Summary
ينتج عن التحليل في الوقت الفعلي للأنسجة الحية بيانات وظيفية وميكانيكية مهمة. تصف هذه الورقة البروتوكولات والمتغيرات الحرجة لضمان توليد البيانات بدقة وقابلية للتكرار بواسطة نظام موائع متعدد القنوات جديد وخالي من المضخات يحافظ على مجموعة واسعة من نماذج الأنسجة والخلايا ويقيمها.
Abstract
تتطلب العديد من النماذج في المختبر المستخدمة للتحقيق في وظيفة الأنسجة وبيولوجيا الخلية تدفقا للوسائط لتوفير الأوكسجين الكافي وظروف الخلية المثلى اللازمة للحفاظ على الوظيفة والحيوية. وتحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتطوير نظام زراعة تدفق متعدد القنوات للحفاظ على الأنسجة والخلايا في الثقافة وتقييم الوظيفة والجدوى باستمرار إما عن طريق أجهزة الاستشعار في الخط و / أو جمع كسور التدفق الخارجي. يجمع النظام بين 8 قنوات ، والاستشعار البصري المستمر لمعدل استهلاك الأكسجين مع مجمع الكسر المدمج لقياس معدلات إنتاج المستقلبات وإفراز الهرمونات في وقت واحد. على الرغم من أنها قادرة على الحفاظ على مجموعة واسعة من نماذج الأنسجة والخلايا وتقييمها ، بما في ذلك الجزر الصغيرة والعضلات وما تحت المهاد ، فإننا هنا نصف مبادئ التشغيل والمستحضرات / البروتوكولات التجريبية التي استخدمناها للتحقيق في تنظيم الطاقة الحيوية لشبكية العين المعزولة للفأر ، ظهارة صبغة شبكية الفأر (RPE) - المشيمية الصلبة ، وخلايا RPE البشرية المستزرعة. أنتجت الابتكارات في تصميم النظام ، مثل تدفق السوائل بدون مضخة ، عملية مبسطة إلى حد كبير لنظام تدفق متعدد القنوات. يتم عرض مقاطع الفيديو والصور التي توضح كيفية تجميع وإعداد الأداة للتجربة وتحميل نماذج الأنسجة / الخلايا المختلفة في غرف الاندماج. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحديد ومناقشة المبادئ التوجيهية لاختيار شروط التجارب الخاصة بالبروتوكول والأنسجة ، بما في ذلك تحديد معدل التدفق الصحيح إلى نسبة الأنسجة للحصول على ظروف زراعة متسقة ومستقرة وتحديد دقيق لمعدلات الاستهلاك والإنتاج. إن الجمع بين الصيانة المثلى للأنسجة والتقييم في الوقت الفعلي لمعلمات متعددة ينتج عنه مجموعات بيانات غنية بالمعلومات سيكون لها فائدة كبيرة للبحث في فسيولوجيا العين واكتشاف الأدوية لعلاج ضعف البصر.
Introduction
أنظمة Perifusion لها تاريخ طويل في علوم الحياة. على وجه الخصوص ، لدراسة وظيفة إفراز الجزر ، فقد تم استخدامها لتوصيف حركية إفراز الأنسولين استجابة للإفرازات1. بالإضافة إلى جمع كسور التدفق الخارجي للفحص اللاحق للهرمونات والمستقلبات ، تم دمج أجهزة استشعار في الوقت الفعلي ، في الغالب للكشف عن استهلاك الأكسجين2،3،4. كانت الجهود الواسعة النطاق لفهم الآليات التي تتوسط أمراض العين محدودة بشكل أفضل بسبب عدم وجود طرق ذات صلة من الناحية الفسيولوجية لتقييم التنظيم الأيضي وعدم تنظيم المكونات المعزولة المختلفة للعين ، بما في ذلك شبكية العين ، الصباغ الشبكي الظهاري (RPE) - المشيمية الصلبة وخلايا RPE المستزرعة. تم تكييف الأنظمة الثابتة المصممة للخلايا المستزرعة للأنسجة5 ، لكن الأنسجة تتطلب تدفقا للحصول على أكسجة كافية. نجحت أنظمة التدفق في قياس الاستجابات في الوقت الفعلي بدقة وتكرار في معدل استهلاك الأكسجين (OCR) بواسطة شبكية العين و RPE-choroid-sclera ، وتبقى الأنسجة مستقرة في التمثيل الغذائي لأكثر من 8 ساعات مما يسمح ببروتوكولات مفيدة للغاية تتضمن مركبات اختبار متعددة4،6،7،8،9. ومع ذلك ، فإن تشغيل أنظمة الموائع يتطلب تاريخيا جهازا مخصصا وموظفين فنيين مدربين على منهجيات غير موحدة. لم يتم اعتماد هذه الأنظمة كمنهجية قياسية في معظم المختبرات. BaroFuse هو نظام سوائع مطور حديثا لا يعتمد على المضخات ، بل يعتمد على ضغط الغاز لدفع التدفق عبر قنوات متعددة وغرف الأنسجة (الشكل 1). تتم مراقبة كل قناة باستمرار بحثا عن OCR ، ويتم جمع التدفق الخارجي باستخدام مجمع كسور قائم على اللوحة للفحص اللاحق للمحتويات. الأهم من ذلك ، تم تصميم غرف محيط الأنسجة للأداة لاستيعاب الأنسجة من مختلف الأشكال الهندسية والأحجام.
قلب الجهاز هو نظام الموائع ، حيث يتم دفع التدفق من خزان مضغوط مغلق من خلال أنبوب صغير القطر الداخلي (ID) (يساهم في مقاومة التدفق الأكثر أهمية في دائرة السوائل) إلى غرف الأنسجة الزجاجية التي تضم الأنسجة. يتم توفير الضغط على وحدة خزان الوسائط (MRM) بواسطة منظمات الضغط المنخفض والضغط العالي المتصلة بأسطوانة غاز تحتوي على خليط من الغازات (عادة 21٪ O 2 ، 5٪ CO 2 ، التوازن N2) ، ويتم إغلاق الخزان من الأعلى بواسطة وحدة غرفة الانصهار (PCM) التي تحمل مجموعات غرفة الأنسجة (TCAs). يتم التحكم في معدل التدفق من خلال طول ومعرف أنابيب المقاومة وإعداد الضغط لمنظم الضغط المنخفض. تقوم أنابيب التدفق الخارجي المتصلة بالجزء العلوي من غرف الأنسجة بتوصيل السائل إما إلى وعاء النفايات (الذي يتم وزنه باستمرار لتحديد معدل التدفق تلقائيا) أو إلى آبار صفيحة 96 بئرا يتحكم فيها جامع الكسر. يقيس نظام الكشف O 2 عمر صبغة حساسة ل O2 مطلية داخل كل غرفة من غرف الأنسجة الزجاجية في اتجاه مجرى الأنسجة. ثم يتم استخدام هذه المعلومات لحساب OCR باستمرار. يوجد نظام الموائع بأكمله في حاوية يتم التحكم في درجة حرارتها وخزان الغاز ومجمع الكسور والكمبيوتر هي المكونات الرئيسية للأداة (الشكل 2 أ). أخيرا ، يعمل البرنامج الذي يقوم بتشغيل الأداة على التحكم في تشغيلها (بما في ذلك إعداد وتوقيت مركبات الاختبار المحقونة ، ونظام قياس التدفق ، وتوقيت جامع الكسور) ، بالإضافة إلى معالجة بيانات التعرف الضوئي على الحروف والقياسات التكميلية الأخرى ورسمها بيانيا.
في هذه الورقة ، نصف بروتوكولات استخدام نظام الموائع لتدوير وتقييم معدل إنتاج OCR واللاكتات (LPR) لمختلف المكونات المعزولة للعين. LPR هي معلمة تعكس معدل تحلل السكر الذي يكمل بشكل كبير التعرف الضوئي على الحروف ، حيث يمثل الزوج الفرعين الرئيسيين لتوليد الطاقة من الكربوهيدرات في الخلية10. نظرا لأنه من الأفضل تعلم تحضير الأنسجة وتحميلها في غرف الأنسجة من خلال مشاهدة الإجراء ، سيساعد الفيديو في توضيح العديد من الخطوات الحاسمة التي يتم تنفيذها أثناء الإعداد والتشغيل والتي لا يمكن نقلها بسهولة عن طريق النص وحده.
ينقسم وصف البروتوكول إلى 8 أقسام تتوافق مع مراحل مختلفة من التجربة (الشكل 2 ب): 1. التحضير قبل التجريبي ؛ 2. إعداد / توازن perifusate ؛ 3. إعداد الصك. 4. توازن الأنسجة. 5. البروتوكول التجريبي. 6. انهيار الصك. 7. معالجة البيانات. و8. مقايسات كسور التدفق الخارج.
Protocol
تمت الموافقة على جميع إجراءات حصاد الأنسجة من الجرذان والفئران من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة واشنطن.
1. التحضير قبل التجريبي
ملاحظة: يتم إكمال المهام التالية قبل يوم واحد على الأقل من التجربة.
- تصميم البروتوكول التجريبي
- تعيين وضع الأنسجة في القنوات: اختر نموذج الأنسجة أو الخلية ليتم وضعها في 3 من 4 قنوات على كل جانب من MRM. يتم تشغيل غرفة نسيج واحدة على كل جانب بدون أنسجة لاستخدامها في تصحيح خط الأساس.
- ترتيب العينات باستخدام أحد التصميمين النموذجيين - بروتوكولات مركبات اختبار مختلفة على كل جانب (على سبيل المثال ، تتلقى القنوات الموجودة على جانب واحد من MRM مركبات اختبار بينما تعمل القنوات على الجانب الآخر كعنصر تحكم) ؛ نفس بروتوكول حقن مركب الاختبار على جانبي MRM ، ولكن الأنسجة المختلفة أو نموذج الأنسجة مقابل التحكم على جانبي MRM.
- اختيار معدل التدفق وكمية الأنسجة لقياس OCR الأمثل: اضبط معدل التدفق حتى يكون التغيير في نسبة العمر مضروبا في 100 حوالي 3.
ملاحظة: يتم عرض الكميات النموذجية من الأنسجة ومعدلات التدفق المقابلة في الجدول 1 لمكونات العين ، حيث يعمل الجهاز بشكل أفضل عند معدلات التدفق بين 6-80 ميكرولتر / دقيقة / قناة. - حساب حجم الوسائط / المخزن المؤقت المطلوب: احسب حجم الوسائط المراد إضافتها إلى كل إدراج MRM في بداية التجربة ك
حجمMRM = 30 مل + مدة البروتوكول (بالدقائق) × معدل التدفق (بالمللي لتر / دقيقة) × 4 قنوات (مكافئ 1)
على سبيل المثال ، عند 0.01 مل / دقيقة ، سيسمح حجمبدء تشغيل 60 مل MRM ببروتوكول 12.5 ساعة (حيث سيتم استنفاد 30 مل ، بينما سيبقى 30 مل) ، بينما عند 0.04 مل / دقيقة ، سيسمح 90 مل بدء حجمMRM ببروتوكول 6 ساعات (مع بقاء 30 مل). - بروتوكول حقن مركبات الاختبار: حدد مركبات الاختبار المراد تقييمها ، والتركيز المراد اختباره (يتم اختياره عادة لتحقيق استجابة قريبة من الحد الأقصى أو كتبعيات تركيز) ومدة التعرض. ضع في اعتبارك الذوبان وتكوين مخزون في المذيبات المرغوبة مثل الماء أو DMSO أو الإيثانول.
- حدد توقيت الحقن والحقن اللاحقة بحيث تصل الاستجابة إلى حالة مستقرة قبل إضافة عامل لاحق. عند تكرار البروتوكولات ، قم بمطابقة توقيت الحقن بحيث يمكن حساب متوسط الدورات الزمنية المتعددة.
ملاحظة: المركبات المستخدمة هنا مأخوذة من اختبار إجهاد ميتوكوندريا سابق (ميتو) 11 ويتطلب كل من أوليغوميسين وسيانيد الكربونيل 4- (ثلاثي فلورو ميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP) DMSO في كل من محاليل المخزون ، وكذلك perifusate النهائي. - أوقات أخذ عينات التدفق الخارجي: حدد فترات جمع الكسور المطلوبة (من 1-60 دقيقة / عينة) ، حيث يتم اختيار معدلات أخذ العينات الأسرع للتغيرات السريعة ، ويتم اختيار فترات زمنية أطول مع اقتراب الحالة المستقرة. استخدم كميات كافية من البئر (0.3 إلى 1.5 مل) لتجنب الفائض أثناء فترة أخذ العينات (اختر الأحجام الأكبر من معدل التدفق × الفاصل الزمني).
ملاحظة: ستختلف أوقات أخذ العينات باختلاف اختيار البروتوكول ، ولكن بالنسبة لاختبار إجهاد ميتو ، فقد استخدمنا بشكل شائع فواصل زمنية مدتها 5 دقائق خلال خط الأساس وفواصل زمنية مدتها 15 دقيقة أثناء الحقن (-15 ، -10 ، -5 ، 0 ، 15 ، 30 ، 45 ، 60 ، 75 ، 90 ، 105 ، حيث تكون كل مرة بداية فترة أخذ العينات). - أدخل القيم المحددة لمركبات الاختبار ومجموعة الكسور الموضحة أعلاه في واجهة المستخدم (UI) ، والتي تنشئ تمثيلات رسومية لهذه المعلومات. تصدير ونشر الملفات لتقييم المجموعة ومناقشتها (الشكل التكميلي 1).
- حدد الملحقات والأجزاء المستهلكة
- حدد الإمدادات المقدمة والمعبأة مسبقا بشكل معقم من قبل الشركة المصنعة والتي تشمل: TCAs (حزمة من 8) ، وتجميعات أنابيب التدفق الخارجي (حزمة من 8 أنابيب) ، وأنابيب حقن مركب الاختبار (2) ، والملقط ، ومشابك الأنابيب (3) ، و MRM ، وإدراج MRM (2) ، وقضبان التحريك (2) ، ومجموعة أنابيب التطهير (الموضوعة في خزانة السلامة البيولوجية).
- لا تعيد استخدام الأجزاء التي تستخدم لمرة واحدة والتي تتلامس مع السائل ، لأن هذا سيؤدي إلى زيادة الفشل التجريبي. أعد استخدام الملقط وقضبان التقليب عن طريق تنظيفها وتعقيمها بين التجارب.
2. تحضير وتوازن بيريفوسات (الوقت: 30 دقيقة لا يشمل وقت الحضانة)
- قم بإعداد الوسائط أو المخزن المؤقت لبيكربونات كريبس رينجر (KRB) في اليوم السابق بناء على حسابات من المعادلة 1 ، عادة 200 مل ، ثم احتضانها طوال الليل في حاضنة 39 درجة مئوية / 5٪ CO2 في قوارير زراعة الأنسجة T225 مع ما لا يزيد عن 90 مل في كل قارورة.
- في حالة استخدام KRB أو الوسائط المحضرة تجاريا (تم تسخينها إلى درجة حرارة الغرفة) ، قم بإعداد perifusate في صباح التجربة وضعها في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ لمدة 1 ساعة على الأقل. تحضير جميع الحلول بشكل معقم.
ملاحظة: جميع السوائل وأجزاء نظام الموائع التي تتلامس مع السائل معقمة في بداية التجربة. ومع ذلك ، يتم إجراء تجميع النظام وتحميل الأنسجة مفتوحة للهواء.
3. توازن درجة الحرارة والغاز المذاب لإعداد الجهاز (الوقت: 75 دقيقة)
- إرفاق مجموعات الأنابيب ب MRM
- ضع MRM وحزمة السوائل على المقعد بجوار الجهاز. تأكد من أن مشابك الأنابيب (3) وقضبان التحريك (2) والملقط موجودة بالفعل في درج الأدوات.
- ضع ملحق MRM غير مستخدم مع شريط تحريك في كل جانب من جوانب MRM (انظر الشكل 3).
- قم بتوصيل TCAs بمنافذ الحقن على طرفي MRM بحيث يتم وضع نهاية الأنبوب مباشرة فوق قضيب التحريك. تأكد من أن أطول مجموعتي حقن مركب الاختبار موجودة في الجزء الخلفي من MRM.
- بعد ذلك ، قم بتوصيل خط تغذية تدفق الغاز ومجموعة أنابيب التطهير بالمنافذ الشاغرة الخلفية والأمامية ، على التوالي (انظر الشكل 4 أ).
- وضع مجموعات MRM / الأنابيب في العلبة
- ضع MRM (مع توصيل مجموعات الأنابيب) في سخان MRM (الشكل 4B).
- ضع مجموعات الأنابيب الأربعة في أخاديد الجدران في قاعدة العلبة (اثنان على كل جانب) بحيث تبرز إلى الجزء الخارجي من العلبة بمجرد وضع العلبة الوسطى في مكانها.
- قم بتأمين MRM بين المشابك عن طريق شد العجلتين على حامل الكاشف.
- قم بتغذية مجموعة حقن مركب الاختبار الأطول البارزة من الجزء الخلفي من العلبة من خلال دليلي الأنبوب على جانب العلبة بحيث تكون فتحة الأنابيب متجهة للأمام (الشكل 4C).
- قم بتثبيت كل من مجموعات حقن مركب الاختبار المغلقة.
- تجميع العلبة وتفعيل أجهزة التحكم في درجة الحرارة
- قم بتبديل مشترك الطاقة الذي يوفر الطاقة لجميع الأجهزة الكهربائية داخل العلبة إلى وضع التشغيل. سيتم تشغيل المروحة الموجودة على حامل الكاشف ويجب أن تضيء وحدة التحكم في درجة الحرارة MRM لعرض قيمة محددة تبلغ 38 درجة مئوية (الشكل 5).
- قم بتشغيل أدوات التقليب إلى 70 دورة في الدقيقة باستخدام واجهة المستخدم للتأكد من أن قضبان التقليب تدور بسلاسة. بمجرد ملاحظة التقليب المناسب ، قم بإيقاف تشغيل أدوات التقليب.
- ضع القسم الأوسط من العلبة أعلى القاعدة.
- قم بتوصيل الكبل الموجود في القسم الأوسط من العلبة بالكابل من الصندوق الكهربائي لتوصيل الطاقة بمفتاح ذراع التحكم في درجة الحرارة المحيطة وتزويد سخان درجة الحرارة المحيطة بالطاقة.
- ضع الغطاء على العلبة وستضيء شاشة جهاز التحكم في درجة الحرارة العلوية (وحدة التحكم في درجة الحرارة المحيطة) وتقرأ 36 درجة مئوية. ابدأ تشغيل مؤقت لمدة 30 دقيقة ، وهو الوقت الذي يستغرقه سخان MRM للوصول إلى درجة حرارة النقطة المحددة.
- إدخال TCAs في PCM
- استخدم أداة الإدراج TCA لإدخال كل من 8 TCAs في فتحات PCM عن طريق الضغط بقوة على المحول مع وجه أداة الإدخال حتى يلامس الجزء العلوي من غلاف الأنبوب الملفوف حول حجرة الأنسجة السطح الذي يحيط بالثقوب الموجودة في PCM.
- أدخل TCA واحدا تماما قبل إدخال التالي. ضع PCM المجمع جزئيا جانبا بجوار دعامة PCM و 6 مسامير.
ملاحظة: سيؤدي الإدخال غير الكامل ل TCA إلى منع مساحة الرأس من الوصول إلى نقطة ضبط الضغط ولن يتدفق perifusate.
- ملء الإدخالين في MRM مع perifusate متوازنة مسبقا
- للقيام بذلك ، بعد 30 دقيقة من تجميع العلبة ووصول MRM إلى درجة الحرارة ، قم بنقل perifusate المتوازن مسبقا إلى ملحق MRM المسخن مسبقا عن طريق توزيع السائل برفق أسفل الجوانب باستخدام ماصة 50 مل.
ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوات وكذلك تلك الواردة في القسم 3.6 على الفور لتجنب انتقال الغاز بين perifusate في MRM والغلاف الجوي.
- للقيام بذلك ، بعد 30 دقيقة من تجميع العلبة ووصول MRM إلى درجة الحرارة ، قم بنقل perifusate المتوازن مسبقا إلى ملحق MRM المسخن مسبقا عن طريق توزيع السائل برفق أسفل الجوانب باستخدام ماصة 50 مل.
- تجميع MRM / PCM لإنشاء ختم محكم للغاز ووضع كاشف O2
- ضع PCM على MRM عن طريق إدخال أنابيب المقاومة الخاصة ب TCAs المنبعثة من أسفل PCM في إدخالات MRM ، 4 على كل جانب من مقسم MRM. قم بتوجيه PCM بحيث يمكن أن تستقر غرف الأنسجة على كاشف O2 بمجرد وضعه.
- قم بتأمين PCM ودعامة دعم PCM باستخدام 6 براغي باستخدام مفك البراغي الكهربائي.
- قم بتأمين TCAs داخل زعانف دعم PCM باستخدام الشريط المطاطي المقدم عن طريق تمديده حول زعانف PCM على مستوى الحشيات المطاطية (الشكل 6).
- ضع كاشف O2 على حامل الكاشف بحيث يستقر وجهه على زعانف PCM. تأكد من أن أزواج LED / الكاشف الضوئي تتماشى مع الصبغة الحساسة O2 في غرف الأنسجة. إذا لزم الأمر ، اضبط الأدلة الجانبية للكاشف O 2 بعد فك البراغي المحددة على جانب حامل الكاشف O2.
- ضع الغطاء أعلى العلبة.
- موازنة الغاز في فراغ الرأس في MRM مع perifusate
- مع تأمين صمام الضغط العالي وإغلاقه بالكامل ، افتح صمام خزان الغاز عن طريق تدوير صمام الأسطوانة أعلى الخزان عكس اتجاه عقارب الساعة.
- اضبط منظم الضغط العالي على ضغط 10 رطل لكل بوصة مربعة باستخدام المقبض الموجود على المنظم.
- اضغط على MRM عن طريق ضبط منظم الضغط المنخفض على 1.0 رطل لكل بوصة مربعة (الشكل 7 أ).
- قم بفك أنبوب التطهير (الشكل 7 ب) للسماح للغاز من الخزان باستبدال الهواء في فراغ رأس MRM (تظل حاقنات مركب الاختبار مثبتة) لمدة 15 دقيقة. تأكد من تدفق الغاز عن طريق غمر نهاية أنبوب التطهير في كأس من الماء لمراقبة الفقاعات.
- بمجرد تأكيد التدفق ، ابدأ كاشف O2 كما هو موضح أدناه في القسم 3.8.
- بعد 15 دقيقة ، قم بتشغيل المحرك عند 70 دورة في الدقيقة واتركه يعمل لبقية التجربة. بعد 15 دقيقة إضافية ، قم بتثبيت مجموعة أنابيب التطهير (الشكل 7C).
- خفض الضغط على منظم الضغط المنخفض إلى ضغط التشغيل الذي يحقق معدل تدفق السائل المطلوب (كما هو محدد في الحزمة التجريبية - عادة ما بين حوالي 0.5-0.7 رطل / بوصة مربعة). إذا كان معدل التدفق أعلى من 20 ميكرولتر / دقيقة ، فاضبط الضغط مؤقتا على 0.3 رطل لكل بوصة مربعة لإتاحة الوقت لتحميل الأنسجة دون أن تفيض الغرف. هذا ليس ضروريا إذا تم تحميل الأنسجة في غضون 15 دقيقة من وضع المشبك.
ملاحظة: لا تدع المخزن المؤقت يتدفق إلى أسفل الجزء الخارجي من حجرة الأنسجة ، لأن السائل يمكن أن يتداخل مع استشعار O2 .
- بدء تشغيل كاشف O2
- قم بتنشيط برنامج كاشف O2 على الكمبيوتر المحمول بالنقر فوق الرمز المسمى كاشف الأكسجين.
- بمجرد فتح البرنامج (الشكل التكميلي 2) ، تأكد من تحديد منفذ COM الصحيح. إذا لزم الأمر ، يمكن تحديد منفذ COM عن طريق فصل كاشف O2 وتوصيله من الكمبيوتر بحيث يتم عرض رقم المنفذ. إذا تم فصل منفذ COM أثناء تشغيل التطبيق ، فيجب إغلاق التطبيق وإعادة فتحه قبل الاستخدام.
- انقر فوق ابدأ ثم سجل (واحفظ البيانات في مجلد النسخ الاحتياطي). بعد ذلك ، انقر فوق الرسم البياني.
- قم بتغيير متوسط القيمة في الجزء السفلي الأيسر من الرسم البياني مدى الحياة إلى 5 (مما يرشد البرنامج لحساب المتوسط المتحرك ب 5 نقاط متتالية). بعد مرور دقيقة وعرض نقطة البيانات الأولى على شاشة الرسوم البيانية، انقر فوق Auto Scale.
4. فترة تحميل الأنسجة وتوازنها (الوقت: 90 دقيقة)
- وضع فريتس في غرف الأنسجة
- قم بإزالة الغطاء والأقسام الوسطى من العلبة.
- بعد أن يرتفع perifusate في غرف الأنسجة فوق الجزء العلوي من فريت وضعت مسبقا ، ادفع فريت لأسفل مع جديلة فريت عن طريق النقر برفق على الجزء العلوي من فريت لإزالة أي فقاعات الهواء التي تشكلت أسفل أو داخل فريت.
- موضع فريتس حوالي 0.25 بوصة فوق الجزء السفلي من غرفة الأنسجة.
- تحميل الأنسجة في غرف الأنسجة
- بمجرد أن يكون مستوى الوسائط 0.5 بوصة من الأعلى ، قم بتحميل الأنسجة في الغرفة.
- تحميل شبكية العين أو RPE-المشيمية-الصلبة: حصاد شبكية العين أو RPE-المشيمية-الصلبة كما هو موضح في 6. لتحميل الأنسجة ، استخدم ملقط دقيق لوضع الأنسجة برفق في كل حجرة ، مع الحرص على عدم طي الأنسجة ، أثناء استخدام مناديل لمنع السائل من حجرة الأنسجة من التنقيط على مستشعر O2 . لاحظ غرق الأنسجة باتجاه وعلى فريت.
ملاحظة: بين وقت حصاد الأنسجة وتحميل الأنسجة في الغرف ، تأكد من تجنب صدمة الأنسجة عن طريق عدم ترك الأنسجة في مخزن مؤقت / وسائط قائمة على البيكربونات خارج الحاضنة لأكثر من 10 دقائق والتأكد من أن الأنسجة مغمورة في ما يكفي من العازلة / الوسائط (على الأقل 1 مل / 10 ملغ من الأنسجة) لمنع الأنسجة من أن تصبح ناقصة الأكسجين ومنع التعرض للهواء. - تحميل خلايا RPE على أغشية المرسل: قم بإعداد خلايا RPE كما هو موضح سابقا 12 وفي الملف التكميلي 1. خلايا المرور باستخدام 0.25٪ تربسين-EDTA والبذور على البولي إيثيلين تيريفثاليت ، مرشحات محفورة في الجنزير (إدخالات زراعة الخلايا ، حجم المسام 0.4 مم) بحد أدنى 2.0 × 105 خلايا / سم2. في يوم التجربة ، قم بتقطيع الأغشية إلى ثلاث شرائح متساوية العرض وتحميلها بالملقط في غرف الأنسجة (انظر الشكل 8 أ).
- ربط مجموعات أنابيب التدفق الخارجي بغرف الأنسجة
- قم بإزالة مجموعات أنابيب التدفق الخارجي من العبوة وضع فاصل أنابيب التدفق الخارجي على شفة القسم الأوسط من العلبة بحيث تكون محولات أنابيب التدفق الخارجي داخل العلبة (الشكل 8B ، C).
- احرص على عدم الضغط بشدة على TCAs (وإلا ستنفصل عن MRM) ، قم بتوصيل محولات أنابيب التدفق الخارجي بالجزء العلوي من TCAs لغرف الأنسجة (الشكل 8D). استبدل منتصف العلبة وأعد توصيل كابل التحكم في درجة الحرارة المحيطة.
- قبل استبدال غطاء العلبة ، تأكد من أن مكونات نظام الموائع داخل العلبة بما في ذلك كاشف O2 ، PCM ، غرف الأنسجة ، أنابيب التدفق الخارجي ، MRM والسخان ، كلها موضوعة بشكل صحيح كما هو موضح في الشكل 8E.
- استبدل غطاء العلبة. قم بتغذية أنابيب التدفق الثمانية من خلال ذراع توجيه جامع الكسر.
- تفعيل جامع الكسور
- تأكد من توسيط مجمع الكسر بالنسبة للجدار الأيمن للحاوية وحامل أنبوب التدفق: يجب أن يستقر الدعم الأيسر لقاعدة مجمع الكسر على حافة جدار العلبة.
- على الكمبيوتر المحمول ، انقر فوق اختصار واجهة المستخدم وسيتم فتح صفحة المعلومات التجريبية (الشكل التكميلي 3 أعلى).
- املأ المعلومات في المربعات المناسبة في صفحة المعلومات التجريبية (يمكن القيام بذلك قبل بدء التجربة) ثم انقر فوق صفحة جامع التدفق والكسور في الأعلى (الشكل التكميلي 3 أسفل).
- إعداد معلمات لقياس معدل التدفق الآلي
- حدد وقت التكامل المطلوب في القائمة المنسدلة وقت الحصول على العينة في المنتصف العلوي الذي يوازن بين الدقة المطلوبة (التي تتناسب مع وقت التكامل) والدقة الزمنية.
- إذا لم يتم جمع كسور التدفق الخارجي في التجربة ، فانقر فوق ابدأ وانتقل إلى القسم 4.7. إذا تم جمع كسور التدفق الخارج، فقم بتنفيذ الخطوات الواردة في القسم 4.6.
- جمع كسور التدفق الخارجي
- في برنامج واجهة المستخدم ، تحقق من جمع الكسور؟ في صفحة معلومات التجربة أو صفحة جامع التدفق والكسور. ثم انقر فوق ملف حساب إعدادات FC زر.
- عند فتح النافذة الجديدة ، املأ وقت الحقن الأول في البروتوكول (المحدد على أنه الوقت = 0) ومعدل التدفق لكل قناة ، بالإضافة إلى الفترات الزمنية لكل عينة. ثم انقر فوق حساب.
- بمجرد التحقق من الفواصل الزمنية للمجموعة ، انقر فوق إنشاء وبدء.
- قياس معدلات التدفق للقنوات الفردية (اختياري)
- إذا كان سيتم قياس معدلات تدفق القنوات الفردية (والتي تختلف في ظل الظروف العادية بنسبة قليلة فقط) ، فقم بوزن ثمانية (أو أقل) من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، وسجل وزنها.
- اضبط حامل الأنبوب الذي يحتوي على أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تم وزنها مسبقا على عربة اللوحة. انقر فوق قياس معدل التدفق يدويا في قسم الأدوات المساعدة الأخرى.
- حدد مدة القياس ثم انقر فوق إنشاء قالب. أغلق النافذة وانقر فوق ابدأ. سيقوم جامع الكسر بجمع السوائل من أنابيب التدفق الخارجي طوال مدة القياس ثم يعود الذراع إلى موضعه الأصلي.
- وزن أنابيب microfuge بعد التجميع واستخدام الفرق في الوزن مقسوما على مدة القياس لحساب معدل التدفق (حيث 1 mg = 1 μL).
- استقرار خط الأساس
- بمجرد تحميل الأنسجة و / أو الخلايا في غرف الأنسجة ، اسمح للنظام بالتوازن لمدة 90 دقيقة لإنشاء خط أساس مسطح لاستهلاك O2 ، وفي ذلك الوقت يمكن حقن مركب الاختبار الأول (يعتبر الوقت = 0).
- في 30 دقيقة قبل الحقن الأول ، أدخل متوسط آخر 3 FR لكل قيمة قناة في صفحة الحقن لإعداد حقن مركب الاختبار.
5. البروتوكول التجريبي (الوقت: 2-6 ساعات)
ملاحظة: بمجرد بدء تثبيت خط الأساس ، تتمثل المهام التالية في حقن مركبات الاختبار وتغيير الألواح على مجمع الكسر إذا تم استخدام أكثر من واحد.
- تحضير حقن مركب الاختبار
- أدخل أسماء المركبات والتركيزات المطلوبة (المحاليل النهائية والمخزنة) وأوقات حقن مركبات الاختبار في الجدول في واجهة المستخدم في صفحة الحقن. تأكد من المعلومات المعروضة في البرنامج بما في ذلك الأحجام في MRM المتبقية في وقت الحقن ومقدار محلول المخزون المراد حقنه لتحقيق التركيزات المطلوبة (الشكل التكميلي 4).
- لحساب مقدار perifusate والمخزون اللازم للحقن ، املأ المربعات البيضاء لجدول الحقن وانقر فوق حساب. باستخدام القيم المحسوبة ، قم بتخفيف محلول مخزون مركب الاختبار باستخدام perifusate قبل الحقن بحيث يكون الحجم المحقون 5٪ من الحجم في MRM بعد الحقن.
- تحضير كل مركب اختبار عن طريق خلط محلول المخزون و perifusate. قم بتحميل المحاقن لمدة 10 دقائق على الأقل قبل وقت الحقن واحتفظ بها في حاضنة CO2 (يتم الاحتفاظ بها في درجات حرارة تتراوح بين 37-40 درجة مئوية) حتى تصبح جاهزة للحقن.
- حقن مركبات الاختبار
- قم بتوصيل المحقنة التي تحتوي على مركب الاختبار بخطوط الحقن (الشكل 9 أ). قم بفك الأنبوب الساحر ذو الجدران الناعمة المؤدي إلى خط الحقن وقم بحقن مركبات الاختبار ببطء (الشكل 9 ب) بمعدل 3 مل / دقيقة تقريبا. أعد تثبيت الأنبوب على خط الحقن ثم قم بإزالة المحقنة (الشكل 9C) ؛ كرر للجانب الآخر من MRM.
- بعد حقن كل مركب اختبار ، قم بإعداد كل مركب اختبار لاحق ليتم حقنه وفقا لصفحة حقن واجهة المستخدم.
- تحديد إشارة التدفق O2 لكل قناة
- في نهاية كل تجربة ، قم بحقن مثبط الجهاز التنفسي KCN (3 mM) لتحديد إشارة عمر التدفق لكل قناة والتي تستخدم لتصحيح الاختلاف في عمر مستشعر خط الأساس واستهلاك الأكسجين غير الميتوكوندريا.
6. إنهاء التجربة وكسر النظام (الوقت: 30 دقيقة)
- حفظ بيانات الأكسجين
- انقر على حفظ زر في الجزء العلوي الأيسر من نافذة الرسوم البيانية في برنامج كاشف الأكسجين ؛ قم بتسمية الملف وتخزينه في المجلد حيث سيتم الاحتفاظ بالملف. انقر على إيقاف التسجيل زر في النافذة الرئيسية لحفظ ملف النسخ الاحتياطي.
- حفظ ملف المعلومات التجريبية لواجهة المستخدم
- انقر فوق الزر حفظ ملف التعريف في الجزء العلوي الأيسر من الصفحة العامة لواجهة المستخدم ؛ قم بتسمية الملف وتخزينه في المجلد حيث سيتم الاحتفاظ بالملف. في صفحة الكسر والتدفق لواجهة المستخدم، انقر فوق القائمة المنسدلة أدوات ثم حفظ. احتفظ بالاسم الذي تم إنشاؤه أو اختر اسما آخر وقم بتخزين الملف عند الرغبة. إذا لزم الأمر ، هناك ملفات نسخ احتياطي يمكن الوصول إليها وحفظها.
- تحطيم الأداة
- نظرا لأن KCN متقلبة ، تخلص من مجموعات السوائل في غطاء دخان ؛ صب الوسائط من صينية نفايات MRM و FC في حاوية نفايات ، واشطف حشوات MRM وحرك القضبان جيدا بالماء. صب محتويات حاوية النفايات (التي تحتوي على KCN) في حاوية نفايات كيميائية موسومة للتخلص منها لاحقا بواسطة السلامة الكيميائية. قبل التجربة التالية ، قم بتنظيف قضبان التحريك والملقط وتعقيمها جيدا.
7. معالجة البيانات (الوقت: 15-45 دقيقة)
- افتح تطبيق معالج البيانات على جهاز كمبيوتر يعمل بنظام التشغيل Mac أو الكمبيوتر الشخصي. حدد ملف بيانات .csv الذي تم إنشاؤه بواسطة تجربة. إذا كان بروتوكول هذه التجربة مشابها لتجربة تم تحليلها سابقا، فحدد ملف الإعدادات هذا وانقر على الخطوة التالية. بخلاف ذلك ، ما عليك سوى النقر على الخطوة التالية لبدء إدخال إعدادات التجربة.
- املأ الإعدادات المختلفة للتجربة. عند تحديد النقطة الزمنية المرجعية ، حدد النقطة الزمنية مباشرة قبل دخول KCN حيز التنفيذ وانخفضت قيم مدى الحياة. حدد هذه النقطة باستخدام شريط التمرير أو عن طريق كتابة قيمة الوقت في المربع.
- انقر فوق حساب لإنشاء رسوم بيانية OCR وفقا للمعادلة 2:
OCR = ([O 2] in- [O 2] خارج) × FR = (217 نانومول / مل - [O 2] خارج) × FR / أساس الأنسجة (مكافئ 2)
حيث تركيز O 2 في KRB عندما يكون في حالة توازن مع 21٪ O2 عند 37 درجة مئوية هو 217 نانومول / مل ، FR هو معدل التدفق (بالمل / دقيقة) ، أساس الأنسجة هو كمية الأنسجة المحملة في الغرفة (أي عدد شبكية العين أو RPE-choroid-sclera أو RPE). - احفظ الرسوم البيانية كملفات .pdf بالضغط على زر تصدير الرسم البياني . الرسم البياني OCR كقيم مطلقة، أو ككسر من قيمة الحالة الثابتة عن طريق تحديد المربعات التي تتوافق مع مركب الاختبار ليتم تعيينها إلى 1 في صفحة إعدادات التحرير.
8. مقايسات كسور التدفق الخارجي
- إذا تعذر فحص العينات مباشرة بعد التجربة ، ضع الألواح عند 4 درجات مئوية إذا تم فحصها في اليوم التالي ، أو مجمدة إذا تم تخزينها لفترة أطول. إذا تم تجميد الألواح ، فقم بإذابة العينات عند 4 درجات مئوية (بحيث تظل العينات باردة).
- بمجرد إجراء المقايسات على كسور التدفق الخارجي المحددة ، يتم إدخال أعمدة البيانات (واحد لكل قناة) في ملف .csv مع الوقت (بالدقائق) في العمود الموجود في أقصى اليسار ، والتركيز في اليمين (إما في نانومول / مل أو نانوغرام / مل) ؛ يؤدي الارتباط في برنامج معالجة البيانات عند الضغط عليه إلى تحميل قالب.
- قم بتحميل هذا الملف إلى معالج البيانات لحساب البيانات ورسمها.
Representative Results
لتوضيح دقة البيانات الناتجة عن المكونات المعزولة للعين ، تم قياس OCR و LPR بثلاثة أنواع من الأنسجة (شبكية العين ، RPE-choroid-sclera ، وخلايا RPE) باتباع بروتوكول شائع الاستخدام (اختبار إجهاد الميتوكوندريا10; الشكل 10 والشكل 11 والشكل 12). يوضح الجدول 1 كمية الأنسجة المستخدمة لكل نسيج. تمت معالجة البيانات ورسمها بيانيا باستخدام حزمة البرامج التي تم تطويرها لنظام الموائع. يكون تحضير شبكية العين والصلبة المشيمية RPE مستقيما نسبيا ويستغرق أقل من 20 دقيقة لكل نوع من الأنسجة. كان التعرف الضوئي على الحروف ثابتا خلال الوقت الذي تم فيه حقن مركبات الاختبار ، مما يشير إلى صحة ووظيفة مستقرة للأنسجة ويدعم صحة الطريقة (الشكل 10). بمجرد التحقق من صحة كل نوع من الأنسجة ، لم نجد أنه من الضروري تشغيل عناصر التحكم حيث لا يتم حقن مركبات الاختبار لكل تجربة. تمشيا مع البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام طرق أكثر تقليدية للاندماج6،8،13 ، انخفاض OCR استجابة ل oligomycin وزيادة التعرف الضوئي على الحروف استجابة ل FCCP. كانت التغييرات في LPR في الاتجاه المعاكس لتلك التي لوحظت ل OCR: زاد oligomycin LPR ، والذي انخفض بعد ذلك (ولكن بشكل طفيف فقط) استجابة ل FCCP (الشكل 11). لمقارنة الأهمية الإحصائية لتأثير كل مركب اختبار متسلسل ، تم إجراء اختبارات t (والتي يتم حسابها تلقائيا بواسطة البرنامج الذي يأتي مع الأداة). نظرا لأن الهدف من الورقة كان وصف كيفية تنفيذ الطريقة ، فإن عدد النسخ المتماثلة المحمولة لم يكن دائما مرتفعا بما يكفي لإنتاج دلالة إحصائية. بشكل عام ، على الرغم من ذلك ، عندما كان عدد النسخ المتماثلة 3 أو أكثر ، كانت تأثيرات FCCP و oligomycin على كل من OCR و LPR كبيرة.
لم يتم تحليل خلايا RPE من قبل باستخدام أنظمة التدفق ولكنها استجابت بشكل مشابه ل RPE-choroid-sclera (بما يتفق مع الرأي القائل بأن جزءا كبيرا من التعرف الضوئي على الحروف يرجع إلى خلايا RPE ؛ الشكل 11). تسلط هذه الأمثلة التوضيحية الضوء على قدرة النظام على الحفاظ على صلاحية الأنسجة كما ينعكس في استقرار التعرف الضوئي على الحروف في قنوات التحكم ، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية للتغيرات في التعرف الضوئي على الحروف بالحجم الناجم عن oligomycin و FCCP ، والتي كانت أكثر من 100 إلى 1. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام مقايسات كسور التدفق الخارجي لربط معدل امتصاص أو إنتاج مجموعة واسعة من المركبات التي تتبادل مع السائل خارج الخلية مكملة ل OCR (في هذه الحالة ، LPR). سمحت ميزات الأداة هذه بالقياس الكمي الدقيق للاختلافات المميزة في استجابات الأنسجة بين أنواع الأنسجة التي يتم إجراؤها بالتوازي. OCR بواسطة RPE-choroid-sclera وخلايا RPE أكثر حساسية باستمرار ل oligomycin من شبكية العين (الشكل 11 والشكل 12) ، على الرغم من أن مدة التعرض ل FCCP لم تكن طويلة بما يكفي للوصول إلى حالة مستقرة. نشأت نقطة يجب مراعاتها عند استخدام DMSO كمذيب. عند التركيزات الأعلى ، كان ل DMSO (0.2٪) تأثير عابر على OCR بواسطة شبكية العين (يفترض أنه يعكس تأثير التغير في الضغط التناضحي الناجم عن تأثير DMSO على نفاذية الغشاء).
استنادا إلى افتراض أن KCN يمنع التنفس تماما من خلال عمله المباشر على السيتوكروم ج أوكسيديز ، يتم تعيين OCR في نهاية التعرض ل KCN على 0 ويتم حساب جميع قيم OCR بناء على التغيير بالنسبة لقيمة KCN. يمكن أن يحدث التعرف الضوئي على الحروف بشكل مستقل عن السلسلة التنفسية والسيتوكروم سي أوكسيديز. ومع ذلك ، فإن حجم هذه المساهمة في التعرف الضوئي على الحروف بشكل عام لا يزيد بشكل عام عن بضعة بالمائة (البيانات غير معروضة) وطول الوقت الممتد الذي تتعرض فيه الأنسجة ل KCN يضمن استنفاد ركائز الأكسدة التي ليست جزءا من سلسلة نقل الإلكترون.
التحليل الإحصائي
تم عرض تجارب فردية كما هو موضح في الأشكال ، ولكن مع قنوات متعددة تم حساب متوسطها. ثم تم رسم البيانات بيانيا كمتوسط ± الخطأ المعياري (SE ؛ محسوبة ك SD / √n).
الشكل 1. رسم تخطيطي لنظام الموائع / التقييم. تشمل المكونات الرئيسية العلبة ، وعناصر التحكم في درجة الحرارة ، وأنظمة السوائل وغرفة الأنسجة ، وتنظيم ضغط الغاز في مساحة الرأس فوق perifusate ، ومراقبة معدل تجميع / تدفق الكسور ، وكاشفات O2 . الاختصارات: MRM = وحدة خزان الوسائط ، PCM = وحدة غرفة الانصهار ، TCA = تجميعات غرفة الأنسجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. (أ) صورة للمكونات الرئيسية للأداة. تتكون المكونات الرئيسية من خزان الغاز (منظمات الضغط) ، والعلبة ، ومجمع الكسر والكمبيوتر. (ب) مخطط انسيابي تجريبي يوضح الفئات الرئيسية للخطوات والوقت المستغرق لإكمالها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. منظر ل MRM. يظهر MRM مع إدراج MRM (يسار) وأشرطة تحريك (يمين) موضوعة في الجزء السفلي من إدخالات MRM (موضوعة في كل جانب من مقسم MRM). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. تجميع الأنابيب وتجميع أنابيب التطهير في MRM. (أ) اختبار مجموعة أنابيب الحقن المركبة ومجموعة أنابيب التطهير المرفقة بالمنافذ الموجودة على MRM. (ب-ج) يتم وضع مجموعة حقن مركب الاختبار ومجموعة أنابيب التطهير (B) في الأخدود في مقدمة العلبة (C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. تشغيل جهاز التحكم في درجة الحرارة MRM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. غرف الأنسجة وخزان الغاز. وضع كاشف O2 على حامل الكاشف (الذي يدعم أيضا MRM و PCM) ، ووضع الشريط حول زعانف PCM التي تساعد على تأمين غرف الأنسجة في مكانها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7. (أ) منظمات الضغط العالي والمنخفض على خزان الغاز. (ب-ج) أنبوب التطهير. يسمح أنبوب التطهير لمساحة الرأس في MRM بتنظيف الهواء وملئه بالغاز من خزان الإمداد. صور توضح أنبوب التطهير المفتوح (B) وأنبوب التطهير المغلق (C). تظل مجموعة حقن مركب الاختبار مغلقة خلال عملية التطهير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8. غرفة الأنسجة وإعداد التدفق الخارجي. أ: أبعاد غشاء ترانسويل بعد تقطيعه إلى ثلاثة شرائط متساوية العرض. (ب) دعم التدفق الخارجي متعدد الأنابيب. (ج) دعامة التدفق الخارجي متعددة الأنابيب موضوعة على شفة العلبة مع محولات الأنابيب بالقرب من غرف الأنسجة. د: صورة لتجمعات أنابيب التدفق الخارجي المتصلة بحجرات الأنسجة. (ه) منظر جوي للحاوية بدون غطاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9. حقن مركب في MRM. حقن مركب اختبار من خلال منفذ الحقن في MRM باستخدام حقنة 5 مل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10. منحنيات OCR و LPR استجابة لمركبات الاختبار. OCR و LPR بواسطة شبكية العين المعزولة من الفئران (1 شبكية / قناة) استجابة لوجود أو غياب (التحكم) في مركبات الاختبار كما هو موضح. كل منحنى هو متوسط 6 نسخ متماثلة من تجربة واحدة (أشرطة الخطأ هي SE ؛ يتم حساب قيم p عن طريق إجراء اختبارات t مقترنة تقارن قيم الحالة المستقرة لكل عامل اختبار مع قيم عامل الاختبار السابق). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 11. منحنيات التعرف الضوئي على الحروف. التعرف الضوئي على الحروف بواسطة RPE-choroid-sclera والشبكية المعزولة من الفئران (1 شبكية أو 2 RPE-choroid-sclera / قناة) تم قياسها بالتوازي استجابة لمركبات الاختبار كما هو موضح. البيانات هي متوسط النسخ المتماثلة من تجربة واحدة (n = 2 و 4 ل RPE-choroid-sclera وشبكية العين على التوالي ؛ يتم حساب قيم p عن طريق إجراء اختبارات t مزدوجة تقارن قيم الحالة المستقرة لكل عامل اختبار مع قيم عامل الاختبار السابق). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 12. منحنيات OCR و LPR من خلايا RPE. OCR و LPR من خلايا RPE متصلة بأغشية ناقلة تم تقطيعها إلى شرائح وتحميلها في غرف الاندماج. البيانات هي متوسط النسخ المتماثلة من تجربة واحدة (n = 3 ، مع 1.5 أغشية / قناة (360000 خلية / قناة) ؛ يتم حساب قيم p عن طريق إجراء اختبارات t مزدوجة تقارن قيم الحالة المستقرة لكل عامل اختبار مع قيم عامل الاختبار السابق). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الأنسجة/الخلية | المبلغ / القناة | معدل التدفق: مل / دقيقة |
| شبكية العين (الماوس) | 1 | 0.025 |
| RPE-choroid-sclera (الماوس) | 2 | 0.02 |
| خلايا RPE على أغشية Transwell | 360000 خلية (4 × 1/3 شرائط مرشح) | 0.016 |
الجدول 1. مواصفات التشغيل الموصى بها للأنسجة المختلفة.
الشكل التكميلي 1. تمثيل رسومي للتصميم التجريبي. توقيت وتكوين التعرض لمركبات الاختبار ، وتوقيت جمع الكسور. زيادة التركيز (Conc Inc) هي التغيير في التركيز الذي سيتم تنفيذه. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2. واجهة المستخدم عند بدء التشغيل. واجهة المستخدم الخاصة بنافذة بدء تشغيل برنامج الكشف O 2 الذي يراقب O2 في غرف الأنسجة التي يتم إدخالها في PCM. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3. واجهة المستخدم لإعدادات التجربة. واجهة مستخدم لإدخال المعلومات التجريبية (يسار) وتحديد أوقات جمع كسور التدفق الخارج (يمين). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 4. واجهة المستخدم لصفحة الحقن. صفحة الحقن التي تحسب أحجام الحقن بناء على التركيزات المطلوبة لمركب الاختبار والحجم المتبقي في MRM. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 1: طرق تحضير عينة الأنسجة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
نظرا لأهمية الطاقة الحيوية في جميع جوانب وظيفة الخلية والحفاظ على المكونات المختلفة للعين ، هناك حاجة ماسة لطرق لدراسة تنظيمها. على وجه الخصوص ، تعتمد شبكية العين العصبية و RPE على التمثيل الغذائي لكل من توليد الطاقة وكذلك الإشارات داخل الخلايا وبين الخلايا14،15،16،17. بسبب قدرتها التأكسدية العالية ، لا يتم الحفاظ على الأنسجة المعزولة للعين بشكل جيد في ظل ظروف ثابتة18،19 ، وبالتالي تتطلب دراسة المكونات المعزولة للعين أنظمة تدفق يمكنها الحفاظ على عمليات التمثيل الغذائي وتقييمها. تم تطوير نظام الموائع لتوليد بيانات OCR و LPR من مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة وفي هذه الورقة قدمنا بروتوكولات مفصلة تم العثور عليها لتحقيق أفضل النتائج.
يتضمن المحدد الرئيسي لتوليد بيانات قوية باستخدام نظام التدفق التوازن المسبق للوسائط / المخزن المؤقت القائم على ثاني أكسيد الكربون2 عند 39 درجة مئوية (لضمان عدم تشبع perifusate بالغاز المذاب الذي من شأنه أن يتحلل أثناء التجربة). على وجه الخصوص ، سيتم تشبع الوسائط أو المخزن المؤقت KRB المخزن عند 4 درجات مئوية مقارنة ب 37 درجة مئوية وسوف يتحلل الغاز أثناء التجربة إذا كانت أوقات ما قبل التوازن غير كافية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب ألا تتعرض الأنسجة المحملة في غرف الأنسجة للصدمة بسبب العزل غير السليم للأنسجة بسبب التمزق أو الفصل غير الكامل للأنسجة ، أو عن طريق تعريض الأنسجة بكميات منخفضة من المخزن المؤقت القائم على البيكربونات للهواء الجوي لفترة طويلة جدا. التحكم في درجة الحرارة واستقرار التدفق وموثوقية اكتشاف O2 لها تباين ضئيل وهذه العوامل لا تساهم بشكل كبير في معدل الفشل.
يحتوي الجهاز على ثماني قنوات تدفق / غرف أنسجة تعمل في وقت واحد والتي يتم تزويدها ب perifusate من خزانين ، أربع غرف أنسجة لكل خزان. للحصول على الدورات الزمنية الأكثر دقة ل OCR ، يتم تصحيح المنحنيات الحركية بواسطة غرف غير محملة بالأنسجة. وبالتالي ، فإن البروتوكول التجريبي النموذجي سيشمل مجموعتين من ثلاث غرف نسيجية. تنقسم البروتوكولات بشكل عام إلى فئتين: الأولى هي بروتوكولات مركبات الاختبار المختلفة على كل جانب (على سبيل المثال المخدرات / المركبات على جانب واحد من MRM ، والمركبة فقط على الجانب الآخر) ؛ والثاني هو نفس بروتوكول حقن مركب الاختبار على جانبي MRM ، ولكن نموذج الأنسجة أو الأنسجة المختلفة على كل جانب من MRM. في هذه الورقة ، تمت مقارنة تأثيرات oligomycin و FCCP على شبكية العين مع OCR بواسطة الأنسجة التي لم تتعرض لأي مركبات اختبار ، وتم تقييم نسيجين بشكل متزامن بموجب نفس البروتوكول والظروف لتحديد السلوك الخاص بالأنسجة. تم توضيح هذا الأخير في هذه الدراسة من خلال إظهار زيادة النطاق الديناميكي لمعدل الأيض بواسطة RPE-choroid-sclera بالنسبة إلى شبكية العين بالتوازي في نفس التجربة. وصفت تقارير أخرى مجموعة واسعة من تصميمات الدراسة بما في ذلك قياس التأثيرات المتغيرة لمستويات O2 على OCR و LPR ، واعتماد تركيز الوقود والأدوية والسموم20,21. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أننا قصرنا تحليل كسور التدفق الخارجي على قياس اللاكتات وحساب LPR ، فإن محتوى المعلومات للتجربة يزداد بشكل كبير إذا تم فحص مركبات وفئات متعددة من المركبات في كسور التدفق الخارجي مثل الهرمونات والناقلات العصبية وإشارات الخلية والمستقلبات التي يمكنها الخروج من الخلايا20,22 ، 23.
يكون تحميل شبكية العين المعزولة أو RPE-choroid-sclera أمرا بسيطا ، وبمجرد عزل هذه الأنسجة يتم وضعها ببساطة في الجزء العلوي من غرف الأنسجة بالملقط ويسمح لها بالغرق في الفريت. تطور خلايا RPE المستزرعة على إدخالات المرشح استقطابا مناسبا وعلامات نضج RPE بعد 4-8 أسابيع في الثقافة. ليس من الممكن إزالة RPE لتحليل الخلايا الحية بمجرد توصيلها بغشاء البئر ، إذا كان سيتم الحفاظ على نضج RPE والاستقطاب24. يمكن أن تستوعب غرفة perifusion شرائط من غشاء transwell التي يتم قطعها بمشرط أثناء غمرها في المخزن المؤقت وإدخالها بسرعة في غرف الأنسجة. على الرغم من وضع شرائط مرشح القطع في نظام ثابت24 ، لا تتوفر طريقة أخرى للسوائل لتقييم هذه الأنواع المهمة من الخلايا. كانت استجابات خلايا RPE سريعة وأكثر ديناميكية من شبكية العين أو RPE-choroid-sclera ، ويرجع ذلك جزئيا على الأرجح إلى الوصول الفوري لكل من الجوانب القمية والقاعدية لخلايا RPE المكونة كطبقة أحادية على إدخال الغشاء.
هناك عامل آخر في ضمان أن البيانات لديها أعلى إشارة إلى الضوضاء وهو اختيار النسبة المثلى للأنسجة المحملة في غرف الانتشار بالنسبة لمعدل التدفق. يؤدي القليل جدا من الأنسجة بالنسبة لمعدل التدفق إلى اختلاف تركيز O2 المذاب بين التدفق الداخل والخارج وهو صغير جدا ويصعب قياسه بشكل موثوق. في المقابل ، إذا كان التدفق بطيئا جدا ، يصبح تركيز O2 منخفضا جدا بحيث يتأثر النسيج بنقص الأكسجة. ومع ذلك ، يمكن الحفاظ على تدفق السائل المدفوع بضغط الغاز بمعدلات تدفق تصل إلى 5 مل / دقيقة تتطلب كميات صغيرة فقط من الأنسجة للحصول على قياسات دقيقة للتعرف الضوئي على الحروف و LPR. في التجارب الموضحة هنا ، تم استخدام حوالي 20 مل / دقيقة / قناة والتي كانت مناسبة إما لشبكية واحدة أو اثنين من RPE-choroid-scleras أو 360000 خلية RPE. لتقليل تأثيرات النظام التي تؤخر وتشتت تعرض الأنسجة لمركب الاختبار المحقون ، يتم توفير أحجام متعددة من غرف الأنسجة ، بحيث يتم مطابقة كمية الأنسجة (ومعدل التدفق) مع الحجم المناسب للغرفة.
تم تمثيل البيانات من التحليلات الموضحة في هذه الورقة بطريقتين: الحجم المطلق فيما يتعلق بالمعدل ، أو التغيرات الجزئية بالنسبة إلى الحالة المستقرة أو خط الأساس. كان التركيز على توضيح قياس الاستجابات لمركبات الاختبار. ومع ذلك ، فإن نظام الموائع مناسب تماما لتقييم ومقارنة آثار علاج الأنسجة قبل تحليل perifusion مثل التعديلات الجينية. يكون اختبار ما إذا كان العلاج مختلفا عن التحكم أقوى إذا تم تحليل آثار العلاج على الاستجابات الطبيعية لمركبات الاختبار. إذا كان التحليل يتطلب مقادير مطلقة ، فإن القوة الإحصائية لتحليلات العينات التي تتم معالجتها مسبقا يتم تعظيمها إذا تم إجراء تقييمها وضوابطها في نفس تجربة perifusion.
باستثناء المحرك ، يتم توفير جميع الأجزاء التي تتلامس مع السائل من قبل الشركة المصنعة كمواد استهلاكية وتم تعقيمها. لا ينبغي إعادة استخدام هذه الأجزاء ، حيث ستفقد التجارب أحيانا بسبب التنظيف غير الكامل والأسطح الملوثة. النظام في بداية الإعداد معقم. ومع ذلك ، يتم إضافة الوسائط إلى MRM ، ويتم تحميل الأنسجة في الغرف في ظل ظروف غير معقمة. لقد قمنا بقياس التعرف الضوئي على الحروف في النظام الذي يتم تجميعه بأجزاء معقمة ، ولكن حيث يتم إجراء التجربة نفسها في ظل ظروف غير معقمة. يستغرق الأمر حوالي 14 ساعة حتى تتراكم البكتيريا إلى درجة وجود OCR قابل للقياس (نتائج غير منشورة). إذا تم استخدام بروتوكولات أقل من 10 ساعات أو نحو ذلك ، فإن تراكم البكتيريا وأي آثار ناتجة عنها ستكون ضئيلة.
يستخدم العديد من الباحثين أدوات مصممة لقياس التعرف الضوئي على الحروف تحت الحضانة الثابتة لطبقة أحادية من الخلايا ذات الإنتاجية العالية نسبيا25,26. في المقابل ، تحافظ أداة الموائع التي اختبرناها ووصفناها في هذه الورقة على الأنسجة من خلال ضمان توصيل O2 الكافي وهو أمر بالغ الأهمية لمسافات الانتشار الأكبر الموجودة في عينات الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، فهي قادرة على جمع الكسور مما يسمح بتقييم معلمات متعددة بالتوازي مع OCR مما يعزز بشكل كبير القدرة على دراسة العلاقات بينها. أخيرا ، يمكن التحكم في تركيزات الغاز المذاب (مثل O 2 و CO 2) ، مما يزيد من مدة التجارب مع الوسائط القائمة على البيكربونات والمخزن المؤقت ، مما يمكن المستخدم من دراسة تأثيرات O2. وتجدر الإشارة إلى أن أحد القيود المفروضة على كلتا المنهجيتين هو عدم القدرة على دراسة غسل مركبات الاختبار ، وهي وظيفة تمتلكها أنظمة الانتشار الأخرى4،27،28. هناك اعتبار آخر عند تحديد طريقة التحليل المثلى وهو حقيقة أن أنظمة الموائع تستخدم وسائط ومركبات اختبار أكثر من الأنظمة الثابتة. يتم تقليل النفقات الإضافية مع أنظمة الموائع الحالية على الرغم من انخفاض معدلات التدفق التي يمكن استخدام النظام.
بشكل عام ، يتم وصف وصف مفصل للبروتوكولات لإجراء التجارب باستخدام أداة تدفق / تقييم جديدة. لخصت البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام شبكية العين و RPE-choroid-sclera النتائج السابقة التي تم الحصول عليها باستخدام أنظمة أكثر صعوبة في الاستخدام (وغير متوفرة بسهولة). وقد ثبت أيضا أن النظام يمكنه الحفاظ على خلايا RPE المرتبطة بأغشية transwell وتقييمها ، وهو نموذج خلوي مهم للغاية لم يتم تحليله من قبل باستخدام أنظمة التدفق بسبب هشاشة الخلايا. تتكون الأجزاء الرئيسية للبروتوكول من وقت إعداد مدته 75 دقيقة ، تليها فترة توازن مدتها 90 دقيقة والبروتوكول التجريبي مما يجعله مناسبا للاستخدام الروتيني من قبل المختبرات غير المتخصصة في تشغيل أنظمة الموائع. على الرغم من أننا ركزنا على قياس الاستجابة الحادة للأنسجة لاختبار المركبات ، إلا أن النظام مناسب جدا لمقارنة الأنسجة من مصادر مختلفة مثل النماذج الحيوانية أو نماذج الخلايا التي تم تعديلها وراثيا أو خضعت لعلاجات / ظروف اختبارية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن نطاق المقايسات التي يمكن إجراؤها على كسور التدفق الخارجي واسع النطاق ويشمل المستقلبات وجزيئات إشارات الخلية والهرمونات / الناقلات العصبية المفرزة بالإضافة إلى التحليل متعدد المكونات الناتج عن قياس الطيف الكتلي على الكسور وكذلك الأنسجة.
Disclosures
لدى I.R.S. ، M.G. ، و K.B. علاقات مالية مع EnTox Sciences، Inc. (جزيرة ميرسر ، واشنطن) ، الشركة المصنعة / الموزعة لنظام الانصهار BaroFuse الموصوف في هذه الدراسة. يعلن جميع المؤلفين الآخرين عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM148741 I.R.S.) ، U01 EY034591 ، R01 EY034364 ، مؤسسة BrightFocus ، أبحاث للوقاية من العمى (JRC) و R01 EY006641 و R01 EY017863 و R21 EY032597 (JBH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BIOLOGICAL SAMPLES | |||
| C57BL/6J mice | Envigo Harlan (Indianapolis, IN) | N/A | |
| REAGENTS | |||
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920L9795 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270G | |
| KCN | Sigma-Aldrich | 60178 | |
| Lactate | MilliporeSigma | L6661 | |
| Oliigomycin A | Sigma-Aldrich | 75351L9795 | |
| CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING | |||
| Beuthanasia-D | Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ | N/A | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital | Virbac | RXEUTHASOL | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | 12303C | |
| Hank’s Buffered Salt Solution | GIBCO | 14065056 | |
| Krebs Ringer Bicarbonate (KRB) | Thermo Fisher Scientific | J67795L9795 | |
| Matrigel | ThermoFisher | #CB-40230 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| ROCKi | Selleck Chemicals | Y-27632 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25-200-072 | |
| SUPPLIES | |||
| Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2 | Praxair Distribution, Inc | N/A | |
| Transwell filters | MilliporeSigma | 3470 | |
| COMMERCIAL ASSAYS | |||
| Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit | ThermoFisher | A22189 | |
| Glucose Oxidase from Aerococcus viridans | Invitrogen (Carlsbad, CA) | A22189L9795 | |
| Lactate Oxidase | Sigma-Aldrich | L9795 | |
| EQUIPMENT | |||
| BaroFuse Multi-Channel Perifusion system | EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA | Model 001-08 | |
| Synergy 4 Fluorometer | BioTek (Winooski, VT) | S4MLFPTA |
References
- Lacy, P. E., Walker, M. M., Fink, C. J. Perifusion of isolated rat islets in vitro: Participation of the microtubular system in the biphasic release of insulin. Diabetes. 21 (10), 987-998 (1972).
- Doliba, N. M., et al. Metabolic and ionic coupling factors in amino acid-stimulated insulin release in pancreatic beta-HC9 cells. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (6), E1507-E1519 (2007).
- Sweet, I. R., et al.
- Chertov, A. O., et al.
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Bisbach, C. M., et al. Succinate Can Shuttle Reducing Power from the Hypoxic Retina to the O2-Rich Pigment Epithelium. Cell Reports. 31 (5), 107606 (2020).
- Du, J., et al. Inhibition of mitochondrial pyruvate transport by zaprinast causes massive accumulation of aspartate at the expense of glutamate in the retina. The Journal of Biological Chemistry. 288 (50), 36129-36140 (2013).
- Hass, D. T., et al. Succinate metabolism in the retinal pigment epithelium uncouples respiration from ATP synthesis. Cell Reports. 39 (10), 110917 (2022).
- Kamat, V., et al. Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism. Elife. 10, e66716 (2021).
- Stryer, L. Biochemistry. , 4th edn, Freeman and Company, New York. (1995).
- Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test. STAR Protocols. 2 (1), 100245 (2021).
- Engel, A. L., et al. Extracellular matrix dysfunction in Sorsby patient-derived retinal pigment epithelium. Experimental Eye Research. 215, 108899 (2022).
- Zhang, R., et al. Inhibition of Mitochondrial Respiration Impairs Nutrient Consumption and Metabolite Transport in Human Retinal Pigment Epithelium. Journal of Proteome Research. 20 (1), 909-922 (2021).
- Hurley, J. B. Retina Metabolism and Metabolism in the Pigmented Epithelium: A Busy Intersection. Annual Review of Vision Science. 7, 665-692 (2021).
- Xiao, J., et al. Autophagy activation and photoreceptor survival in retinal detachment. Experimental Eye Research. 205, 108492 (2021).
- Okawa, H., Sampath, A. P., Laughlin, S. B., Fain, G. L. ATP consumption by mammalian rod photoreceptors in darkness and in light. Current Biology. 18 (24), 1917-1921 (2008).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. , 100846 (2020).
- Yu, J., et al. Emerging strategies of engineering retinal organoids and organoid-on-a-chip in modeling intraocular drug delivery: Current progress and future perspectives. Advanced Drug Delivery Reviews. 197, 114842 (2023).
- Arjamaa, O., Nikinmaa, M. Oxygen-dependent diseases in the retina: role of hypoxia-inducible factors. Experimental Eye Research. 83 (3), 473-483 (2006).
- Kamat, V., et al. A Versatile Multi-Channel Fluidics System for the Maintenance and Real-Time Metabolic and Functional Assessment of Tissue or Cells. Cell Reports Methods. In Press. , (2023).
- Neal, A., et al. Quantification of Low-Level Drug Effects Using Real-Time, in vitro Measurement of Oxygen Consumption Rate. Toxicological Sciences. 148 (2), 594-602 (2015).
- Jung, S. R., et al. Reduced cytochrome C is an essential regulator of sustained insulin secretion by pancreatic islets. The Journal of Biological Chemistry. 286 (20), 17422-17434 (2011).
- Rountree, A. M., et al. Control of insulin secretion by cytochrome C and calcium signaling in islets with impaired metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 289 (27), 19110-19119 (2014).
- Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).
- Jarrett, S. G., Rohrer, B., Perron, N. R., Beeson, C., Boulton, M. E. Assessment of mitochondrial damage in retinal cells and tissues using quantitative polymerase chain reaction for mitochondrial DNA damage and extracellular flux assay for mitochondrial respiration activity. Methods in Molecular Biology. 935, 227-243 (2013).
- Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).
- Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2008).
- Doliba, N. M., Qin, W., Vinogradov, S. A., Wilson, D. F., Matschinsky, F. M. Palmitic acid acutely inhibits acetylcholine- but not GLP-1-stimulated insulin secretion in mouse pancreatic islets. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 299 (3), E475-E485 (2010).
