het weefsel wordt echter open naar de lucht uitgevoerd.
3. Evenwicht van temperatuur en opgelost gas om het instrument in te stellen (Tijd: 75 min)
- Bevestiging van slangassemblages aan de MRM
- Plaats de MRM en een fluidics-pakket op de bank naast het instrument. Zorg ervoor dat de slangklemmen (3), roerstaven (2) en pincetten al op de gereedschapsbak zitten.
- Plaats een ongebruikt MRM-inzetstuk met een roerstaaf aan elke kant van de MRM (zie afbeelding 3).
- Bevestig de TCA's aan injectiepoorten aan beide uiteinden van de MRM, zodat het uiteinde van de slang direct boven de roerstaaf wordt geplaatst. Zorg ervoor dat de langste van de twee injecties van het testmiddel zich op de achterkant van de MRM bevindt.
- Bevestig vervolgens de gastoevoerleiding en de ontluchtingsslang aan respectievelijk de achterste en voorste lege poorten (zie afbeelding 4A).
- Plaatsen van de MRM/slangassemblages in de behuizing
- Plaats de MRM (met de slangen bevestigd) in de MRM-verwarmer (Figuur 4B).
- Plaats de vier slangassemblages in de groeven van de wanden in de bodem van de behuizing (twee aan elke kant) zodat ze naar de buitenkant van de behuizing uitsteken zodra de middelste behuizing op zijn plaats is geplaatst.
- Zet de MRM tussen de klemmen vast door de twee wielen op de detectorstandaard vast te draaien.
- Voer de langere injectieeenheid van het testmiddel die uit de achterkant van de behuizing steekt door de twee buisgeleiders aan de zijkant van de behuizing, zodat de opening van de buizen naar voren wijst (Figuur 4C).
- Klem elk van de gesloten injectiesamenstellingen van de teststof vast.
- Montage van de behuizing en activering van de temperatuurregelaars
- Zet de stekkerdoos die alle elektrische apparaten in de behuizing van stroom voorziet in de AAN-stand. De ventilator op de detectorstandaard gaat AAN en de MRM-temperatuurregelaar moet oplichten met een ingestelde waarde van 38 °C (Figuur 5).
- Zet de roerders AAN tot 70 tpm met behulp van de gebruikersinterface om ervoor te zorgen dat de roerstaven soepel draaien. Zodra goed roeren in acht is genomen, schakelt u de roerders uit.
- Plaats het middelste gedeelte van de behuizing bovenop de basis.
- Sluit de kabel op het middelste gedeelte van de behuizing aan op de kabel van de elektriciteitskast om de hendelschakelaar van de omgevingstemperatuurregelaar van stroom te voorzien en de omgevingstemperatuurverwarming van stroom te voorzien.
- Plaats het deksel op de behuizing en het display van de bovenste temperatuurregelaar (de omgevingstemperatuurregelaar) licht op en geeft 36 °C aan. Start een timer gedurende 30 minuten, de tijd die de MRM-verwarmer nodig heeft om de ingestelde temperatuur te bereiken.
- De TCA's in het PCM invoegen
- Gebruik het TCA-inbrenggereedschap om elk van de 8 TCA's in de PCM-gaten te steken door stevig op de adapter te drukken met de voorkant van het inbrenggereedschap totdat de bovenkant van de slanghuls die om de weefselkamer is gewikkeld, het oppervlak raakt dat de gaten in de PCM omschrijft.
- Plaats een TCA volledig voordat u de volgende plaatst. Leg de gedeeltelijk gemonteerde PCM opzij naast de PCM-beugel en 6 schroeven.
NOTITIE: Onvolledige insertie van een TCA voorkomt dat de hoofdruimte het drukinstelpunt bereikt en perifusaat zal niet stromen.
- Vullen van de twee inserts in de MRM met vooraf geëquilibreerd perifusaat
- Om dit te doen, brengt u 30 minuten nadat de behuizing is gemonteerd en de MRM de temperatuur heeft bereikt, het vooraf uitgebalanceerde perifusaat over in het voorverwarmde MRM-inzetstuk door de vloeistof voorzichtig langs de zijkanten te doseren met behulp van een pipet van 50 ml.
OPMERKING: Deze stappen, evenals die in punt 3.6, moeten onmiddellijk worden uitgevoerd om overdracht van gas tussen het perifusaat in de MRM en de atmosfeer te voorkomen.
- Om dit te doen, brengt u 30 minuten nadat de behuizing is gemonteerd en de MRM de temperatuur heeft bereikt, het vooraf uitgebalanceerde perifusaat over in het voorverwarmde MRM-inzetstuk door de vloeistof voorzichtig langs de zijkanten te doseren met behulp van een pipet van 50 ml.
- Montage van de MRM/PCM om een gasdichte afdichting te creëren en positionering van de O2 detector
- Plaats de PCM op de MRM door de weerstandsbuizen van de TCA's die uit de onderkant van de PCM komen in de MRM-inzetstukken te steken, 4 aan elke kant van de MRM-verdeler. Richt de PCM zo dat de weefselkamers tegen deO2-detector kunnen rusten zodra deze is gepositioneerd.
- Zet de PCM en de PCM-steunbeugel vast met de 6 schroeven met behulp van de elektrische schroevendraaier.
- Zet de TCA's vast in de PCM-steunvinnen met de meegeleverde elastische band door deze rond de vinnen van de PCM te spannen ter hoogte van de rubberen pakkingen (Figuur 6).
- Plaats de O2-detector op de detectorstandaard zodat de voorkant ervan tegen de vinnen van de PCM rust. Controleer of de LED-/fotodetectorparen op één lijn liggen met deO2-gevoelige kleurstof in de weefselkamers. Stel indien nodig de zijgeleiders van de O 2-detector af nadat u de stelschroeven aan de zijkant van de O2-detectorhouder hebt losgedraaid.
- Plaats het deksel op de behuizing.
- Het in evenwicht brengen van het gas in de hoofdruimte in de MRM met het perifusaat
- Met de hogedrukklep volledig vastgezet en gesloten, opent u de klep van de gastank door de cilinderklep bovenop de tank tegen de klok in te draaien.
- Stel de hogedrukregelaar in op een druk van 10 psi met behulp van de knop op de regelaar.
- Zet de MRM onder druk door de lagedrukregelaar in te stellen op 1.0 psi (Figuur 7A).
- Maak de ontluchtingsbuis (Figuur 7B) los zodat het gas uit de tank de lucht in de MRM-vrije ruimte kan vervangen (de injectoren van de teststof blijven vastgeklemd) gedurende 15 minuten. Bevestig de gasstroom door het uiteinde van de spoelbuis onder te dompelen in een beker water om het borrelen te observeren.
- Zodra het debiet is bevestigd, start u de O2-detector zoals hieronder beschreven in paragraaf 3.8.
- Zet de roerder na 15 minuten aan op 70 toeren per minuut en laat de rest van het experiment draaien. Klem na nog eens 15 minuten de spoelslang vast (Figuur 7C).
- Verlaag de druk op de lagedrukregelaar tot de werkdruk die het gewenste vloeistofdebiet bereikt (zoals gespecificeerd door het experimentele pakket - meestal tussen ongeveer 0.5-0.7 psi). Als het debiet hoger is dan 20 μL/min, stel dan tijdelijk de druk in op 0.3 psi om tijd te geven om het weefsel te laden zonder dat de kamers overlopen. Dit is niet nodig als het weefsel binnen 15 minuten na het plaatsen van de klem wordt belast.
NOTITIE: Laat de buffer niet langs de buitenkant van de weefselkamer lopen, aangezien de vloeistof deO2-detectie kan verstoren.
- Starten van de O2 detector
- Activeer de O2-detectorsoftware op de laptop door op het pictogram met het label Zuurstofdetector te klikken.
- Zodra het programma is geopend (aanvullende afbeelding 2), controleert u of de juiste COM-poort is geselecteerd. Indien nodig kan de COM-poort worden geïdentificeerd door de O2-detector los te koppelen en aan te sluiten op de computer, zodat het poortnummer wordt weergegeven. Als de COM-poort wordt losgekoppeld terwijl de toepassing actief is, moet de toepassing voor gebruik worden gesloten en opnieuw worden geopend.
- Klik op Start en vervolgens op Opnemen (en sla de gegevens op in de back-upmap). Klik vervolgens op Grafiek.
- Verander de gemiddelde waarde linksonder in de levensduurgrafiek naar 5 (die het programma instrueert om een voortschrijdend gemiddelde te berekenen met 5 opeenvolgende punten). Nadat er een minuut is verstreken en het eerste gegevenspunt wordt weergegeven op het grafiekscherm, klikt u op Automatisch schalen.
4. Weefsellaad- en evenwichtsperiode (Tijd: 90 min)
- Positionering van de fritten in de weefselkamers
- Verwijder het deksel en het middelste gedeelte van de behuizing.
- Nadat het perifusaat in de weefselkamers boven de bovenkant van de vooraf geplaatste fritte is gestegen, duwt u de fritte naar beneden met de fritte-cue door lichtjes op de bovenkant van de fritte te tikken om eventuele luchtbellen te verwijderen die zich onder of in de fritte hebben gevormd.
- Plaats fritten ongeveer 0.25 inch boven de bodem van de weefselkamer.
- Weefsel in de weefselkamers laden
- Zodra het medianiveau 0.5 inch van de bovenkant is, laadt u het weefsel in de kamer.
- Retina of RPE-choroide-sclera laden: Oogst Retina of RPE-choroide-sclera zoals beschreven in 6. Om het weefsel te laden, gebruikt u een pincet met een fijne punt om het weefsel voorzichtig in elke kamer te plaatsen, waarbij u ervoor zorgt dat u het weefsel niet vouwt, terwijl u een doekje gebruikt om te voorkomen dat vloeistof uit de weefselkamer op de O2-sensor druppelt. Observeer weefsel dat naar en op de frit zakt.
OPMERKING: Tussen het moment van het oogsten van het weefsel en het laden van weefsel in de kamers, moet u ervoor zorgen dat trauma aan het weefsel wordt vermeden door het weefsel niet langer dan 10 minuten in een op bicarbonaat gebaseerde buffer/media uit de incubator te laten en ervoor te zorgen dat het weefsel baadt in voldoende buffer/media (ten minste 1 ml/10 mg weefsel) om te voorkomen dat het weefsel hypoxisch wordt en blootstelling aan lucht wordt voorkomen. - Laden van RPE-cellen op transwellmembranen: Bereid RPE-cellen voor zoals eerder beschreven 12 en in aanvullend bestand 1. Doorgangscellen met 0,25% trypsine-EDTA en zaad op polyethyleentereftalaat, spoorgeëtste filters (celkweekinzetstukken, poriegrootte 0,4 mm) met een minimum van 2,0 x 105 cellen/cm2. Snijd op de dag van het experiment de vliezen in drie stroken van gelijke breedte en laad ze met een pincet in de weefselkamers (zie figuur 8A).
- Bevestiging van de uitstroomslangassemblages aan weefselkamers
- Haal de uitstroomslangassemblages uit de verpakking en plaats de uitstroomslangafscheider op de lip van het middelste gedeelte van de behuizing, zodat de uitstroomslangadapters zich aan de binnenkant van de behuizing bevinden (Figuur 8B,C).
- Zorg ervoor dat u niet te hard op de TCA's drukt (anders komen ze los van de MRM), en bevestig de uitstroomslangadapters aan de bovenkant van de TCA's van de weefselkamers (Figuur 8D). Plaats het midden van de behuizing terug en sluit de kabel voor de omgevingstemperatuurregeling weer aan.
- Voordat u het deksel van de behuizing terugplaatst, moet u controleren of de componenten van het fluidics-systeem in de behuizing, inclusief de O2-detector , PCM, weefselkamers, uitstroombuizen, MRM en verwarming, allemaal correct zijn geplaatst, zoals weergegeven in afbeelding 8E.
- Plaats het deksel van de behuizing terug. Voer de acht uitstroombuizen door de geleidingsarm van de fractiecollector.
- Activeren van de breukverzamelaar
- Zorg ervoor dat de fractiecollector gecentreerd is ten opzichte van de rechterwand van de behuizing en de uitstroombuishouder: de linkersteun van de basis van de fractiecollector moet tegen de rand van de behuizingswand rusten.
- Klik op de laptop op de UI-snelkoppeling en de experimentele infopagina wordt geopend (aanvullende afbeelding 3 bovenaan).
- Vul de informatie in de daarvoor bestemde vakken op de experimentele infopagina in (dit kan worden gedaan voordat het experiment begint) en klik vervolgens op de pagina Flow & Fracture Collector bovenaan (aanvullende figuur 3 onderaan).
- Parameters instellen voor geautomatiseerde debietmeting
- Selecteer de gewenste integratietijd in het vervolgkeuzemenu Sample-acquisitietijd in het midden bovenaan, waarbij de gewenste nauwkeurigheid (die evenredig is met de integratietijd) en de temporele resolutie in evenwicht worden gebracht.
- Als er geen uitstroomfracties worden verzameld in het experiment, klikt u op Start en gaat u naar sectie 4.7. Als er uitstroomfracties worden verzameld, voer dan de stappen uit in paragraaf 4.6.
- Opvangen van uitstroomfracties
- Vink in de UI-software de optie Breuken verzamelen? op de pagina met experimentinformatie of op de pagina Flow & Fracture Collector. Klik vervolgens op de knop Compute FC-instellingen .
- Wanneer het nieuwe venster wordt geopend, vult u het tijdstip van de eerste injectie in het protocol in (gedefinieerd als tijd = 0) en het debiet per kanaal, evenals de tijdsintervallen voor elk monster. Klik vervolgens op Berekenen.
- Zodra de intervallen van de verzameling zijn geverifieerd, klikt u op Genereren en starten.
- Meten van debieten voor afzonderlijke kanalen (optioneel)
- Als de stroomsnelheden van afzonderlijke kanalen moeten worden gemeten (die onder normale omstandigheden slechts enkele procenten afwijken), weeg dan acht (of minder) microcentrifugebuisjes en noteer hun gewicht.
- Plaats de buishouder met de voorgewogen microcentrifugebuisjes op de platenwagen. Klik op Debiet handmatig meten in het gedeelte met andere hulpprogramma's.
- Selecteer de duur van de meting en klik vervolgens op Sjabloon genereren. Sluit het venster en klik op Start. De fractiecollector verzamelt vloeistof uit de uitstroombuizen voor de meetduur en daarna keert de arm terug naar zijn uitgangspositie.
- Weeg de microfuge-buisjes na het verzamelen en gebruik het verschil in gewicht gedeeld door de meetduur om het debiet te berekenen (waarbij 1 mg = 1 μL).
- Stabilisatie van de basislijn
- Zodra het weefsel en/of de cellen in de weefselkamers zijn geladen, laat u het systeem gedurende 90 minuten in evenwicht komen om een vlakke basislijn vanO2-verbruik vast te stellen, waarna de eerste teststof kan worden geïnjecteerd (beschouwd als tijd = 0).
- Voer 30 minuten voor de eerste injectie de gemiddelde waarde van de laatste 3 FR per kanaal in op de injectiepagina voor het voorbereiden van injecties met testverbindingen.
5. Experimenteel protocol (Tijd: 2-6 uur)
OPMERKING: Zodra de basislijnstabilisatie aan de gang is, zijn de volgende taken het injecteren van de testverbindingen en het verwisselen van platen op de fractiecollector als er meer dan één wordt gebruikt.
- Bereiding van teststof injecteren
- Voer de namen van de verbindingen, de gewenste concentraties (eind- en voorraadoplossingen) en de injectietijden van de testverbindingen in de tabel in de gebruikersinterface op de injectiepagina in. Bevestig de informatie die in het programma wordt weergegeven, inclusief de volumes in de MRM die nog over zijn op het moment van de injecties en hoeveel stockoplossing moet worden geïnjecteerd om de gewenste concentraties te bereiken (aanvullende figuur 4).
- Om te berekenen hoeveel perifusaat en voorraad nodig zijn voor de injectie, vult u de witte vakjes van de injectietabel in en klikt u op Berekenen. Verdun de oplossing van de teststof vóór de injectie met perifusaat, zodat het geïnjecteerde volume na injectie 5% van het volume in de MRM bedraagt.
- Bereid elke teststof voor door de stockoplossing en het perifusaat te mengen. Vul de spuiten ten minste 10 minuten voor de injectietijd en bewaar ze in een CO2 -incubator (op temperatuur tussen 37-40 °C) tot ze klaar zijn om te injecteren.
- Injecteren van teststoffen
- Sluit de spuit met het testmiddel aan op de injectieleidingen (Figuur 9A). Maak de zachtwandige slangen die naar de injectieleiding leiden los en injecteer langzaam testverbindingen (Figuur 9B) met een snelheid van ongeveer 3 ml/min. Klem de slang weer vast op de injectieleiding en verwijder vervolgens de spuit (Figuur 9C); herhaal dit voor de andere kant van de MRM.
- Bereid na het injecteren van elk testmiddel elk volgend testmiddel voor dat moet worden geïnjecteerd volgens de UI-injectiepagina.
- Bepalen van het instroom O2-signaal voor elk kanaal
- Injecteer aan het einde van elk experiment de respiratoire remmer KCN (3 mM) om het instroomsignaal voor elk kanaal te bepalen dat wordt gebruikt om te corrigeren voor de variatie in de levensduur van de basissensor en het niet-mitochondriale zuurstofverbruik.
6. Beëindigen van het experiment en afbreken van het systeem (Tijd: 30 min)
- Zuurstofgegevens opslaan
- Klik op de knop Opslaan in de linkerbovenhoek van het grafische venster van de zuurstofdetectorsoftware; Geef het bestand een naam en sla het op in de map waar het bestand wordt bewaard. Klik op de Stop opname knop in het hoofdvenster om het back-upbestand op te slaan.
- Het experimentele infobestand van de gebruikersinterface opslaan
- Klik op de knop Profiel opslaan in de linkerbovenhoek van de algemene pagina van de gebruikersinterface; Geef het bestand een naam en sla het op in de map waar het bestand wordt bewaard. Klik op de pagina Breuk en stroom van de gebruikersinterface op het vervolgkeuzemenu Extra en vervolgens op Opslaan. Behoud de gegenereerde naam of kies een andere en sla het bestand op waar gewenst. Indien nodig zijn er back-upbestanden die kunnen worden geopend en opgeslagen.
- Het instrument afbreken
- Aangezien KCN vluchtig is, moet u fluidics-assemblages in een zuurkast weggooien; giet media uit de MRM- en FC-afvalbak in een afvalcontainer en spoel de MRM-inzetstukken en roerstaven grondig af met water. Giet de inhoud van de afvalcontainer (met KCN) in een gelabelde container voor chemisch afval voor verdere verwijdering door chemische veiligheid. Reinig en autoclaaf de roerstaven en pincetten voorafgaand aan het volgende experiment grondig.
7. Gegevensverwerking (Tijd: 15-45 min)
- Open de gegevensverwerkertoepassing op een Mac- of pc-computer. Selecteer het .csv gegevensbestand dat door een experiment is gegenereerd. Als het protocol van dit experiment vergelijkbaar is met een eerder geanalyseerd experiment, selecteert u dat instellingenbestand en klikt u op Volgende stap. Klik anders op Volgende stap om de instellingen van het experiment in te voeren.
- Vul de verschillende instellingen van het experiment in. Selecteer bij het bepalen van het referentietijdstip het tijdstip direct voordat de KCN van kracht werd en de levensduurwaarden daalden. Selecteer dit punt met behulp van een schuifregelaar of door de tijdwaarde in het vak te typen.
- Klik op Berekenen om OCR-grafieken te genereren volgens vergelijking 2:
OCR = ([O 2]in- [O 2]uit) x FR = (217 nmol/ml - [O 2]uit) x FR/weefselbasis (Eq. 2)
waarbij de O 2-concentratie in KRB in evenwicht met 21% O2 bij 37 °C 217 nmol/ml is, FR de stroomsnelheid is (in ml/min), weefselbasis de hoeveelheid weefsel die in de kamer is geladen (d.w.z. aantal netvliezen, RPE-choroïde-sclera of RPE-cellen). - Sla de grafieken op als .pdf bestanden door op de knop Grafiek exporteren te drukken. Maak een grafiek van OCR als absolute waarden of als een fractie van een steady-state-waarde door de vakjes aan te vinken die overeenkomen met de teststof die op 1 moet worden gezet op de pagina met bewerkingsinstellingen.
8. Analyse van uitstroomfracties
- Als de monsters niet onmiddellijk na het experiment kunnen worden getest, worden de platen bij 4 °C geplaatst als ze de volgende dag worden getest, of ingevroren als ze langer worden bewaard. Als de platen bevroren zijn, ontdooi de monsters dan bij 4 °C (zodat de monsters koud blijven).
- Zodra tests zijn uitgevoerd op de geselecteerde uitstroomfracties, worden de kolommen met gegevens (één per kanaal) ingevoerd in een .csv bestand met tijd (in min) in de meest linkse kolom en concentratie in de rechter (in nmol/ml of ng/ml); Een link in het gegevensverwerkingsprogramma uploadt een sjabloon.
- Upload dit bestand naar de gegevensverwerker om de gegevens te berekenen en te plotten.
Representative Results
Om de resolutie van de gegevens die zijn gegenereerd uit geïsoleerde componenten van het oog te illustreren, werden OCR en LPR gemeten met drie soorten weefsel (netvlies, RPE-choroïde-sclera en RPE-cellen) volgens een veelgebruikt protocol (de mitochondriale stresstest10; Figuur 10, Figuur 11 en Figuur 12). De hoeveelheid weefsel die voor elk weefsel wordt gebruikt, is weergegeven in tabel 1. De gegevens werden verwerkt en in grafieken weergegeven met behulp van het softwarepakket dat voor het fluidics-systeem werd ontwikkeld. De voorbereiding van retina en RPE-choroide-sclera is relatief eenvoudig en duurt minder dan 20 minuten voor elk weefseltype. OCR was constant gedurende de tijd dat teststoffen werden geïnjecteerd, wat wijst op een stabiele gezondheid en functie van het weefsel en de validiteit van de methode ondersteunt (figuur 10). Eenmaal gevalideerd voor elk weefseltype, hebben we het niet nodig gevonden om controles uit te voeren waarbij geen testverbindingen worden geïnjecteerd voor elk experiment. In overeenstemming met gegevens verkregen met behulp van meer conventionele perifusiemethoden 6,8,13, OCR afname als reactie op oligomycine en verhoogde OCR als reactie op FCCP. Veranderingen in LPR waren in de tegenovergestelde richting van die waargenomen voor OCR: oligomycine verhoogde LPR, die vervolgens afnam (maar slechts licht) als reactie op FCCP (Figuur 11). Om de statistische significantie van het effect van elke sequentiële teststof te vergelijken, werden t-tests uitgevoerd (die automatisch worden berekend door de software die bij het instrument wordt geleverd). Aangezien het doel van het artikel was om te beschrijven hoe de methode moest worden uitgevoerd, was het aantal uitgevoerde replicaten niet altijd hoog genoeg om statistische significantie te produceren. Over het algemeen echter, wanneer het aantal replicaten 3 of meer was, waren de effecten van FCCP en oligomycine op zowel OCR als LPR significant.
RPE-cellen zijn niet eerder geanalyseerd met flowsystemen, maar reageerden op dezelfde manier op RPE-choroide-sclera (in overeenstemming met de opvatting dat een groot deel van OCR te wijten is aan RPE-cellen; Figuur 11). Deze illustratieve voorbeelden benadrukken het vermogen van het systeem om de levensvatbaarheid van weefsels te behouden, zoals blijkt uit de stabiliteit van OCR in de controlekanalen, en de hoge signaal-ruisverhouding voor veranderingen in OCR van de omvang die wordt geïnduceerd door oligomycine en FCCP, die meer dan 100 op 1 was. Bovendien kunnen analyses van uitstroomfracties worden gebruikt om de opnamesnelheid of productie van een breed scala aan verbindingen die worden uitgewisseld met de extracellulaire vloeistof te correleren, wat complementair is aan OCR (in dit geval LPR). Deze kenmerken van het instrument maakten een nauwkeurige kwantificering mogelijk van karakteristieke verschillen in weefselresponsen tussen weefseltypes die parallel werden uitgevoerd. OCR door RPE-choroïde-sclera en RPE-cellen zijn consequent gevoeliger voor oligomycine dan voor netvlies (Figuur 11 en Figuur 12), hoewel voor de RPE-choroïde-sclera de duur van de blootstelling aan FCCP niet lang genoeg was om de steady state te bereiken. Een aandachtspunt ontstond bij het gebruik van DMSO als oplosmiddel. Bij hogere concentraties (0,2%) had DMSO een voorbijgaand effect op OCR door het netvlies (vermoedelijk als gevolg van een effect van een verandering in osmotische druk veroorzaakt door het effect van DMSO op de membraanpermeabiliteit).
Op basis van de veronderstelling dat KCN de ademhaling volledig remt door zijn directe werking op cytochroom-c-oxidase, wordt OCR aan het einde van de KCN-blootstelling op 0 gezet en worden alle OCR-waarden berekend op basis van de verandering ten opzichte van de KCN-waarde. OCR kan onafhankelijk van de ademhalingsketen en cytochroom-c-oxidase optreden. De omvang van deze bijdrage aan de totale OCR is echter over het algemeen niet meer dan een paar procent (gegevens niet getoond) en de langere tijd dat weefsel wordt blootgesteld aan KCN zorgt ervoor dat substraten van oxidasen die geen deel uitmaken van de elektronentransportketen zijn uitgeput.
Statistische analyse
Enkelvoudige experimenten werden getoond zoals aangegeven in de figuren, maar met meerdere kanalen die gemiddeld waren. De gegevens werden vervolgens in een grafiek weergegeven als het gemiddelde ± de standaardfout (SE; berekend als SD/√n).
Figuur 1. Schema van het fluïdica/beoordelingssysteem. Belangrijke componenten zijn onder meer de behuizing, temperatuurregelelementen, fluïdica- en weefselkamersystemen, regeling van de gasdruk in de hoofdruimte boven perifusaat, fractiecollector/debietbewaking enO2-detectoren . Afkortingen: MRM = Media Reservoir Module, PCM = Perifusion Chamber Module, TCA = Tissue Chamber Assemblies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. (A) Afbeelding van de belangrijkste onderdelen van het instrument. De belangrijkste componenten bestaan uit een gastank (drukregelaars), behuizing, fractiecollector en computer. (B) Experimenteel stroomschema met de belangrijkste categorieën stappen en de tijd die nodig is om ze te voltooien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Zicht op de MRM. De MRM wordt weergegeven met een MRM-inzetstuk (links) en roerstaven (rechts) die in de onderkant van de MRM-inzetstukken zijn geplaatst (aan weerszijden van de MRM-verdeler). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Slangassemblage en spoelslangassemblage in de MRM. (A) De injectieslang van de testverbinding en de spoelslang die aan de poorten van de MRM zijn bevestigd. (B-C) De injectie van de testverbinding en de spoelslang (B) worden in de groef aan de voorkant van de behuizing (C) geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. De MRM-temperatuurregelaar inschakelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Weefselkamers en gastank. Het plaatsen van de O2-detector op de detectorstandaard (die ook de MRM en PCM ondersteunt) en het plaatsen van de band rond de vinnen van de PCM die helpen de weefselkamers op hun plaats te houden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. (A) Hoge- en lagedrukregelaars op de gastank. (B-C) Spoel de buis door. De ontluchtingsbuis zorgt ervoor dat de hoofdruimte in de MRM lucht kan vrijmaken en zich kan vullen met gas uit de toevoertank. Foto's van de open ontluchtingsbuis (B) en de dichte ontluchtingsbuis (C). De injectie-eenheid van de testverbinding blijft gesloten tijdens het zuiveringsproces. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8. Weefselkamer en de uitstroomopstelling. (A) Afmetingen van het Transwell-membraan nadat het in drie stroken van gelijke breedte is gesneden. (B) Uitstroom multi-tube ondersteuning. (C) Uitstroomsteun met meerdere slangen op de lip van de behuizing met de slangadapters in de buurt van de weefselkamers. (D) Foto van uitstroomslangen die aan de weefselkamers zijn bevestigd. (E) Luchtfoto van de behuizing zonder het deksel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9. Injectie van verbinding in MRM. Het injecteren van een teststof via de injectiepoort in de MRM met behulp van een spuit van 5 ml. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10. OCR- en LPR-curven als reactie op testverbindingen. OCR en LPR door netvlies geïsoleerd van muizen (1 netvlies/kanaal) als reactie op de aan- of afwezigheid (controle) van testverbindingen zoals aangegeven. Elke curve is het gemiddelde van 6 replicaten van een enkel experiment (foutbalken zijn SE; p-waarden worden berekend door gepaarde t-tests uit te voeren waarbij de steady-state-waarden voor elk testmiddel worden vergeleken met die van het vorige testmiddel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11. OCR-curves. OCR door RPE-choroide-sclera en retina geïsoleerd van muizen (1 netvlies of 2 RPE-choroïde-sclera/kanaal) parallel gemeten als reactie op testverbindingen zoals aangegeven. De gegevens zijn het gemiddelde van de replicaten van een enkel experiment (n = 2 en 4 voor respectievelijk RPE-choroïde-sclera en netvlies; p-waarden worden berekend door gepaarde t-tests uit te voeren waarbij de steady-state-waarden voor elk testagens worden vergeleken met die van het vorige testmiddel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 12. OCR- en LPR-curven van RPE-cellen. OCR en LPR van RPE-cellen die waren bevestigd aan transwellmembranen die in reepjes werden gesneden en in de perifusiekamers werden geladen. De gegevens zijn het gemiddelde van de replicaten van een enkel experiment (n = 3, met 1,5 membranen/kanaal (360.000 cellen/kanaal); p-waarden worden berekend door gepaarde t-tests uit te voeren waarbij de steady-state-waarden voor elk testmiddel worden vergeleken met die van het vorige testmiddel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| WEEFSEL/CEL | Bedrag/kanaal | DEBIET: ml/min |
| Netvlies (muis) | 1 | 0.025 |
| RPE-choroïde-sclera (muis) | 2 | 0.02 |
| RPE-cellen op transwellmembranen | 360.000 cellen (4 x 1/3 filterstrips) | 0.016 |
Tabel 1. Aanbevolen gebruiksspecificaties voor verschillende weefsels.
Aanvullende figuur 1. Grafische weergave van experimenteel ontwerp. Tijdstip en samenstelling van de blootstelling aan testverbindingen en tijdstip van het verzamelen van fracties. Concentratieverhoging (Conc Inc) is de concentratiewijziging die moet worden doorgevoerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2. Gebruikersinterface bij het opstarten. UI van het opstartvenster van de O 2-detectiesoftware die de O2 bewaakt in de weefselkamers die in de PCM zijn ingebracht. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3. Gebruikersinterface voor experimentinstellingen. Gebruikersinterface voor het invoeren van experimentele informatie (links) en het selecteren van tijden voor het verzamelen van uitstroomfracties (rechts). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 4. Gebruikersinterface van de injectiepagina. Injectiepagina die de injectievolumes berekent op basis van de gewenste concentraties van de teststof en het resterende volume in de MRM. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 1: Methoden voor de bereiding van weefselmonsters. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Vanwege het belang van bio-energetica in alle aspecten van de celfunctie en het onderhoud van verschillende componenten van het oog, is er een kritieke behoefte aan methoden om de regulatie ervan te bestuderen. In het bijzonder zijn neuraal netvlies en RPE afhankelijk van het metabolisme voor zowel energieopwekking als intra- en intercellulaire signalering14,15,16,17. Vanwege hun hoge oxidatieve capaciteit worden geïsoleerde weefsels van het oog niet goed onderhouden onder statische omstandigheden18,19 en daarom vereist de studie van geïsoleerde componenten van het oog stroomsystemen die metabolische processen zowel kunnen handhaven als beoordelen. Het fluïdica-systeem is ontwikkeld om OCR- en LPR-gegevens te genereren van een breed scala aan weefseltypes en in dit artikel hebben we gedetailleerde protocollen gepresenteerd die optimale resultaten bleken te produceren.
De belangrijkste bepalende factor voor het genereren van robuuste gegevens met behulp van het stroomsysteem omvat pre-equilibratie van op CO2 gebaseerde media/buffer bij 39 °C (om ervoor te zorgen dat perifusaat niet oververzadigd raakt met opgelost gas dat tijdens het experiment zou ontgassen). Met name media of KRB-buffers die bij 4 °C zijn opgeslagen, zullen oververzadigd zijn ten opzichte van 37 °C en zullen tijdens het experiment ontgassen als de pre-equilibratietijden onvoldoende zijn. Bovendien mag weefsel dat in de weefselkamers wordt geladen, niet worden getraumatiseerd door onjuiste isolatie van weefsel als gevolg van scheuren of onvolledige scheiding van weefsel, of door weefsel in een lage hoeveelheid op bicarbonaat gebaseerde buffer te lang bloot te stellen aan atmosferische lucht. De temperatuurregeling, stromingsstabiliteit en betrouwbaarheid van O2-detectie hebben weinig variabiliteit en deze factoren dragen niet significant bij aan het uitvalpercentage.
Het instrument heeft acht stroomkanalen/weefselkamers die gelijktijdig lopen en die worden gevoed met perifusaat uit twee reservoirs, vier weefselkamers voor elk reservoir. Om het meest nauwkeurige verloop van OCR te krijgen, worden kinetische curven volgens de basislijn gecorrigeerd door kamers die niet met weefsel zijn belast. Een typisch experimenteel protocol zou dus twee groepen van drie weefselkamers omvatten. Protocollen vallen in het algemeen in twee categorieën: de ene zijn de verschillende protocollen voor testverbindingen aan elke kant (bijvoorbeeld geneesmiddel/vehiculum aan de ene kant van de MRM en alleen vehiculum aan de andere kant); de tweede is hetzelfde injectieprotocol voor testverbindingen aan beide zijden van de MRM, maar aan elke kant van de MRM een ander weefsel of weefselmodel. In dit artikel werden de effecten van oligomycine en FCCP op het netvlies vergeleken met OCR door weefsel dat niet werd blootgesteld aan testverbindingen, en twee weefsels werden gelijktijdig beoordeeld volgens hetzelfde protocol en dezelfde omstandigheden om weefselspecifiek gedrag te identificeren. Dit laatste werd in deze studie geïllustreerd door in hetzelfde experiment een verhoogd dynamisch bereik van de stofwisseling door RPE-choroïde-sclera ten opzichte van het netvlies parallel aan te tonen. Andere rapporten hebben een breder scala aan onderzoeksontwerpen beschreven, waaronder het meten van de effecten variërend van O2-niveaus op OCR en LPR, en concentratie-afhankelijkheden van brandstoffen, medicijnen en toxines20,21. Bovendien, hoewel we de analyse van uitstroomfracties hebben beperkt tot het meten van lactaat en het berekenen van LPR, neemt de informatie-inhoud van een experiment sterk toe als meerdere verbindingen en klassen van verbindingen in de uitstroomfracties worden getest, zoals hormonen, neurotransmitters, celsignalen en metabolieten die de cellen kunnen verlaten20,22, 23. okt.
Het laden van geïsoleerd netvlies of RPE-choroide-sclera is eenvoudig, en eenmaal geïsoleerd worden deze weefsels eenvoudig met een pincet in de bovenkant van de weefselkamers geplaatst en naar de fritte laten zinken. RPE-cellen gekweekt op filterinzetstukken ontwikkelen de juiste polarisatie en markers van RPE-rijpheid na 4-8 weken in kweek. Het is niet haalbaar om de RPE te verwijderen voor analyse van levende cellen zodra deze aan het transwellmembraan is bevestigd, als de rijpheid en polarisatie van de RPE moeten worden gehandhaafd24. De perifusiekamer is geschikt voor stroken van het transwellmembraan die met een scalpel worden doorgesneden terwijl ze in buffer worden ondergedompeld en snel in de weefselkamers worden ingebracht. Hoewel het snijden van filterstrips in een statisch systeem is geplaatst24, is er geen andere fluïdische methode beschikbaar om deze belangrijke celtypen te beoordelen. De reacties van RPE-cellen waren snel en dynamischer dan het netvlies of de RPE-choroide-sclera, waarschijnlijk gedeeltelijk als gevolg van onmiddellijke toegang tot zowel de apicale als de basale aspecten van de RPE-cellen die zijn geconfigureerd als een monolaag op het membraaninzetstuk.
Een andere factor om ervoor te zorgen dat gegevens het hoogste signaal-ruispercentage hebben, is het selecteren van de optimale verhouding van weefsel dat in de perifusiekamers wordt geladen ten opzichte van de stroomsnelheid. Te weinig weefsel ten opzichte van het debiet resulteert in een verschil in opgelosteO2-concentratie tussen instroom en uitstroom dat zeer klein is en moeilijk betrouwbaar te meten. Als de stroom daarentegen te langzaam is, wordt de concentratie van O2 zo laag dat het weefsel wordt aangetast door hypoxie. Desalniettemin kan de gasdrukgestuurde vloeistofstroom worden gehandhaafd op stroomsnelheden tot 5 ml/min, waarbij slechts kleine hoeveelheden weefsel nodig zijn voor nauwkeurige OCR- en LPR-metingen. In de hier getoonde experimenten werd ongeveer 20 ml/min/kanaal gebruikt, wat geschikt was voor één netvlies, twee RPE-choroïde-sclera's of 360.000 RPE-cellen. Om de systeemeffecten te minimaliseren die de blootstelling van het weefsel aan de geïnjecteerde teststof vertragen en verspreiden, worden meerdere maten van de weefselkamers geleverd, zodat de hoeveelheid weefsel (en stroomsnelheid) is afgestemd op de juiste grootte van de kamer.
Gegevens uit de analyses in dit artikel werden op twee manieren weergegeven: absolute grootte ten opzichte van de snelheid, of fractionele veranderingen ten opzichte van een steady-state of baseline. De nadruk lag op het illustreren van het meten van responsen op testverbindingen. Het fluïdische systeem is echter zeer geschikt om effecten van weefselbehandeling voorafgaand aan de perifusieanalyse, zoals genetische modificaties, te beoordelen en te vergelijken. Testen of een behandeling verschilt van de controle, is het meest robuust als de effecten van de behandeling op genormaliseerde responsen van testverbindingen worden geanalyseerd. Als de analyse absolute grootheden vereist, wordt de statistische kracht van de analyses van voorbehandelde monsters gemaximaliseerd als hun beoordeling en controles in hetzelfde perifusie-experiment worden uitgevoerd.
Met uitzondering van de roerder worden alle onderdelen die in contact komen met vloeistof door de fabrikant geleverd als verbruiksartikelen en zijn ze gesteriliseerd. Deze onderdelen mogen niet opnieuw worden gebruikt, omdat experimenten af en toe verloren gaan door onvolledige reiniging en vervuilde oppervlakken. Het systeem aan het begin van de installatie is steriel. Er worden echter media aan de MRM toegevoegd en weefsel wordt onder niet-steriele omstandigheden in de kamers geladen. We hebben OCR gemeten in het systeem dat is samengesteld met onderdelen die steriel zijn, maar waarbij het experiment zelf onder niet-steriele omstandigheden wordt uitgevoerd. Het duurt ongeveer 14 uur voordat bacteriën zich ophopen tot het punt dat ze meetbare OCR hebben (niet-gepubliceerde resultaten). Als protocollen worden gebruikt die minder dan 10 uur duren, zijn de ophoping van bacteriën en eventuele effecten als gevolg hiervan verwaarloosbaar.
Veel onderzoekers gebruiken instrumenten die zijn ontworpen om OCR te meten onder statische incubatie van een monolaag van cellen met een relatief hoge doorvoer25,26. Daarentegen houdt het fluïdische instrument dat we in dit artikel hebben getest en beschreven, het weefsel in stand door te zorgen voor een adequate O2-afgifte, wat van cruciaal belang is voor de grotere diffusieafstanden die aanwezig zijn in weefselmonsters. Bovendien is het in staat om breuken te verzamelen, waardoor meerdere parameters parallel met OCR kunnen worden beoordeeld, wat het vermogen om relaties tussen hen te bestuderen aanzienlijk verbetert. Ten slotte kunnen opgeloste gasconcentraties (zoals O 2 en CO 2) worden gecontroleerd, waardoor de duur van experimenten met bicarbonaatgebaseerde media en buffer wordt verlengd, waardoor de gebruiker de effecten van O2 kan bestuderen. Opgemerkt moet worden dat een beperking voor beide methodologieën het onvermogen is om het uitspoelen van testverbindingen te bestuderen, een functionaliteit die andere perifusiesystemen hebben 4,27,28. Een andere overweging bij het bepalen van de optimale analysemodaliteit is het feit dat fluïdische systemen meer media en testverbindingen gebruiken dan statische systemen. De extra kosten worden echter geminimaliseerd met de huidige fluïdische systemen vanwege de lage stroomsnelheden die het systeem kan gebruiken.
In het algemeen wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van de protocollen om experimenten uit te voeren met een nieuw flow/assessment instrument. Gegevens gegenereerd met retina en RPE-choroide-sclera recapituleerden eerdere resultaten die zijn verkregen met systemen die veel moeilijker te gebruiken zijn (en niet direct beschikbaar). Er werd ook aangetoond dat het systeem RPE-cellen kan onderhouden en beoordelen die zijn bevestigd aan transwellmembranen, een zeer belangrijk cellulair model dat niet eerder is geanalyseerd met flowsystemen vanwege de kwetsbaarheid van de cellen. De belangrijkste onderdelen van het protocol bestaan uit een insteltijd van 75 minuten, gevolgd door een evenwichtsperiode van 90 minuten en het experimentele protocol waardoor het geschikt is voor routinematig gebruik door laboratoria die niet gespecialiseerd zijn in de werking van fluïdische systemen. Hoewel we ons hebben gericht op het meten van de acute respons van weefsel op testverbindingen, is het systeem zeer geschikt om weefsel uit verschillende bronnen te vergelijken, zoals diermodellen of celmodellen die genetisch zijn veranderd of testbehandelingen/omstandigheden hebben ondergaan. Bovendien is de reikwijdte van de tests die kunnen worden uitgevoerd op de uitstroomfracties breed en omvatten ze metabolieten, celsignaalmoleculen en uitgescheiden hormonen/neurotransmitters, evenals multicomponentenanalyse gegenereerd door massaspectrometrie op zowel de fracties als het weefsel.
Disclosures
I.R.S., M.G. en K.B. hebben financiële banden met EnTox Sciences, Inc. (Mercer Island, WA), de fabrikant/distributeur van het BaroFuse-perifusiesysteem dat in deze studie wordt beschreven. Alle andere auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidies van de National Institutes of Health (R01 GM148741 I.R.S.), U01 EY034591, R01 EY034364, BrightFocus Foundation, Research to Prevent Blindness (J.R.C.) en R01 EY006641, R01 EY017863 en R21 EY032597 (J.B.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BIOLOGICAL SAMPLES | |||
| C57BL/6J mice | Envigo Harlan (Indianapolis, IN) | N/A | |
| REAGENTS | |||
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920L9795 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270G | |
| KCN | Sigma-Aldrich | 60178 | |
| Lactate | MilliporeSigma | L6661 | |
| Oliigomycin A | Sigma-Aldrich | 75351L9795 | |
| CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING | |||
| Beuthanasia-D | Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ | N/A | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital | Virbac | RXEUTHASOL | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | 12303C | |
| Hank’s Buffered Salt Solution | GIBCO | 14065056 | |
| Krebs Ringer Bicarbonate (KRB) | Thermo Fisher Scientific | J67795L9795 | |
| Matrigel | ThermoFisher | #CB-40230 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| ROCKi | Selleck Chemicals | Y-27632 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25-200-072 | |
| SUPPLIES | |||
| Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2 | Praxair Distribution, Inc | N/A | |
| Transwell filters | MilliporeSigma | 3470 | |
| COMMERCIAL ASSAYS | |||
| Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit | ThermoFisher | A22189 | |
| Glucose Oxidase from Aerococcus viridans | Invitrogen (Carlsbad, CA) | A22189L9795 | |
| Lactate Oxidase | Sigma-Aldrich | L9795 | |
| EQUIPMENT | |||
| BaroFuse Multi-Channel Perifusion system | EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA | Model 001-08 | |
| Synergy 4 Fluorometer | BioTek (Winooski, VT) | S4MLFPTA |
References
- Lacy, P. E., Walker, M. M., Fink, C. J. Perifusion of isolated rat islets in vitro: Participation of the microtubular system in the biphasic release of insulin. Diabetes. 21 (10), 987-998 (1972).
- Doliba, N. M., et al. Metabolic and ionic coupling factors in amino acid-stimulated insulin release in pancreatic beta-HC9 cells. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (6), E1507-E1519 (2007).
- Sweet, I. R., et al.
- Chertov, A. O., et al.
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Bisbach, C. M., et al. Succinate Can Shuttle Reducing Power from the Hypoxic Retina to the O2-Rich Pigment Epithelium. Cell Reports. 31 (5), 107606 (2020).
- Du, J., et al. Inhibition of mitochondrial pyruvate transport by zaprinast causes massive accumulation of aspartate at the expense of glutamate in the retina. The Journal of Biological Chemistry. 288 (50), 36129-36140 (2013).
- Hass, D. T., et al. Succinate metabolism in the retinal pigment epithelium uncouples respiration from ATP synthesis. Cell Reports. 39 (10), 110917 (2022).
- Kamat, V., et al. Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism. Elife. 10, e66716 (2021).
- Stryer, L. Biochemistry. , 4th edn, Freeman and Company, New York. (1995).
- Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test. STAR Protocols. 2 (1), 100245 (2021).
- Engel, A. L., et al. Extracellular matrix dysfunction in Sorsby patient-derived retinal pigment epithelium. Experimental Eye Research. 215, 108899 (2022).
- Zhang, R., et al. Inhibition of Mitochondrial Respiration Impairs Nutrient Consumption and Metabolite Transport in Human Retinal Pigment Epithelium. Journal of Proteome Research. 20 (1), 909-922 (2021).
- Hurley, J. B. Retina Metabolism and Metabolism in the Pigmented Epithelium: A Busy Intersection. Annual Review of Vision Science. 7, 665-692 (2021).
- Xiao, J., et al. Autophagy activation and photoreceptor survival in retinal detachment. Experimental Eye Research. 205, 108492 (2021).
- Okawa, H., Sampath, A. P., Laughlin, S. B., Fain, G. L. ATP consumption by mammalian rod photoreceptors in darkness and in light. Current Biology. 18 (24), 1917-1921 (2008).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. , 100846 (2020).
- Yu, J., et al. Emerging strategies of engineering retinal organoids and organoid-on-a-chip in modeling intraocular drug delivery: Current progress and future perspectives. Advanced Drug Delivery Reviews. 197, 114842 (2023).
- Arjamaa, O., Nikinmaa, M. Oxygen-dependent diseases in the retina: role of hypoxia-inducible factors. Experimental Eye Research. 83 (3), 473-483 (2006).
- Kamat, V., et al. A Versatile Multi-Channel Fluidics System for the Maintenance and Real-Time Metabolic and Functional Assessment of Tissue or Cells. Cell Reports Methods. In Press. , (2023).
- Neal, A., et al. Quantification of Low-Level Drug Effects Using Real-Time, in vitro Measurement of Oxygen Consumption Rate. Toxicological Sciences. 148 (2), 594-602 (2015).
- Jung, S. R., et al. Reduced cytochrome C is an essential regulator of sustained insulin secretion by pancreatic islets. The Journal of Biological Chemistry. 286 (20), 17422-17434 (2011).
- Rountree, A. M., et al. Control of insulin secretion by cytochrome C and calcium signaling in islets with impaired metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 289 (27), 19110-19119 (2014).
- Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).
- Jarrett, S. G., Rohrer, B., Perron, N. R., Beeson, C., Boulton, M. E. Assessment of mitochondrial damage in retinal cells and tissues using quantitative polymerase chain reaction for mitochondrial DNA damage and extracellular flux assay for mitochondrial respiration activity. Methods in Molecular Biology. 935, 227-243 (2013).
- Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).
- Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2008).
- Doliba, N. M., Qin, W., Vinogradov, S. A., Wilson, D. F., Matschinsky, F. M. Palmitic acid acutely inhibits acetylcholine- but not GLP-1-stimulated insulin secretion in mouse pancreatic islets. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 299 (3), E475-E485 (2010).
