Hydrogenperoxid (H2O2) er både en kilde til oxidativ skade og et signalmolekyle. Denne protokol beskriver, hvordan man måler mitokondriel H2 O2 ved hjælp af mitokondrie-målrettet HyPer7 (mtHyPer7), en genetisk kodet ratiometrisk biosensor, i levende gær. Det beskriver, hvordan man optimerer billeddannelsesforholdene og udfører kvantitativ cellulær og subcellulær analyse ved hjælp af frit tilgængelig software.
Mitokondriel dysfunktion eller funktionel ændring findes i mange sygdomme og tilstande, herunder neurodegenerative og muskuloskeletale lidelser, kræft og normal aldring. Her beskrives en tilgang til vurdering af mitokondriefunktion i levende gærceller ved cellulære og subcellulære opløsninger ved hjælp af en genetisk kodet, minimalt invasiv, ratiometrisk biosensor. Biosensoren, mitokondrie-målrettet HyPer7 (mtHyPer7), detekterer hydrogenperoxid (H2O2) i mitokondrier. Den består af en mitokondriesignalsekvens smeltet sammen med et cirkulært permuteret fluorescerende protein og H2O2-responsivt domæne af et bakterielt OxyR-protein. Biosensoren genereres og integreres i gærgenomet ved hjælp af et CRISPR-Cas9 markørfrit system for mere konsistent ekspression sammenlignet med plasmidbårne konstruktioner.
mtHyPer7 er kvantitativt målrettet mod mitokondrier, har ingen påviselig effekt på gærvæksthastighed eller mitokondriemorfologi og giver en kvantitativ aflæsning for mitokondrielH2O2under normale vækstbetingelser og ved udsættelse for oxidativt stress. Denne protokol forklarer, hvordan man optimerer billeddannelsesforholdene ved hjælp af et spindeskivekonfokalmikroskopsystem og udfører kvantitativ analyse ved hjælp af frit tilgængelig software. Disse værktøjer gør det muligt at indsamle rig rumlig tidsmæssig information om mitokondrier både inden for celler og blandt celler i en population. Desuden kan arbejdsgangen beskrevet her bruges til at validere andre biosensorer.
Mitokondrier er essentielle eukaryote cellulære organeller, der er velkendte for deres funktion i at producere ATP gennem oxidativ phosphorylering og elektrontransport1. Derudover er mitokondrier steder til calciumopbevaring, syntese af lipider, aminosyrer, fedtsyre og jern-svovlklynger og signaltransduktion 2,3. Inden for celler danner mitokondrier et dynamisk netværk med karakteristisk morfologi og fordeling, som varierer alt efter celletype og metabolisk tilstand. Selvom mitokondrier kan smelte sammen og dele sig, er ikke alle mitokondrier i en celle ækvivalente. Talrige undersøgelser har dokumenteret mitokondriernes funktionelle heterogenitet i individuelle celler i attributter som membranpotentiale og oxidativ tilstand 4,5,6. Denne variation i mitokondriefunktionen skyldes dels beskadigelse af organellen fra mtDNA-mutationer (som forekommer med en højere hastighed end i nukleært DNA) og oxidativ skade forårsaget af reaktive oxygenarter (ROS), der genereres både inden for og uden for organellen 7,8,9. Skader på organellen afbødes af mitokondrie kvalitetskontrolmekanismer, der reparerer skaden eller eliminerer mitokondrier, der er beskadiget uden reparation10.
Hydrogenperoxid (H2O2) er en reaktiv oxygenart, der er en kilde til oxidativ skade på cellulære proteiner, nukleinsyrer og lipider. Imidlertid tjenerH2O2også som et signalmolekyle, der regulerer cellulære aktiviteter gennem reversibel oxidation af thioler i målproteiner11,12. H2O2 fremstilles af elektroner, der lækker fra mitokondrieelektrontransportkæden og af specifikke enzymer, såsom NADPH-oxidase og monoaminoxidaser 13,14,15,16,17,18,19,20. Det er også inaktiveret af antioxidant systemer, herunder dem, der er baseret på thioredoxin og glutathion21,22,23. Således er analyse af mitokondrie H2O2-niveauer afgørende for at forstå denne metabolits rolle i normal mitokondriel og cellulær funktion og under betingelser med oxidativ stress.
Det overordnede mål med denne protokol er at detektere mitokondrie H2O2 ved hjælp af en genetisk kodet ratiometriskH2O2biosensor, HyPer7, der er målrettet mod organellen (mtHyPer7). mtHyPer7 er en kimær bestående af mitokondriesignalsekvensen fra ATP9 (Su9-præsekvensen), en cirkulært permuteret form af grønt fluorescerende protein (GFP) og H2O2-bindingsdomænet for OxyR-proteinet fra Neisseria meningitidis24 (figur 1). I cirkulært permuteret GFP smeltes N- og C-termini af native GFP, og nye terminer dannes nær kromoforen, hvilket giver større mobilitet til proteinet og større labilitet af dets spektrale egenskaber sammenlignet med native GFP25. Interaktionen mellem mtHyPer7s OxyR-domæne og H2O2 er højaffinitet,H2O2-selektivog fører til reversibel oxidation af de konserverede cysteinrester og disulfidbrodannelse. Konformationsændringer forbundet med oxidationen af OxyR overføres til den cirkulært permuterede GFP i mtHyPer7, hvilket resulterer i et spektralskift i excitationsmaksimumet for mtHyPer7-kromoforen fra 405 nm i reduceret tilstand til 488 nm i H2O2-oxideret tilstand26. Således afspejler forholdet mellem fluorescens fra mtHyPer7 som reaktion på excitation ved 488 nm versus 405 nm oxidationen af sonden medH2O2.
Ideelt set bør en biosensor give en absolut, kvantitativ aflæsning i realtid af dets målmolekyle. Desværre er dette dog ikke altid muligt i målinger i den virkelige verden. I tilfælde af oxidationssensorer, såsom mtHyPer7, påvirkes realtidsaflæsningen af reduktionshastigheden for disulfidbroen. De reduktionssystemer, der anvendes af ROS-biosensorer, er forskellige, og disse kan dramatisk ændre sonderesponsdynamikken – som vist ved sammenligningen af HyPer7, reduceret med thioredoxinsystemet, og roGFP2-Tsa2ΔCR, reduceret med glutathion-in gærcytosol27. For at drage en konklusion om den relativeH2O2-koncentrationfra mtHyPer7-forhold må man således antage, at reduktionssystemet opretholder en konstant kapacitet under eksperimentet. Uanset disse overvejelser er HyPer7 og relaterede sonder blevet brugt i forskellige sammenhænge til at indhente oplysninger om H2O2i levende celler25,28,29.
Figur 1: Design, molekylær mekanisme og excitations-/emissionsspektre af H2O2-biosensoren mtHyPer7. (A) mtHyPer7-sonden er afledt ved at indsætte cirkulært permuteret GFP i OxyR-RD-domænet fra Neisseria meningitidis. Den indeholder mitokondriemålretningssekvensen fra underenhed 9 af ATP-syntase fra Neurospora crassa (Su9). (B) Illustration af H 2 O2-sensormekanismeni mtHyPer7. Oxidation af cysteiner i RD-domænet øger fluorescensemission ved excitation ved 488 nm og reducerer emission produceret ved excitation ved 405 nm. C) Excitations- og emissionsspektre for HyPer7 i oxideret og reduceret form. Denne figur er genoptrykt med tilladelse fra Pak et al.24. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; cpGFP = cirkulært permuteret GFP. Klik her for at se en større version af denne figur.
Denne ratiometriske billeddannelse af mtHyPer7 giver vigtige fordele for mitokondriel H2O2-kvantificering24,27; Det giver en intern kontrol for sondekoncentration. Desuden er skiftet i excitationstop produceret af H2O2-eksponering ikke fuldstændigt, selv i mættende koncentrationer afH2O2. Således kan forholdsbilleddannelse øge følsomheden ved at inkorporere to spektralpunkter i analysen.
Den mtHyPer7-sonde, der anvendes her, har en meget høj affinitet forH2O2og relativt lav følsomhed over for pH24 og er med succes blevet målrettet mod Caenorhabditis elegans mitokondrier30. Dette protein er også blevet brugt i gær27,31. Tidligere undersøgelser var imidlertid afhængige af plasmidbåren ekspression af mtHyPer7, hvilket resulterer i celle-til-celle-variabilitet i sondeekspression27. Derudover blev konstruktionen beskrevet i denne protokol integreret i en bevaret, genfri region på kromosom X32 ved hjælp af en CRISPR-baseret tilgang til markørfri integration. Ekspressionen af det integrerede biosensorgen styres også af den stærke konstitutive TEF1-promotor (figur 2). Som et resultat er der mere stabil, konsistent ekspression af biosensoren i gærcellepopulationer sammenlignet med den, der observeres ved hjælp af plasmidbåren biosensorekspression, og celler, der bærer biosensoren, kan formeres uden behov for selektive medier.
Figur 2: Generering af mtHyPer7-ekspressive celler ved hjælp af CRISPR. Den Cas9- og sgRNA-holdige plasmid- (YN2_1_LT58_X2site) og PCR-amplificerede mtHyPer7-holdige biosensorkonstruktion indføres i spirende gærceller ved lithiumacetattransformation. Det genfrie indsættelsessted på kromosom X (X2) genkendes og skæres af Cas9-protein med sgRNA’et, og biosensoren integreres i genomet ved homolog rekombination. Efter identifikation af de vellykkede transformanter ved mikroskopisk screening, koloni-PCR og sekventering fjernes Cas9-plasmidet (helbredes) ved vækst i ikke-selektive medier. Forkortelser: sgRNA = single guide RNA; TEF = transkriptionsforstærkerfaktor. Klik her for at se en større version af denne figur.
Endelig tilbyder mtHyPer7 fordele i forhold til andre ROS-biosensorer. For eksempel kan organiske farvestoffer, der anvendes til at detektere ROS (f.eks. Dihydroethidium [DHE]2 og MitoSOX3), producere ujævn eller uspecifik farvning og leveres ofte i opløsningsmidler såsom ethanol eller dimethylsulfoxid, som kræver yderligere kontrol for opløsningsmiddelvirkninger. En anden klasse af ROS-biosensorer er fluorescensresonansenergioverførselsbaserede (FRET) -baserede biosensorer (f.eks. Redoxfluor til cellulær redoxtilstand4 og peroxidsensorerne HSP-FRET5, OxyFRET 6 og PerFRET6). Disse sonder er genetisk kodede og meget følsomme i princippet og kan kvantitativt målrettes mod mitokondrier ved hjælp af velkarakteriserede mitokondriesignalsekvenser. Der er dog udfordringer i brugen af FRET-baserede sonder, herunder baggrund på grund af krydsexcitation og gennemblødning, og strenge krav til fluoroforernes nærhed og orientering for FRET for at forekomme33,34. Derudover består FRET-sonder af to fluorescerende proteiner, der kræver større konstruktioner til ekspression i celler af interesse sammenlignet med spektra-skiftende sonder. Protokollen beskrevet her blev udviklet for at drage fordel af styrkerne ved den HyPer7-baserede biosensor og for at bruge denne kompakte, ratiometriske, højaffinitet, genetisk kodede sonde til kvantitativ billeddannelse af peroxid i mitokondrier i levende gær.
I denne protokol beskrives en metode til anvendelse af mtHyPer7 som biosensor til vurdering af mitokondrielH2O2i levende spirende gærceller. Biosensoren konstrueres ved hjælp af en CRISPR-baseret metode og indføres i en bevaret genfri region i gærgenomet uden brug af valgbare markører. Sammenlignet med plasmidbårne biosensorer udtrykkes integrerede sensorer i alle celler og på ensartede niveauer, hvilket giver mere pålidelige kvantificeringsresultater. Der anvendes ingen valgbare markører til at generere mtHyPer7-ekspressive celler, hvilket giver mulighed for anvendelse af en bredere vifte af stammebaggrunde og letter den genetiske modifikation af biosensorekspressive celler. mtHyPer7-proteinet er korrekt målrettet mod mitokondrier uden mærkbare virkninger på mitokondriemorfologi, funktion, distribution eller cellulære væksthastigheder. mtHyPer7 viser et dosisafhængigt respons på eksternt tilsatH2O2. Desuden er mtHyPer7 i stand til at rapportere om heterogeniteten af mitokondriekvalitet med subcellulær opløsning. Endelig forårsager brug af et spindediskkonfokalmikroskop i modsætning til vidvinkelmikroskopi til billeddannelse mitokondriemålrettede biosensorer mindre fotoblegning til fluoroforer og genererer billeder i høj opløsning til analyse af subcellulære forskelle.
Begrænsninger og alternative tilgange
Denne metode er ikke egnet til billeddannelse af celler i mere end 10 minutter, da cellerne tørrer ud under dæksedlen. For længerevarende billeddannelse er det bedre at bruge agarpudemetoden46 eller at immobilisere celler i en glasbundet kulturskål fyldt med SC-medium.
Valget af biosensor bør styres af koncentrationen af målet under eksperimentelle betingelser. Hvis følsomheden af HyPer7 er for høj, anbefales en anden HyPer-version, såsom HyPer3 eller HyPerRed47,48. Det skal dog bemærkes, at andre HyPer-sonder er mere pH-følsomme. For højere følsomhed kan den peroxiredoxinbaserede roGFP være mere passende (roGFP2Tsa2ΔCR)27.
H2O2-sensorens oxidationssteady state er bundet til både oxidations- og reduktionshastigheder. Oxidationshastigheden af biosensorer skyldes hovedsageligtH2O2, men reduktionshastigheden afhænger af antioxidantreduktionssystemerne, der er aktive i cellen og organellen. Det har vist sig, at HyPer7 overvejende reduceres af thioredoxinsystemet i gærcytosol, og dets reduktion er hurtigere end for roGFP2Tsa2ΔCR27. Derfor bør sondens forskellige reduktionsmekanismer og responsdynamik tages i betragtning ved fortolkning af målinger af H2O2-biosensorer. For at udledeH2O2-niveauerfra biosensoraflæsningen må det antages, at reduktionssystemet opretholder en konstant kapacitet under forsøget. Som et alternativ til de scripts, der er beskrevet her, er en række andre software blevet stillet frit til rådighed til analyse af redoxsensorer49.
Kritiske trin
Med enhver biosensor er det afgørende at demonstrere, at biosensoren i sig selv ikke påvirker den proces, der måles. Derfor er det vigtigt at sammenligne vækst og mitokondriel morfologi af stammer under hver eksperimentel tilstand. Her vurderes mitokondriemorfologi ved hjælp af MitoTracker Red, som pletter mitokondrier på en membranpotentialeafhængig måde. Imidlertid kan sammenligning af mitokondrier i utransformerede og biosensortransformerede celler opnås ved farvning med tetramethylrhodaminmethylester (TMRM), et alternativt membranpotentialefølende mitokondrielt vitalt farvestof, eller MitoTracker Green, som pletter mitokondrier uafhængigt af membranpotentiale. Hvis der er mistanke om skadelige virkninger, kan det hjælpe at reducere udtryksniveauet eller ændre integrationswebstedet.
Validering af sondens dosis-respons-adfærd og signal-støj-forholdet i billeddannelsesteknikken er også afgørende for at indsamle robuste resultater. Hvis variabiliteten inden for en gruppe overstiger variabiliteten mellem grupper, bliver forskelle vanskelige at opdage. Variabilitet inden for gruppen kan skyldes ægte populationsvariation eller støj i detektionsprocessen. De vigtigste trin til at øge signal: støjforholdet er billedoptagelse (pixelværdiområde og støj), baggrundssubtraktion og tærskelværdi.
Støjeffekter kan også reduceres under beregningstrinnene. Den mest enkle fremgangsmåde er at beregne den vægtede middelintensitet ud fra forholdsbilledmålingerne (Resultater.csv), hvor hver pixel repræsenterer det lokale forhold mellem excitationseffektiviteten. Dette giver et “pixelwise” forhold. Men hvis billedsignal:støj-forholdet er lavt, kan der opnås mere robuste resultater ved at beregne den vægtede gennemsnitsintensitet for et investeringsafkast i både tæller- og nævnerens kanaler og derefter beregne forholdet mellem disse to vægtede gennemsnit (“regionvis” forhold).
Hvis du vil vælge en tærskelmetode, skal Fiji-kommandoen Billede | Juster | Auto Threshold kan bruges til automatisk at prøve alle indbyggede Fiji-metoder. For at evaluere segmentering (tærskelværdi) konverteres en gemt maske til en markering ved at klikke på Rediger | Udvælgelse | Opret markering, føjet til ROI Manager (ved at trykke på T) og derefter aktiveret på den rå billedfil. Hvis mitokondrier ikke påvises tilstrækkeligt, skal en anden segmenteringsmetode forsøges.
Når du sammenligner billeder, er det vigtigt at erhverve alle billeder med identiske billedbehandlingsforhold samt at vise alle billederne med identisk kontrastforbedring.
Mitokondriebevægelse skal overvejes ved optimering af billeddannelsesforhold. Hvis mitokondrierne bevæger sig markant mellem excitation ved 405 og 488 nm, vil forholdsbilledet ikke være nøjagtigt. Det anbefales at holde eksponeringstiden <500 ms og ændre excitation ved hjælp af den hurtigste tilgængelige metode (f.eks. en triggerpuls eller akustooptisk justerbart filter). Når du fanger en Z-stak, skal begge excitationer udføres for hvert Z-trin, før du går videre til næste Z-trin.
Til visning af resultaterne er ændringer i nuance (farve) mere indlysende for det menneskelige øje end ændringer i intensitet. Derfor konverteres forholdsværdien til en farveskala for lettere visuel fortolkning. Farvelagte billeder kan være umodulerede, hvor alle mitokondriepixels vises med samme lysstyrke, eller intensitetsmoduleret, hvor pixelintensiteten i det originale billede bruges til at indstille intensiteter i det farvede billede.
Ændring og fejlfinding
Som et alternativ til at bekræfte mitokondriefunktionen ved udfordring med paraquat kan celler replikeres eller podes i fermenterbare og ikke-fermenterbare kulstofkilder.
For baggrundssubtraktion, rullende boldsubtraktion (ved at navigere til Proces | Træk baggrund fra…) kan også anvendes til at fjerne uensartethed i belysningen. Det skal sikres, at tilstedeværelsen af celler ikke ændrer baggrunden, der trækkes fra (ved at markere muligheden for at oprette baggrund og undersøge resultatet).
Sammenfattende giver mtHyPer7-sonden en konsistent, minimalt invasiv metode til at relatere den morfologiske og funktionelle status for gærmitokondrier i levende celler og tillader undersøgelse af en vigtig cellulær stressor og signalmolekyle i et genetisk medgørligt, let tilgængeligt modelsystem.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Katherine Filpo Lopez for ekspert teknisk assistance. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (NIH) (GM122589 og AG051047) til LP.
Disse undersøgelser brugte den konfokale og specialiserede mikroskopi delte ressource fra Herbert Irving Comprehensive Cancer Center ved Columbia University, delvist finansieret gennem NIH / NCI Cancer Center Support Grant P30CA013696.
100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens | Nikon | MRD01905 | |
Adenine sulfate | Sigma-Aldrich | #A9126 | |
Bacto Agar | BD Difco | #DF0145170 | |
Bacto Peptone | BD Difco | #DF0118170 | |
Bacto Tryptone | BD Difco | #DF211705 | |
Bacto Yeast Extract | BD Difco | #DF0127179 | |
BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
BglII | New England Biolabs | R0144S | |
Carbenicilin | Sigma-Aldrich | C1389 | |
Carl Zeiss Immersol Immersion Oil | Carl Zeiss | 444960 | |
Dextrose (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | #G8270 | |
E. cloni 10G chemical competent cell | Bioserch Technologies | 60108 | |
FIJI | NIH | Schindelin et al 2012 | |
G418 (Geneticin) | Sigma-Aldrich | A1720 | |
GFP emission filter | Chroma | 525/50 | |
Gibson assembly | New England Biolabs | E2611 | |
Graphpad Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
H2O2 (stable) | Sigma-Aldrich | H1009 | |
HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO | Pon Lab | JYE057/EP41 | Liao et al 20201 |
Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | E24 | |
KAPA HiFi PCR kit | Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK1006 | |
L-arginine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #A8094 | |
laser | Agilent | 405 and 488 nm | |
L-histidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #H5659 | |
L-leucine | Sigma-Aldrich | #L8912 | |
L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #L8662 | |
L-methionine | Sigma-Aldrich | #M9625 | |
L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | #P5482 | |
L-tryptophan | Sigma-Aldrich | #T8941 | |
L-tyrosine | Sigma-Aldrich | #T8566 | |
mHyPer7 plasmid | This study | JYE116 | |
Microscope coverslips | ThermoScientific | 3406 | #1.5 (170 µm thickness) |
Microscope slides | ThermoScientific | 3050 | |
MitoTracker Red CM-H2Xros | ThermoFisherScientific | M7513 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
NEBuilder HiFi Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621 | |
Nikon Elements | Nikon | Microscope acquisition software | |
Nikon Ti Eclipse inverted microscope | Nikon | ||
Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate) | Sigma-Aldrich | Cat. #856177 | |
RStudio | Posit.co | Free desktop version | |
Spectrophotometer | Beckman | BU530 | |
Stagetop incubator | Tokai Hit | INU | |
Uracil | Sigma-Aldrich | #U1128 | |
Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids | BD Difco | #DF0919073 | |
YN2_1_LT58_X2site | Addgene | 177705 | Pianale et al 2021 |
Zyla 4.2 sCMOS camera | Andor |