Summary
Hidrojen peroksit (H2O2) hem oksidatif hasar kaynağı hem de bir sinyal molekülüdür. Bu protokol, canlı mayada genetik olarak kodlanmış bir oransal biyosensör olan mitokondri hedefli HyPer7 (mtHyPer7) kullanılarak mitokondriyalH2O2'ninnasıl ölçüleceğini açıklar. Ücretsiz olarak kullanılabilen yazılımı kullanarak görüntüleme koşullarının nasıl optimize edileceğini ve kantitatif hücresel ve hücre altı analizin nasıl gerçekleştirileceğini ayrıntılarıyla açıklar.
Abstract
Mitokondriyal disfonksiyon veya fonksiyonel değişiklik, nörodejeneratif ve kas-iskelet sistemi bozuklukları, kanser ve normal yaşlanma dahil olmak üzere birçok hastalık ve durumda bulunur. Burada, genetik olarak kodlanmış, minimal invaziv, oranlı bir biyosensör kullanarak hücresel ve hücre altı çözünürlüklerde canlı maya hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için bir yaklaşım açıklanmaktadır. Biyosensör, mitokondri hedefli HyPer7 (mtHyPer7), mitokondrideki hidrojen peroksiti (H2O2) tespit eder. Dairesel olarak permütasyonlu bir floresan proteine kaynaşmış bir mitokondriyal sinyal dizisinden ve bir bakteriyel OxyR proteininin H2O2-duyarlıalanından oluşur. Biyosensör, plazmid kaynaklı yapılara kıyasla daha tutarlı ekspresyon için CRISPR-Cas9 işaretleyicisiz bir sistem kullanılarak üretilir ve maya genomuna entegre edilir.
mtHyPer7 kantitatif olarak mitokondriyi hedef alır, maya büyüme hızı veya mitokondriyal morfoloji üzerinde saptanabilir bir etkisi yoktur ve normal büyüme koşulları altında ve oksidatif strese maruz kaldığında mitokondriyalH2O2için kantitatif bir okuma sağlar. Bu protokol, dönen diskli konfokal mikroskop sistemi kullanarak görüntüleme koşullarının nasıl optimize edileceğini ve ücretsiz olarak kullanılabilen yazılımı kullanarak kantitatif analizin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Bu araçlar, hem hücreler içinde hem de bir popülasyondaki hücreler arasında mitokondri hakkında zengin uzay-zamansal bilgi toplamayı mümkün kılar. Ayrıca, burada açıklanan iş akışı diğer biyosensörleri doğrulamak için kullanılabilir.
Introduction
Mitokondri, oksidatif fosforilasyon ve elektron taşınması yoluyla ATP üretme işlevleriyle iyi bilinen temel ökaryotik hücresel organellerdir1. Ek olarak, mitokondri kalsiyum depolama, lipitlerin, amino asitlerin, yağ asidi ve demir-kükürt kümelerinin sentezi ve sinyal iletimiiçin bölgelerdir 2,3. Hücreler içinde mitokondri, hücre tipine ve metabolik duruma göre değişen karakteristik morfoloji ve dağılıma sahip dinamik bir ağ oluşturur. Ayrıca, mitokondri kaynaşıp bölünebilse de, bir hücredeki tüm mitokondriler eşdeğer değildir. Çok sayıda çalışma, membran potansiyeli ve oksidatif durum 4,5,6 gibi özelliklerde tek tek hücreler içindeki mitokondrinin fonksiyonel heterojenliğini belgelemiştir. Mitokondriyal fonksiyondaki bu varyasyon, kısmen mtDNA mutasyonlarından (nükleer DNA'dan daha yüksek oranda meydana gelen) organele verilen hasardan ve organelin hem içinde hem de dışında üretilen reaktif oksijen türlerinin (ROS) oksidatif hasarından kaynaklanmaktadır 7,8,9. Organeldeki hasar, hasarı onaran veya onarımın ötesinde hasar görmüş mitokondriyi ortadan kaldıran mitokondriyal kalite kontrol mekanizmaları ile hafifletilir10.
Hidrojen peroksit (H2O2), hücresel proteinlere, nükleik asitlere ve lipitlere oksidatif hasar kaynağı olan reaktif bir oksijen türüdür. Bununla birlikte,H2O2ayrıca, hedef proteinlerde(11,12) tiyollerin tersinir oksidasyonu yoluyla hücresel aktiviteleri düzenleyen bir sinyal molekülü olarak da hizmet eder. H2O2, mitokondriyal elektron taşıma zincirinden sızan elektronlardan ve NADPH oksidaz ve monoamin oksidazlar 13,14,15,16,17,18,19,20 gibi spesifik enzimler tarafından üretilir. Ayrıca tioredoksin ve glutatyon21,22,23 bazlı olanlar da dahil olmak üzere antioksidan sistemler tarafından etkisiz hale getirilir. Bu nedenle, mitokondriyalH2O2seviyelerinin analizi, bu metabolitin normal mitokondriyal ve hücresel fonksiyonda ve oksidatif stres koşulları altındaki rolünü anlamak için kritik öneme sahiptir.
Bu protokolün genel amacı, organeli (mtHyPer7) hedef alan genetik olarak kodlanmış bir oransalH2O2biyosensörü olan HyPer7'yi kullanarak mitokondriyal H2O2'yitespit etmektir. mtHyPer7, ATP9'dan (Su9 ön dizisi) mitokondriyal sinyal dizisinden, dairesel olarak permütasyonlu bir yeşil floresan proteini (GFP) formundan ve Neisseria meningitidis24'ten OxyR proteinininH2O2-bağlanmaalanından oluşan bir kimeradır (Şekil 1). Dairesel olarak permütasyonlu GFP'de, doğal GFP'nin N- ve C-terminalleri kaynaştırılır ve kromoforun yakınında yeni terminaller oluşur, bu da proteine daha fazla hareketlilik ve doğal GFP25'e kıyasla spektral özelliklerinin daha fazla kararsızlığını verir. mtHyPer7'nin OxyR alanının H2O2 ile etkileşimi yüksek afiniteli,H2O2-seçicidirvekorunmuş sistein kalıntılarının geri dönüşümlü oksidasyonuna ve disülfür köprüsü oluşumuna yol açar. OxyR'nin oksidasyonu ile ilişkili konformasyonel değişiklikler, mtHyPer7'de dairesel olarak permütasyona uğramış GFP'ye aktarılır, bu da mtHyPer7 kromoforunun uyarma maksimumunda indirgenmiş durumda 405 nm'denH2O2-oksitlenmişdurumda 488 nm'ye spektral bir kayma ile sonuçlanır 26. Bu nedenle, 488 nm'ye karşı 405 nm'de uyarılmaya yanıt olarak mtHyPer7'den gelen floresan oranı, probunH2O2ile oksidasyonunu yansıtır.
İdeal olarak, bir biyosensör, hedef molekülünün gerçek zamanlı, mutlak, nicel bir okumasını sağlamalıdır. Ancak ne yazık ki, gerçek dünya ölçümlerinde bu her zaman mümkün değildir. mtHyPer7 gibi oksidasyon sensörleri söz konusu olduğunda, gerçek zamanlı okuma, disülfür köprüsünün indirgeme hızından etkilenir. ROS biyosensörleri tarafından kullanılan indirgeme sistemleri farklıdır ve bunlar, tioredoksin sistemi tarafından indirgenen HyPer7 ve glutatyon-maya sitozol27 tarafından indirgenen roGFP2-Tsa2ΔCR'nin karşılaştırılmasıyla gösterildiği gibi, prob yanıt dinamiklerini önemli ölçüde değiştirebilir. Bu nedenle, mtHyPer7 oranlarından bağılH2O2konsantrasyonu hakkında bir sonuç çıkarmak için, indirgeme sisteminin deney sırasında sabit bir kapasiteyi koruduğu varsayılmalıdır. Bu hususlara rağmen, HyPer7 ve ilgili problar, canlı hücrelerdeH2O2hakkında bilgi edinmek için çeşitli bağlamlarda kullanılmıştır 25,28,29.
Şekil 1:H2O2biyosensörü mtHyPer7'nin tasarımı, moleküler mekanizması ve uyarma/emisyon spektrumları. (A) mtHyPer7 probu, Neisseria meningitidis'ten OxyR-RD alanına dairesel olarak permütasyonlu GFP'nin eklenmesiyle elde edilir. Neurospora crassa'dan (Su9) ATP sentazın 9. alt biriminden mitokondriyal hedefleme dizisini içerir. (B) mtHyPer7'nin H2O2-algılama mekanizmasının gösterimi. RD alanındaki sisteinlerin oksidasyonu, 488 nm'de uyarma üzerine floresan emisyonunu arttırır ve 405 nm'de uyarma tarafından üretilen emisyonu azaltır. (C) HyPer7'nin oksitlenmiş ve indirgenmiş formlarda uyarma ve emisyon spektrumları. Bu rakam Pak ve ark.24'ün izniyle yeniden basılmıştır. Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan proteini; cpGFP = dairesel olarak permütasyonlu GFP. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
mtHyPer7'nin bu oransal görüntülemesi, mitokondriyalH2O2kantitasyonu 24,27; Prob konsantrasyonu için dahili bir kontrol sağlar. Ek olarak, H2O2 maruziyeti ile üretilen uyarma pikindeki kayma,H2O2'nindoymuş konsantrasyonlarında bile tamamlanmaz. Böylece, oran görüntüleme, analize iki spektral nokta ekleyerek hassasiyeti artırabilir.
Burada kullanılan mtHyPer7 probu,H2O2için çok yüksek bir afiniteye ve pH24'e nispeten düşük bir duyarlılığa sahiptir ve Caenorhabditis elegans mitokondri30'u başarıyla hedeflemiştir. Bu protein aynı zamanda mayadada kullanılmıştır 27,31. Bununla birlikte, önceki çalışmalar, prob ekspresyonunda hücreden hücreye değişkenlik ile sonuçlanan mtHyPer7'nin plazmit kaynaklı ekspresyonuna dayanıyordu27. Ek olarak, bu protokolde açıklanan yapı, işaretleyicisiz entegrasyon için CRISPR tabanlı bir yaklaşım kullanılarak X32 kromozomu üzerinde korunmuş, gensiz bir bölgeye entegre edildi. Entegre biyosensör geninin ekspresyonu da güçlü kurucu TEF1 promotörü tarafından kontrol edilir (Şekil 2). Sonuç olarak, maya hücresi popülasyonlarında, plazmid kaynaklı biyosensör ekspresyonu kullanılarak gözlemlenene kıyasla biyosensörün daha kararlı, tutarlı ekspresyonu vardır ve biyosensörü taşıyan hücreler, seçici ortama ihtiyaç duymadan çoğaltılabilir.
Şekil 2: CRISPR ile mtHyPer7 eksprese eden hücrelerin oluşturulması. Cas9 ve sgRNA içeren plazmit (YN2_1_LT58_X2site) ve PCR ile güçlendirilmiş mtHyPer7 içeren biyosensör yapısı, lityum asetat dönüşümü ile tomurcuklanan maya hücrelerine sokulur. X kromozomu (X2) üzerindeki gensiz insersiyon bölgesi, sgRNA ile Cas9 proteini tarafından tanınır ve kesilir ve biyosensör, homolog rekombinasyon ile genoma entegre edilir. Başarılı transformantların mikroskobik tarama, koloni PCR ve dizileme ile tanımlanmasından sonra, Cas9 plazmidi seçici olmayan ortamda büyüme ile çıkarılır (kürlenir). Kısaltmalar: sgRNA = tek kılavuz RNA; TEF = transkripsiyon arttırıcı faktör. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Son olarak, mtHyPer7 diğer ROS biyosensörlerine göre avantajlar sunar. Örneğin, ROS'u tespit etmek için kullanılan organik boyalar (örneğin, dihidroetidyum [DHE]2 ve MitoSOX3) düzensiz veya spesifik olmayan boyama üretebilir ve genellikle çözücü etkileri için ek kontroller gerektiren etanol veya dimetil sülfoksit gibi çözücüler içinde verilir. ROS biyosensörlerinin başka bir sınıfı, floresan rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı biyosensörlerdir (örneğin, hücresel redoks durumu4 için Redoksflor ve peroksit sensörleri HSP-FRET5, OxyFRET 6 ve PerFRET6). Bu problar genetik olarak kodlanmıştır ve prensipte oldukça hassastır ve iyi karakterize edilmiş mitokondriyal sinyal dizileri kullanılarak mitokondriye kantitatif olarak hedeflenebilir. Bununla birlikte, çapraz uyarma ve kanamadan kaynaklanan arka plan ve FRET'in meydana gelmesi için floroforların yakınlığı ve oryantasyonu için katı gereksinimler dahil olmak üzere FRET tabanlı probların kullanımında zorluklar vardır33,34. Ek olarak, FRET probları, spektrum değiştiren problara kıyasla ilgilenilen hücrelerde ekspresyon için daha büyük yapılar gerektiren iki floresan proteinden oluşur. Burada açıklanan protokol, HyPer7 tabanlı biyosensörün güçlü yönlerinden yararlanmak ve bu kompakt, oranlımetrik, yüksek afiniteli ve genetik olarak kodlanmış probu canlı mayadaki mitokondrideki peroksitin kantitatif görüntülemesi için kullanmak için geliştirilmiştir.
Protocol
1. Biyosensör plazmidinin üretilmesi, maya genomuna entegrasyon ve mtHyPer7'nin mitokondriye hedeflenmesinin değerlendirilmesi ve mitokondriyal morfoloji, hücresel büyüme oranları veya oksidatif stres duyarlılığı üzerindeki etkileri
NOT: Biyosensör yapımı ve karakterizasyonu için kullanılan biyosensör plazmit yapısı, suşlar, plazmitler ve primerler için sırasıyla Ek Dosya 1, Ek Tablo S1, Ek Tablo S2 ve Ek Tablo S3'e bakın. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
- Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yoluyla Y290 ve Y291 primerlerini (Şekil 2) kullanarak biyosensör yapısını biyosensör plazmidinden yükseltin.
- 500 ng Cas9/kılavuz RNA plazmidini (YN2_1_LT58_X2site32) adım 1.1'den (biyosensör yapısı) 50 μL PCR ürünü ile karıştırın. Lityum asetat yöntemini35 kullanarak karışımı tomurcuklanan mayaya dönüştürün ve 200 mg/mL G418 içeren YPD plakalarındaki dönüştürücüleri seçin.
- Y292 ve Y293 primerleri kullanılarak genomik DNA'nın PCR amplifikasyonu ile ekran adayı dönüştürücüler. Beklenen boyutta (pozitif: 3,5 kb; negatif: 0,3 kb) bir ek taşıyan dönüştürücüler için, daha fazla doğrulama için eklenen bölgeyi sıralayın.
- Biyosensörün büyüme ve mitokondriyal fonksiyon üzerindeki etkisini değerlendirin (Şekil 3). Biyosensör hücrelerin veya mitokondrinin işlevini etkiliyor gibi görünüyorsa, promotör, entegrasyon bölgesi veya ana suşu değiştirerek etkiyi en aza indirmeye çalışın.
- Daha önce açıklandığı gibi, oksidatif bir stres etkeninin (örneğin, paraquat) varlığında ve yokluğunda biyosensör yapısının büyüme hızı üzerindeki etkisini belirleyin36.
- Orta log faz hücrelerini, 96 oyuklu düz tabanlı bir plakanın her bir oyuğuna işlemli ve işlemsiz olarak 200 μL'lik karşılık gelen ortamda 0.0035'lik 600 nm optik yoğunluğa (OD 600) seyreltin. Bir plaka okuyucu kullanarak kültürün optik yoğunluğunu 72 saat boyunca her 20 dakikada bir ölçün. Maksimum büyüme oranını (eğim), 240 saatlik kurs boyunca 72 dakikalık bir aralıkta OD'deki maksimum değişim olarak hesaplayın.
- Hücreleri floresan mikroskobu ile görselleştirin ve daha önce açıklandığı gibi parlaklığı ve mitokondriyal morfolojiyi değerlendirin37.
- Hücreleri orta log fazına kadar büyütün, mitokondriyi 250 nM MitoTracker Red ile 30 dakika boyayın ve görüntülemeden önce iki kez yıkayın. Geniş alan veya konfokal floresan mikroskobunda 0,3 μm aralıklarla 6 μm derinlikteki Z yığınlarını yakalayın ve görsel olarak inceleyin. Uzun boru şeklindeki yapılar oluşturan mitokondriyi arayın.
- Daha önce açıklandığı gibi, oksidatif bir stres etkeninin (örneğin, paraquat) varlığında ve yokluğunda biyosensör yapısının büyüme hızı üzerindeki etkisini belirleyin36.
Şekil 3: mtHyPer7 mitokondriyi hedef alır ve mitokondriyal morfolojiyi, hücre büyümesini veya oksidatif strese duyarlılığı etkilemez. (A) mtHyPer7 eksprese eden canlı maya hücrelerinde mitokondriyal morfoloji. Sol panel: mtHyPer7, 488 nm uyarma ile görselleştirildi. Orta panel: 250 nM MitoTracker Red ile etiketlenmiş mitokondri. Sağ panel: birleştirilmiş görüntüler. Maksimum yoğunluktaki projeksiyonlar gösterilir. Hücre anahattı beyaz renkle gösterilir. Ölçek çubuğu = 1 μm. (B,C) YPD ortamında (+PQ) veya yokluğunda (+PQ) veya yokluğunda büyüyen mtHyPer7 eksprese eden vahşi tip hücrelerin ve hücrelerin büyüme eğrileri ve maksimum büyüme hızı. (D,E) SC ortamında (+PQ) veya 2.5 mM parakuat yokluğunda büyüyen vahşi tip ve mtHyPer7 eksprese eden hücrelerin büyüme eğrileri ve maksimum büyüme hızı. Tüm büyüme eğrileri, üç bağımsız kopyanın aracıdır. Maksimum büyüme oranları, ortalamanın (SEM) ortalama ± standart hatası olarak temsil edilir. Büyüme eğrisi analizi, orta log faz hücrelerinin,96 oyuklu düz tabanlı bir plakanın her bir oyuğuna 200 μL'lik karşılık gelen ortamda 0.0035'lik bir OD 600'e seyreltilmesiyle yapıldı. Kültürün OD'si, bir plaka okuyucu kullanılarak 72 saat boyunca her 20 dakikada bir ölçüldü. Her bir suş/koşul üç kopya halinde kaplandı ve ortalama büyüme hızı çizildi. Maksimum büyüme hızı (eğim), 72 saat boyunca 240 dakikalık bir aralıkta OD'deki değişiklikler kullanılarak hesaplandı. Kısaltmalar: WT = vahşi tip; PQ = parakuat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Hücre kültürü ve görüntüleme için hazırlık (Şekil 4)
- Görüntüleme için hücreleri sentetik ortamda orta log fazına çoğaltın. 5 mL'lik bir mid-log faz kültürü, dört veya beş slayt için yeterli hücre ve analiz için toplam >100 tomurcuklanmış hücre sağlar.
- Deneyden bir gün önceki sabah, 50 mL'lik konik tabanlı bir tüpte 5 mL sentetik tam (SC) ortamı tek bir maya hücresi kolonisi ile aşılayarak sıvı ön kültürler hazırlayın.
- Ön kültürü bir orbital çalkalayıcıda 200 rpm ve 30 °C'de 6-8 saat inkübe edin. Orta log fazında olması gereken ön kültürün OD 600'ünü ölçün: ~ 0.5-1 × 107 hücre / mL, OD600 ~ 0.1-0.3.
- Ertesi gün görüntüleme için ön kültürü kullanarak bir orta log faz kültürü hazırlayın. Gece boyunca büyümeden sonra (8-16 saat) bir orta log faz kültürü için gereken ön kültür miktarını hesaplayın. Hücreler SC ortamında büyütüldüğünde, iki katına çıkma süresi ~ 2 saattir. Bu nedenle, 5 mL'lik bir gece kültürünün aşılanması için ön kültürün hacmi (V) denklem (1) kullanılarak hesaplanır:
(1) - Adım 2.1.3'te hesaplanan ön kültür miktarı ile 50 mL konik tabanlı bir tüpe 5 mL SC ortamı aşılayın. 8-16 saat boyunca 200 rpm ve 30 °C'de bir orbital çalkalayıcıda büyütün.
- Görüntüleme gününde, adım 2.1.4'te oluşturulan kültürün orta log aşamasında (OD600 ~0.1-0.3) olduğunu onaylayın. Hücreleri, 30 saniye boyunca 6.000 × g'da santrifüjleme yoluyla 1 mL orta log faz kültüründen konsantre edin. Tüpte 10-20 μL süpernatan bırakarak süpernatanı çıkarın. Bir mikropipet kullanarak artık ortamla hafifçe karıştırarak hücre peletini yeniden süspanse edin.
- Bir cam mikroskop lamındaki tozu temizlemek için bir hava üfleyici veya tüy bırakmayan bir mendil kullanın ve slayta 1,8 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Hücreleri #1.5 (170 μm kalınlığında) cam lamel ile örtün, kabarcıkların girmesini önlemek için lameli bir açıyla yavaşça indirin.
- Hemen görüntüleyin ve 10 dakikalık görüntülemeden sonra slaydı atın.
(1)
Şekil 4: Hücre büyümesi ve görüntüleme. mtHyPer7 eksprese eden tomurcuklanan maya hücreleri, orta log fazına kadar büyütülür. Z serisi görüntüler, dönen disk konfokal mikroskobu ile toplanır ve daha sonra 3D rekonstrüksiyon ve analize tabi tutulur. Protokol bölüm 2-3'e bakın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. Görüntüleme koşullarının optimizasyonu ve görüntü toplama (Şekil 5)
- Bir görüntüleme modu seçin. Son işlem olmadan optik kesit alma için, dönen diskli konfokal bir cihaz tercih edilir. Bununla birlikte, sinyal düşükse veya bu cihaz kullanılamıyorsa, daha önce açıklandığı gibi, odak dışı bulanıklığı gidermek için geniş alan görüntülerinin dekonvolvasyonunun kaldırıldığından emin olmak için geniş alan görüntüleme kullanın38.
- Optik'i seçin. 100x/1,45 Plan-Apochromat gibi yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip yağa daldırma lensi kullanın.
- Uyarma ve emisyon dalga boylarını seçin. Dönen disk konfokal görüntüleme için 405 nm ve 488 nm'de bir lazer uyarımı ve standart bir GFP emisyon filtresi kullanın. Geniş alanlı görüntüleme için bir ışık yayan diyot (LED) veya lamba uyarımı kullanın, ancak filtre kurulumunun emisyonu standart GFP filtresinden geçirirken uyarımın değişmesine izin verdiğinden emin olun.
NOT: Bu, örneğin bir GFP küpünden uyarma filtresini çıkararak ve uyarımı seçmek için bir LED veya filtre tekerleği kullanarak gerçekleştirilebilir. - Pozlama süresini ve aydınlatma yoğunluğunu seçin.
- Her floresan kanalında kolayca algılanabilir bir sinyal ve kabul edilebilir çözünürlük sağlayan toplama koşulları oluşturun. Örneğin, sCMOS kameralı dönen diskli konfokal mikroskopta 2 x 2 gruplama, %20-40 lazer gücü ve 200-600 ms pozlama kullanın.
- Görüntü histogramını inceleyin. 12 bitlik bir görüntüde (4.096 olası gri düzeyi), piksel değerlerinin toplam dinamik aralığının doygunluk olmadan en az birkaç yüz gri düzeyi olduğundan emin olun (Şekil 5A). Ayrıca, aralığın gürültü seviyesinden bir kat daha yüksek olduğundan emin olun. Gürültü seviyesini, adım 4.1.3.1'de açıklandığı gibi ölçülen, görüntünün hücresiz bir alanındaki piksel değerlerinin standart sapması olarak hesaplayın.
- Seçilen görüntüleme koşulları altında foto ağartma veya görüntülemeye bağlı mitokondriyal stresi test edin. Aşırı foto ağartma veya mitokondriyalH2O2'debir artış gözlenirse, lazer gücünü azaltın ve maruziyeti veya gruplamayı artırın.
- Görüntüleme koşullarının mitokondrideki sinyal kararlılığı ve oksidatif stres üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, çekimler arasında gecikme olmadan, hızlandırılmış bir dizi görüntü toplayın. Mikroskop toplama yazılımını veya ImageJ'yi kullanarak, sinyal kararlılığını doğrulamak için her bir floresan kanalındaki ortalama piksel değerini ölçün (%<5 değişim; Şekil 5B). Deney hızlandırılmış görüntüleme içermiyorsa, floresansın iki veya üç tekrarlanan Z yığını (25-35 poz) üzerinde sabit olduğundan emin olun.
NOT: Her iki kanalın floresansındaki bir azalma foto ağartmayı gösterebilir; bununla birlikte, 488 nm uyarılmış kanalda bir artışla birlikte 405 nm uyarılmış floresanda bir azalma, organelde artmış mitokondriyalH2O2ve görüntüleme kaynaklı oksidatif stresi gösterebilir.
- Görüntüleme koşullarının mitokondrideki sinyal kararlılığı ve oksidatif stres üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, çekimler arasında gecikme olmadan, hızlandırılmış bir dizi görüntü toplayın. Mikroskop toplama yazılımını veya ImageJ'yi kullanarak, sinyal kararlılığını doğrulamak için her bir floresan kanalındaki ortalama piksel değerini ölçün (%<5 değişim; Şekil 5B). Deney hızlandırılmış görüntüleme içermiyorsa, floresansın iki veya üç tekrarlanan Z yığını (25-35 poz) üzerinde sabit olduğundan emin olun.
- Görüntüleri alın. Z yığınları topluyorsanız, Z aralığının veri kümesindeki tüm görüntüler için aynı olduğundan emin olun ve tüm hücreyi dahil edin. Tomurcuklanan maya için, Z aralığı 0,5 μm ve toplam yığın derinliği 6 μm olan görüntü. Hücre sınırlarını belgelemek için iletilen ışık görüntüleri elde edin.
- ImageJ39'un Fiji dağılımını ve R istatistiksel yazılımını kullanarak Ek Dosya 2'de ve https://github.com/theresaswayne/biosensor'de bulunan komut dosyaları aracılığıyla görüntüleri manuel veya yarı otomatik olarak analiz edin (Şekil 6). Yazılım talimatlarında, hiyerarşik menü komutları, bir dizi menü seçimini gösteren "|" ile kalın harflerle gösterilir. Seçenekler ve düğmeler kalın harflerle gösterilir.
Şekil 5: Görüntülemenin optimizasyonu . (A) Doğru yoğunluk aralığı için görüntülerin ve histogramların değerlendirilmesi. Dönen disk konfokal görüntülerinin maksimum yoğunluktaki projeksiyonları gösterilir. Histogramlar, görüntü dinamik aralığını göstermek için hem doğrusal Y ekseni (siyah) hem de log ölçekli Y ekseni (gri) ile gösterilir. Sol paneller: düşük yoğunluklu ve dinamik aralığa sahip gürültülü bir görüntü. Merkez paneller: kabul edilebilir bir dinamik aralığa (~1.000 gri seviye) ve yoğunluğa sahip bir görüntü. Sağ paneller: aşırı doygunluk oluşturmak için uygun olmayan şekilde kontrastı geliştirilmiş bir görüntü. Ölçek çubuğu = 1 μm. (B,C) mtHyPer7'nin fotoağartma analizi. Ardışık Z yığınları gecikmeden toplandı, Z yığınları toplandı ve mitokondrinin ortalama yoğunluğu ölçüldü ve ilk zaman noktasına normalleştirildi. İlk üç zaman noktasından (27 pozlama) elde edilen sonuçlar gösterilir. (B) Uyarma dalga boyu: 405 nm. (C) Uyarma dalga boyu: 488 nm. Gösterilen değerler, üç bağımsız denemenin her birinden üç hücrenin ortalamalarıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. Komut dosyalarıyla yarı otomatik analiz
- Bir biyosensör analiz komut dosyası (örneğin, biosensor.ijm veya biosensor-image-subtraction.ijm) kullanarak oran görüntüleri oluşturun ve ölçün.
- Kullanılacak komut dosyasını seçin. Her komut dosyasını kullanma protokolü benzerdir; Herhangi bir farklılık metinde belirtilecektir.
- biosensor.ijm: Bu komut dosyasında, arka plan ve parazit, kullanıcı tarafından seçilen görüntü alanları, sabit değerler kullanılarak veya çıkarma yapılmadan düzeltilir. Arka plan ve gürültü düzeltme yöntemlerini bağımsız olarak seçin.
- biosensor-image-subtraction.ijm: Bu komut dosyasında, arka plan ve parazitin her ikisi de kullanıcı tarafından seçilen aynı yöntemle işlenir ve bu yöntem şunlardan biri olabilir: boş görüntü, görüntü içinde kullanıcı tarafından seçilen alan, sabit değer veya düzeltme yok.
- Fiji'de, adım 3.5'te alınan çok kanallı bir Z yığını görüntüsünü açın. İstediğiniz biyosensör analizi komut dosyasını açın. Komut Dosyası Düzenleyicisi penceresinde Çalıştır'ı tıklatarak komut dosyasını çalıştırın. Görüntülenen iletişim penceresinde, istenen bilgileri girin.
- Oran hesaplaması için pay ve paydanın kanal numaralarını seçin. mtHyPer7 için pay, 488 nm'de uyarılan kanaldır ve payda, 405 nm'de uyarılan kanaldır. Varsa, iletilen ışık görüntüsünün kanal numarasını veya yoksa 0'ı seçin.
- Aşağıdaki dört seçenek arasından istediğiniz arka plan çıkarma yöntemini seçin. Arka plan görece tekdüzeyse, görüntüdeki arka plan düzeyini doğrudan ölçen bir görüntü alanı seçin'i seçin. Arka plan alan genelinde önemli ölçüde farklılık gösteriyorsa, biosensor-image-subtraction.ijm komut dosyasını kullanın ve Boş görüntü'yü seçin (düzeltme için boş bir görüntü toplamak için, hücresiz bir görüş alanında veya hücresiz büyüme ortamıyla yapılmış bir slayttan aynı alım koşullarına sahip çok kanallı bir Z yığını yakalayın). Sabit değer , önceden ölçülen bir arka plan değerinin girilmesine izin verir. Hiçbiri arka planı düzeltmeden bırakmaz, ancak ölçümün hassasiyetini azaltabilir.
- İstediğiniz gürültü çıkarma yöntemini seçin. Gürültü değeri, dedektör okumasındaki rastgele varyasyonun etkisini azaltmak için arka plan çıkarılmış, maskelenmiş kanal görüntülerinde daha düşük bir eşik olarak kullanılır. Önceden ölçülmüş bir gürültü seviyesinin girilmesine izin vermek için Bir görüntü alanı seçin veya Sabit değer'i seçin, bu genellikle görüntüleme koşulları sabit tutulursa gürültü seviyeleri sabit olduğu için iyi çalışır. Alternatif olarak, Yok'u seçin ve alt eşik olarak 1 değerini kullanın, bu da ölçümlerin değişkenliğini artırabilir.
- Mitokondriyi doğru ve tutarlı bir şekilde tespit etmek için bir eşik algoritması seçin; Otsu veya MaxEntropy önerilir. İdeal olarak, bir deneydeki tüm görüntüler için aynı algoritmayı kullanın, ancak mitokondrinin doğru bir şekilde tanınmasını sağlayın. Bir deney sırasında morfolojide değişiklikler varsa farklı bir eşikleme yöntemi kullanın.
- Hücre başına ilgilenilen bölge (ROI) sayısını seçin. Örneğin, anne-tomurcuk farklılıklarını ölçüyorsanız 2'yi seçin.
- Ölçümlerin ve oran görüntülerinin kaydedileceği çıktı klasörünü seçin.
- Arka plan ve gürültü düzeltme istemlerini izleyin.
- Alan seçimi (varsa): Arka plan veya parazit ölçümü için bir görüntü alanı seç seçildiyse, dikdörtgen ROI aracını kullanarak bir arka plan alanı (herhangi bir hücrenin veya floresan artefaktın dışında) çizmek için istemleri izleyin. Alanı çizdikten sonra Tamam'a tıklayın.
- Sabit değer girişi (varsa): Arka plan veya gürültü ölçümü için Sabit değer seçildiyse, her floresan kanalı için arka plan ve/veya gürültü değerlerini girmek için istemleri izleyin.
- Boş referans görüntü (varsa): biosensor-image-subtraction.ijm komut dosyasında, arka plan veya parazit düzeltme için Boş görüntü seçilmişse, boş bir görüntü dosyası seçmek için istemleri izleyin.
- Ölçüm için yatırım getirilerini işaretleyin. Orta log faz kültürlerinde, analizi tomurcuklanmış hücrelerle sınırlayın.
- Parlak alan görüntüsüne dayalı olarak tek tek hücrelere veya hücre altı bölgelere karşılık gelen ROI'ler çizin. ROI'nin hücre taslağıyla tam olarak eşleşmesi gerekmez, çünkü ROI içindeki yalnızca eşikli mitokondri ölçülecektir. Alternatif olarak, önceden kaydedilmiş bir ROI kümesini açın: ROI Yöneticisi'nde Diğer'i tıklayın, sonra ROI dosyasını seçin.
- Seçilen ROI'yi ROI Manager'a eklemek için her ROI'yi oluşturduktan sonra T tuşuna basın. ROI Yöneticisi'nde, işaretlenen hücreleri belgelemek için Tümünü Göster'i işaretleyin. Eklenen her bölge, ROI Yöneticisi listesinde numaralandırılmış bir öğe olarak görünecektir. Hücre başına birden fazla ROI analiz ediyorsanız (örneğin, anne ve tomurcuk), analiz edilen her hücre için ROI'leri aynı sırayla işaretleyin.
- İstenen tüm ROI'ler ROI Yöneticisi'ne eklendikten sonra, Hücreleri işaretle iletişim penceresinde Tamam'ı tıklatın.
- Ölçüm tablosu formatını seçin. Görüntülenen MultiMeasure iletişim penceresinde Measure all slices (Tüm dilimleri ölç) seçeneğini işaretleyin. İstenen formatta bir tablo oluşturmak için Dilim başına bir satır seçeneğini işaretleyin. process_multiROI_tables kullanın. Dilim başına bir satır seçeneğiyle oluşturulan tabloları işlemek için R betiği; Sonuçları Ekle'yi işaretlemeyin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın (pay [488], payda [405] ve oran [488/405] görüntülerinin ölçümü için).
- Betik, çıktı dosyalarını adım 4.1.2.6'da seçilen klasöre kaydeder.
- Kullanılacak komut dosyasını seçin. Her komut dosyasını kullanma protokolü benzerdir; Herhangi bir farklılık metinde belirtilecektir.
- Her bölge veya hücre için ağırlıklı ortalama oranların hesaplanması
- Önceki adımda elde edilen sonuçları kullanarak, denklemi (2) kullanarak her bölge veya hücre için ağırlıklı ortalama oranları hesaplayın. "Piksel bazında" veya "bölgesel olarak" oranları hesaplayın (ayrıntılar için tartışmaya bakın).
(2)
NOT: Alan ve entegre yoğunluk (IntDen) değerleri yalnızca eşikli mitokondri içindeki pikselleri içerir. Bu hesaplama process_multiROI_tables kullanılarak otomatikleştirilebilir. R komut dosyası ve R istatistik yazılımı.
- Önceki adımda elde edilen sonuçları kullanarak, denklemi (2) kullanarak her bölge veya hücre için ağırlıklı ortalama oranları hesaplayın. "Piksel bazında" veya "bölgesel olarak" oranları hesaplayın (ayrıntılar için tartışmaya bakın).
- Renklendirilmiş oranlı bir görüntü oluşturun. Renk tonundaki (renk) değişiklikler insan gözü için yoğunluktaki değişikliklerden daha belirgin olduğundan, daha kolay görsel yorumlama için oran değerini bir renk skalasına dönüştürün. colorize_ratio_image.ijm komut dosyası, maskelenmiş oranlı bir görüntüyü renklendirir.
- Fiji'de, adım 4.1.6'da oluşturulan bir oran Z yığını görüntüsünü açın. colorize_ratio_image.ijm komut dosyasını açın. Komut Dosyası Düzenleyicisi penceresinde Çalıştır'ı tıklatarak komut dosyasını çalıştırın. Görüntülenen iletişim penceresinde, istenen bilgileri girin.
- Renklendirme yöntemi: Modüle Edilmemiş seçeneğinde, tüm mitokondriyal pikseller aynı parlaklıkta görünür. Ancak, hem loş hem de parlak pikseller oran görüntüsüne katkıda bulunduğundan bazı görüntüler gürültülü görünebilir. Bu etkiyi azaltmak için, Yoğunluk modülasyonlu seçeneğini kullanın.
- Minimum ve maksimum görüntülenen değer: Bu değerler, renklendirilecek oran değerlerinin aralığını kontrol eder. Bir denemede gözlemlenen ortalama minimum ve maksimum değerlere yakın değerleri seçin (adım 4.2.1'de hesaplanan ağırlıklı ortalama oranlarına göre). Bir deneyde, aynı görüntüleme koşullarına sahip tüm görüntüleri aldığınızdan ve tüm görüntüleri aynı minimum ve maksimum değerlerle görüntülediğinizden emin olun.
- Projeksiyon modu: Z yığınları, tüm mitokondriyal popülasyonu göstermek için projeksiyonlar olarak görüntülenir. Projeksiyon renklendirmeden önce oluşturulur. Maksimum yoğunluk projeksiyonu için Maks'ı (maksimum oran ve yoğunluk değerlerini koruyarak) veya ortalama yoğunluk projeksiyonu için Ortalama'yı seçin.
- Çıktı klasörü: Renklendirilmiş görüntülerin kaydedileceği klasörü seçin.
- Modüle edilmemiş seçeneği belirlenmişse, bir renk şeması seçin (arama tablosu; LUT) görüntülenen iletişim penceresinde. Fiji'de yerleşik olarak bulunan Fire veya Rainbow RGB LUT'ları veya ImageJ'nin .lut formatında istediğiniz herhangi bir LUT'u kullanın (LUT dosyasından içe aktar). Rainbow Smooth40 LUT önerilir (Ek Dosya 2'de ve GitHub'da bulunur).
- Betik, çıktı dosyalarını adım 4.3.1.4'te seçilen klasöre kaydeder. Bunlar, renklendirilmiş oran görüntüsünü (Color_RGB.tif) ve oran değerleri ile görüntü rengi (Color_with_bar.tif) arasındaki uygunluğu gösteren bir kalibrasyon çubuğuna sahip renklendirilmiş oran görüntüsünü içerir.
- Fiji'de, adım 4.1.6'da oluşturulan bir oran Z yığını görüntüsünü açın. colorize_ratio_image.ijm komut dosyasını açın. Komut Dosyası Düzenleyicisi penceresinde Çalıştır'ı tıklatarak komut dosyasını çalıştırın. Görüntülenen iletişim penceresinde, istenen bilgileri girin.
(2)5. Manuel analiz
NOT: Bu yaklaşım daha fazla zaman alır ancak ön işleme ve eşik değerin ayarlanmasında esneklik sağlar.
- Arka plan için doğru.
- Fiji'de seçenekleri ayarlayın.
- Analiz Et'e tıklayın | Ölçümleri ayarlayın. Görüntülenen iletişim penceresinde Area, Mean, StdDev, IntDen ve Display Label kutularını işaretleyin. Ondalık basamakları 3 olarak ayarlayın.
- Düzenle | Seçenekler | Giriş/Çıkış. Görüntülenen iletişim penceresinde, Satır numaralarını kaydet ve Sütun başlıklarını kaydet kutularını işaretleyin.
- Oran hesaplamasının hassasiyetini artırmak için, her floresan kanalından arka planı çıkarın. Arka plan nispeten tekdüzeyse, bir görüntüdeki hücresiz bir alanın ortalama yoğunluğunu ölçün ve bu değeri tüm görüntüden çıkarın (adım 5.1.2.1). Alternatif olarak, arka plan alan genelinde önemli ölçüde farklılık gösteriyorsa, düzeltme için boş bir görüntü kullanın (adım 5.1.2.2.).
- Kullanıcı tarafından seçilen bir bölgeyi çıkarmak için Görüntü | Renk | Kanalları bölün ve daha sonra ihtiyaç duyulacağı için tüm kanal görüntülerini açık tutun. Her floresan kanalı için arka planda (herhangi bir hücrenin dışında) bir yatırım getirisi çizin ve Analiz Et | Ölçün veya yığınlar için Görüntü | Yığınlar | Yığını Ölçün. Sonuçlar tablosunda görünen yatırım getirisinin ortalama değerini gözlemleyin . Düzenle | Yok'u ve ardından İşle | Matematik | Çıkarmak. Görüntülenen iletişim penceresinde, en yakın tamsayıya yuvarlanmış ölçülen ortalama arka plan değerini girin.
NOT: Yuvarlama, daha sonra ikili işlemlerle ilgili hataları önler. - Bir veri dosyasından boş bir görüntü çıkarmak için, tamamen hücresiz bir görüş alanından veya hücresiz büyüme ortamı ile hazırlanmış bir slayttan boş bir görüntü toplayın. İşlem | Görüntü Hesaplayıcı. Görüntülenen iletişim penceresinde, işlemi Çıkar olarak ayarlayın ve Resim1 ve Resim2'yi sırasıyla hücre görüntüsüne ve boş görüntüye ayarlayın. Yeni Pencere Oluştur ve 32 bit Sonuç Oluştur'u işaretleyin.
- Kullanıcı tarafından seçilen bir bölgeyi çıkarmak için Görüntü | Renk | Kanalları bölün ve daha sonra ihtiyaç duyulacağı için tüm kanal görüntülerini açık tutun. Her floresan kanalı için arka planda (herhangi bir hücrenin dışında) bir yatırım getirisi çizin ve Analiz Et | Ölçün veya yığınlar için Görüntü | Yığınlar | Yığını Ölçün. Sonuçlar tablosunda görünen yatırım getirisinin ortalama değerini gözlemleyin . Düzenle | Yok'u ve ardından İşle | Matematik | Çıkarmak. Görüntülenen iletişim penceresinde, en yakın tamsayıya yuvarlanmış ölçülen ortalama arka plan değerini girin.
- Fiji'de seçenekleri ayarlayın.
- Analizi mitokondri ile sınırlamak için segmentasyon yapın. Her kanal, biyosensörün durumuna bağlı olarak yoğunluğu değiştirebileceğinden, mitokondri alanını tutarlı bir şekilde tanımlamak için iki kanalın toplamını kullanın.
- Bir toplam görüntü oluşturmak için İşlem | Görüntü Hesaplayıcı. Görüntülenen iletişim penceresinde, işlemi Ekle olarak ayarlayın ve Görüntü1 ve Görüntü2'yi herhangi bir sırayla arka plan çıkarılmış iki floresan kanalına ayarlayın. Yeni Pencere ve 32 bit Sonuç Oluştur'u işaretleyin ve bir toplam görüntünün görünmesini bekleyin.
- Toplam görüntüde mitokondriyi tanımlamak için eşiği ayarlayın.
- Resmin üzerine tıklayın | Ayarla | Eşik. Görüntülenen Threshold (Eşik) penceresinde Dark Background (Koyu Arka Plan) ve Stack Histogram (Yığın Histogramı) seçeneklerini işaretleyin. Yöntemi istediğiniz algoritmaya ayarlayın (örneğin, Otsu veya MaxEntropy). Tekrarlanabilirlik için otomatik eşikleme kullanın, ancak otomatik bir yöntem uygun değilse, eşiği manuel olarak ayarlayın.
NOT: İdeal olarak, bir deneydeki tüm görüntüler için aynı algoritma kullanılmalıdır, ancak bir deney sırasında morfolojideki değişiklikler bazı koşullarda farklı bir eşikleme yöntemi gerektirebilir. - Eşik tatmin edici olduğunda, Uygula'yı tıklayın. Görüntülenen iletişim penceresinde Maskeye Dönüştür'ü seçin. Görüntülenen iletişim penceresinde Siyah arka plan'ı işaretleyin ve diğer kutuları işaretlemeden bırakın. Segmentasyon doğruluğunun değerlendirilmesi için ortaya çıkan maske görüntüsünü kaydedin.
- Resmin üzerine tıklayın | Ayarla | Eşik. Görüntülenen Threshold (Eşik) penceresinde Dark Background (Koyu Arka Plan) ve Stack Histogram (Yığın Histogramı) seçeneklerini işaretleyin. Yöntemi istediğiniz algoritmaya ayarlayın (örneğin, Otsu veya MaxEntropy). Tekrarlanabilirlik için otomatik eşikleme kullanın, ancak otomatik bir yöntem uygun değilse, eşiği manuel olarak ayarlayın.
- Maske değerlerini 0 ve 255'ten sırasıyla 0 ve 1'e dönüştürün. Matematik | Bölmek. Değeri 255 olarak ayarlayın ve istendiğinde tüm görüntüleri işleme seçeneğini belirleyin.
- Maskeyi arka plandan çıkarılan floresan kanallarına tıklayarak uygulayın İşlem | Görüntü Hesaplayıcı. Görüntülenen iletişim penceresinde, işlemi Çarp olarak ayarlayın. Image1 ve Image2'yi sırasıyla pay kanalına ve maskeye ayarlayın. Yeni Pencere Oluştur'u ve 32 bit Sonucu kontrol edin; Maske çarpımını payda kanalıyla tekrarlayın.
- Arka plan piksellerini NaN ("sayı değil") olarak ayarlayarak her maskelenmiş kanalı oran hesaplaması için hazırlayın.
- Maskeli pay kanalını seçin ve Resim | Ayarla | Eşik. Eşik penceresinde Ayarla'yı tıklatın ve görüntülenen iletişim penceresinde minimum gürültü düzeyini hesaplanan gürültü düzeyine veya 1 olarak ayarlayın ve maksimum değeri olduğu gibi bırakın.
- Threshold ( Eşik ) penceresinde Apply (Uygula) seçeneğini tıklayın. Sonraki iletişim kutusunda, NaN olarak ayarla'yı seçin. Maskelenmiş payda kanalı için tekrarlayın.
- Oran görüntüsünü oluşturun.
- İşlem | Görüntü Hesaplayıcı. Görüntülenen iletişim penceresinde, işlemi Böl olarak ayarlayın. Image1 ve Image2'yi sırasıyla arka plan çıkarılmış maskelenmiş pay ve payda kanallarına ayarlayın. mtHyPer7 için pay, 488 nm'de uyarılmış oksitlenmiş formdur ve payda, 405 nm'de uyarılmış indirgenmiş formdur. Bu nedenle, daha yüksek oranlar daha yüksekH2O2'yigösterir.
- Yeni Pencere Oluştur ve 32 bit Sonuç Oluştur'u işaretleyin. Analiz için oran görüntüsünü kaydedin.
- İlgi alanlarını işaretleyin ve ölçün. Her hücre veya alt hücre bölgesi seçilir ve ROI Yöneticisi'nde ROI olarak depolanır. ROI'lerin hücre ana hatlarıyla mükemmel bir şekilde eşleşmesi gerekmez, çünkü yalnızca maskelenmiş mitokondri bölgeleri ölçülecektir.
- Yanlılığı önlemek için iletilen ışık görüntüsünü kullanarak, tek tek hücrelere (veya hücre altı bölgelere) karşılık gelen ROI'ler oluşturun. Orta log faz kültürlerinde, analizi, hücre bölünmesinde aktif olarak yer alan tomurcukları taşıyan maya hücreleriyle sınırlayın. Her ROI'yi oluşturduktan sonra ROI Manager'a eklemek için T tuşuna basın. İşaretlenen hücreleri belgelemek için Tümünü Göster'i işaretleyin.
- Yukarıda oluşturulan oran resmine tıklayın ve ROI Yöneticisi'nde Diğer ... | Çoklu Ölçüm. Görüntülenen iletişim penceresinde Tüm dilimleri ölç'ü işaretleyin. Sonuçları Ekle'yi işaretlemeyin. İstenen formatta bir tablo oluşturmak için Dilim başına bir satır seçeneğini işaretleyin. process_multiROI_tables. R betiği, R istatistik yazılımında Dilim başına bir satır seçeneğiyle oluşturulan tabloları işler.
- Sonuçları kaydedin. Sonuçlar penceresine ve ardından Dosya | Kaydedin ve sonuç tablosunu .csv veya .xls biçiminde kaydedin. Dosya adını görüntü adıyla eşleşecek şekilde ayarlayın.
- Yatırım getirilerini kaydedin. ROI Yöneticisi'nde, önce hiçbir ROI'nin seçili olmadığından emin olun: Seçimi Kaldır'a ve ardından Daha Fazla | Kaydet'i tıklayın. Ölçümlere görüntüyle çapraz referans vermek için kaydedilen ROI'leri orijinal görüntüyle birlikte Fiji'de açın.
- Önceki adımda ve denklemde (3) elde edilen sonuçları kullanarak hücre veya bölge başına ağırlıklı ortalama oranları hesaplayın. "Piksel bazında" veya "bölgesel olarak" oranları hesaplayın (ayrıntılar için tartışmaya bakın).
(3)
NOT: Alan ve entegre yoğunluk değerleri yalnızca eşikli mitokondri içindeki pikselleri içerir. Bu hesaplama process_multiROI_tables kullanılarak otomatikleştirilebilir. R istatistik yazılımında R betiği. - Renklendirilmiş oranlı bir görüntü oluşturun.
NOT: Renklendirilmiş görüntüler, tüm mitokondriyal piksellerin aynı parlaklıkta göründüğü modüle edilmemiş veya renklendirilmiş görüntüdeki yoğunlukları ayarlamak için orijinal görüntüdeki piksel yoğunluğunun kullanıldığı yoğunluk modülasyonlu olabilir.- Modüle edilmemiş renklendirilmiş bir görüntü oluşturmak için:
- Yukarıda oluşturulan oran görüntüsünü açın. Resmin üzerine tıklayın | Görüntünün bir kopyasını oluşturmak için Çoğalt'ı seçin, ardından orijinal görüntüyü kapatın.
- Görüntü bir Z yığınıysa, tek bir dilim seçin veya tüm mitokondriyi görüntülemek için bir Z projeksiyonu oluşturun. Maksimum yoğunluk (her XY piksel koordinatında maksimum oran ve yoğunluk değerlerini koruyarak) veya ortalama yoğunluk projeksiyonu kullanın.
- Resmin üzerine tıklayın | Tabloları arayın ve LUT'yi istediğiniz renk şemasına ayarlayın (örneğin, Gökkuşağı RGB veya Ateş [ImageJ'de varsayılan olarak mevcuttur]). Alternatif olarak, Dosya | LUT'u içe aktarın ve ImageJ'nin .lut biçiminde istediğiniz herhangi bir LUT'u seçin, örneğin Rainbow Smooth40 (Ek Dosya 2'de ve GitHub'da bulunur). LUT'nin 0 değerine atanmış koyu bir renge sahip olduğundan emin olun.
- Görüntü | Ayarla | Parlaklık/Kontrast. Brightness (Parlaklık/Kontrast) penceresinde Set (Ayarla) seçeneğini tıklatın ve görüntülenen iletişim penceresinde, Minimum ve Maksimum görüntülenen değerler için istediğiniz değerleri girin. Gözlemlenen renk farklılıklarını en üst düzeye çıkarmak için, bunları tüm görüntülerde elde edilen yaklaşık minimum ve maksimum değere ayarlayın. Bir denemedeki tüm görüntüleri aynı kontrast düzeylerine ayarlayın.
NOT: Uygula'ya tıklamayın, çünkü bu piksel değerlerini değiştirecek ve bir sonraki adımda doğru bir kalibrasyon çubuğunun oluşturulmasını önleyecektir. - Analiz Et | Araçlar | Kalibrasyon çubuğu. Görüntülenen iletişim penceresinde, isterseniz Görüntü | Kaplama | Kaplamayı Kaldır'ı tıklayın.
- İsterseniz, Analiz | Araçlar | Ölçek Çubuğu. Görüntülenen iletişim penceresinde, çubuk için istediğiniz boyutu, konumu ve rengi ayarlayın. Kullanılan LUT'tan bağımsız olarak çubuğun rengini korumak için Kaplama seçeneğini işaretleyin.
- Resme tıklayarak yayın için bir RGB görüntüsü oluşturun | Kaplama | Düzleştirmek. Ortaya çıkan görüntüyü kaydedin.
NOT: Bu resim yalnızca sunum veya yayın amaçlıdır. Yoğunluk değerleri değiştirilir, bu nedenle ölçülemez. Çubuklar da görüntü üzerinde kalıcı olarak yakılır.
- Yoğunluk ayarlı bir görüntü oluşturmak için:
- Resmin üzerine tıklayın | Görüntünün bir kopyasını oluşturmak için Çoğalt'ı seçin, ardından orijinali kapatın.
- Görüntü bir Z yığınıysa, tüm mitokondrileri görüntülemek için tek bir dilim seçin veya bir Z projeksiyonu oluşturun.
- Resme tıklayarak oran görüntüsünün ekran kontrastını ayarlayın | Ayarla | Parlaklık/Kontrast ve Parlaklık/Kontrast penceresinde Ayarla'yı tıklatın. Görüntülenen iletişim penceresinde, görüntülenen Minimum ve Maksimum değerler için istediğiniz değerleri girin. Gözlemlenen renk farklılıklarını en üst düzeye çıkarmak için, bunları tüm görüntülerde elde edilen yaklaşık minimum ve maksimum değerlere ayarlayın ve bir denemedeki tüm görüntüleri aynı kontrast düzeylerine ayarlayın. Piksel değerlerini yeniden ölçeklendirmek için Uygula'ya tıklayın.
- Bir kalibrasyon çubuğu oluşturmak için bu geliştirilmiş görüntüyü çoğaltın ve Analiz | Araçlar | Kalibrasyon Çubuğu. Görüntüyü ve kaplamayı üzerine tıklayarak RGB formatına dönüştürün Görüntü | Kaplama | Düzleştirmek. İstenirse, bu çubuğu sunum veya yayın için adım 5.6.2.12'de elde edilen yoğunluk modülasyonlu RGB görüntüsüne yapıştırın.
- Dosya | Yeni | Resim.... Açılan iletişim penceresinde parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: Tip: RGB; Şununla doldurun: Siyah; Genişlik ve Yükseklik: 9görüntünün genişliği ve yüksekliği); Dilimler: 1.
- Görüntü | Türü | HSB Yığını.
- Düzenle | Tümünü ve ardından Düzenle | Kopyala'yı tıklayın. Ardından, HSB yığınına tıklayın, ilk dilimi (Ton) seçin ve Düzenle | Oran değerlerini aktarmak için yapıştırın.
- HSB yığınının 2. dilimini (Doygunluk) seçin. Düzenle | Seçenekler | Renkler. Düzenle | Tümünü ve ardından Düzenle | Doldurun ve açılan iletişim penceresinde yalnızca geçerli dilimi beyazla doldurmak için Hayır'ı seçin.
- Ham veri görüntüsünü açın ve Görüntü | Renk | Bölünmüş Kanallar.
- Görüntü Hesaplayıcı'yı kullanarak ve İşlem | Görüntü Hesaplayıcı. Görüntülenen iletişim penceresinde, işlemi Ortalama olarak ayarlayın ve Görüntü1 ve Görüntü2'yi sırasıyla pay ve payda görüntülerine ayarlayın. Create New Window'u (Yeni Pencere Oluştur) işaretleyin.
- Düzenle | Tümünü ve ardından Düzenle | Kopyala'yı tıklayın. Ardından, HSB yığınına tıklayın, üçüncü dilimi (Değer) seçin ve Düzenle | Yoğunluk değerlerini aktarmak için yapıştırın.
- Üzerine tıklayarak HSB yığınını RGB renk alanına dönüştürün Görüntü | Türü | RGB Rengi. Ortaya çıkan görüntüyü kaydedin.
- Modüle edilmemiş renklendirilmiş bir görüntü oluşturmak için:
(3)
Şekil 6: Görüntü analizi ve sunumunun şeması. Dönen disk konfokal görüntüleri önce arka plan çıkarılır. Mitokondriler eşiklenerek bölümlere ayrılır ve her dilim için maskelere dönüştürülür. Bu maskeler her iki kanala da uygulanır ve maskelenmiş görüntüler oran görüntüsünü hesaplamak için kullanılır. ROI'ler, hücrelerdeki veya hücre altı bölgelerdeki mtHyPer7 oranını ölçmek için çizilir. Veri sunumu için renklendirilmiş oran görüntüleri de oluşturulabilir. Ölçek çubuğu = 1 μm. Kısaltma: ROI = ilgi alanı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Representative Results
mtHyPer7'nin mitokondriyal H2O2'yi değerlendirmek için uygun birprob olduğunu doğrulamak için, mtHyPer7'nin lokalizasyonu ve maya mitokondri ve hücre sağlığı üzerindeki etkisi değerlendirildi. mtHyPer7'nin hedeflenmesini değerlendirmek için mitokondri, mtHyPer7'yi eksprese eden kontrol maya hücreleri ve mayada hayati mitokondriye özgü MitoTracker Red boyası ile boyandı. MitoTracker Kırmızı boyama kullanılarak, mitokondri, ana-tomurcuk ekseni boyunca hizalanan ve tomurcuğun ucunda ve tomurcuğun distalindeki ana hücrenin ucunda biriken uzun tübüler yapılar olarak çözüldü41. Mitokondriyal morfoloji, kontrol ve mtHyPer7 eksprese eden hücrelerde benzerdi. Ek olarak, mtHyPer7, MitoTracker Kırmızı lekeli mitokondri ile birlikte lokalize edildi (Şekil 3A). Bu nedenle, mtHyPer7, normal mitokondriyal morfolojiyi veya dağılımı etkilemeden mitokondriye verimli ve kantitatif olarak hedeflendi.
Daha sonra, mtHyPer7'nin mitokondride hücresel uygunluk ve oksidatif strese duyarlılık üzerindeki etkisini değerlendirmek için ek doğrulama deneyleri yapıldı. Zengin veya sentetik glikoz bazlı ortamlarda (sırasıyla YPD veya SC) mtHyPer7 eksprese eden hücrelerin büyüme oranları, dönüştürülmemiş vahşi tip hücrelerinkine benzerdir (Şekil 3B, D). Mitokondride oksidatif stres üzerindeki olası etkileri değerlendirmek için, kontrol ve mtHyPer7 eksprese eden maya, mitokondride biriken ve organelde yüksek süperoksit seviyelerine neden olan redoks aktif küçük bir molekül olan düşük seviyelerde parakuat ile muamele edildi24,27. mtHyPer7 ekspresyonu mitokondride oksidatif strese neden oluyorsa veya mitokondriyi oksidatif stresten koruyorsa, mtHyPer7 eksprese eden hücreler sırasıyla parakuat tedavisine karşı artmış veya azalmış bir duyarlılık göstermelidir. Düşük parakuat seviyeleri ile tedavi, maya büyüme oranlarında bir azalmaya neden oldu. Ayrıca, parakuat varlığında vahşi tip ve mtHyPer7 eksprese eden hücrelerin büyüme oranları benzerdi (Şekil 3C, E). Bu nedenle, biyosensörün ekspresyonu, tomurcuklanan maya hücrelerinde önemli hücresel stresler yaratmadı veya mayanın mitokondriyal oksidatif strese duyarlılığını değiştirmedi.
MtHyPer7'nin tomurcuklanan mayada mitokondriyal H2O2'yi incelemek için uygun olduğuna dair kanıtlar göz önüne alındığında, mtHyPer7'nin orta log faz yabani tip mayada mitokondriyal H2O2'yi ve dışarıdan eklenenH2O2'nin neden olduğu mitokondriyal H2O2'dekideğişiklikleri tespit edip edemediği test edildi. BirH2O2titrasyon deneyi yapıldı ve mitokondride ortalama oksitlenmiş: indirgenmiş (O / R) mtHyPer7 oranı ölçüldü.
Otomatik analiz komut dosyaları birkaç çıktı dosyası üretti.
Oran görüntüsü (ratio.tif): Arka plan düzeltilmiş, eşikli 488 nm ve 405 nm yığınlarının oranından oluşan bir Z yığını. Bu yığın ek işlem yapılmadan Fiji'de görüntülenebilir; Ancak, görüntülemeden önce Protokol Adımı 4.3 veya 5.6'da açıklandığı gibi kontrastın artırılması ve/veya görüntünün renklendirilmesi önerilir.
Maske görüntüsü (maske.tif): Analiz için kullanılan eşikli mitokondriyal alanlardan oluşan bir Z yığını. Bu görüntü, eşiğin doğruluğunu değerlendirmek için kullanılmalıdır.
Analiz için kullanılan ROI'ler (ROI'ler.zip): Bu dosya Fiji'de kaynak görüntüyle birlikte açıldığında, sonuç tablosuna ve kaynak görüntüye çapraz referans vermek için YG'ler görüntünün üzerine bindirilir. Her ROI, bir hücre numarası ve ROI numarası ile yeniden adlandırılır.
Pay, payda ve oran görüntülerindeki her dilim için sırasıyla eşikli mitokondrinin alanını, ortalamasını ve entegre yoğunluğunu içeren ölçüm tabloları (NumResults.csv, DenomResults.csv, Results.csv). Mitokondrinin olmadığı veya odak dışı olduğu dilimlerde NaN kaydedilir.
Arka plan ve gürültü düzeltme, eşikleme ve oran hesaplaması için kullanılan seçenekleri belgeleyen bir günlük dosyası (Log.txt).
mtHyPer7'nin O / R oranı,H2O2konsantrasyonuna doza bağlı bir yanıt gösterdi ve bu, harici olarak eklenenH2O2'de 1-2 mM'de bir platoya ulaştı (Şekil 7). Şaşırtıcı bir şekilde, HyPer7 oranı, 0.1 mM H2O2'ye maruz kalan hücrelerdekontrol hücrelerine göre daha düşüktü, ancak bu fark istatistiksel olarak anlamlı değildi. Bu fenomenin bir açıklaması, düşük düzeyde bir stres etkenine maruz kalmanın, antioksidan mekanizmalar gibi stres tepkilerini indükleyebileceği ve bunun da prob tarafından tespit edilebilen ROS miktarını azaltabileceği bir hormesis tepkisi olabilir. Buna karşılık, daha yüksek stres seviyeleri iç stres tepkilerini bastırabilir ve HyPer7'den daha yüksek bir okuma ile sonuçlanabilir.
Şekil 7: mtHyPer7'nin harici olarak eklenen H2O2'ye tepkisi. (A) Farklı H2O2 konsantrasyonlarına maruz kalan orta log faz hücrelerinde 405 nm ve 488 nm uyarılmış görüntülerin maksimum projeksiyonu ve mtHyPer7'nin oransal görüntülerinin ortalama yoğunluk projeksiyonu. Sözde renk, oksitlenmiş: azaltılmış mtHyPer7 oranını gösterir (alttaki ölçek). Ölçek çubuğu = 1 μm. Hücre anahattı beyaz olarak gösterilir; n > koşul başına 100 hücre. (B) Oksitlenmiş mtHyPer7'nin miktar tayini: farklı konsantrasyonlardaH2O2ile muamele edilmiş tomurcuklanan maya hücrelerinde azaltılmış oran. Beş bağımsız denemenin araçları, her deneme için farklı şekil ve renkli sembollerle gösterilmiştir. Oksitlenmiş oranının ortalama ± SEM'si: indirgenmiş mtHyPer7: 1.794 ± 0.07627 (tedavi yok), 1.357 ± 0.03295 (0.1 mM), 2.571 ± 0.3186 (0.5 mM), 6.693 ± 0.5194 (1 mM), 7.017 ± 0.1197 (2 mM). p < 0.0001 (Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA). p değerleri şu şekilde gösterilir: ****p < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Son olarak, önceki çalışmalar, daha indirgenmiş ve daha az süperoksit içeren daha uygun mitokondrinin tercihen maya yavru hücreleri4 tarafından kalıtıldığını ve sitozolik katalazların maya yavru hücrelerine42,43,44,45 taşındığını ve aktive edildiğini ortaya koymuştur. Bu çalışmalar, maya hücresi bölünmesi sırasında mitokondrinin asimetrik kalıtımını ve bu sürecin yavru hücre zindeliği ve yaşam süresinin yanı sıra anne-kız yaş asimetrisindeki rolünü belgelemektedir. Anneler ve tomurcuklar arasındaH2O2'dekifarklılıkların olup olmadığını test etmek için, tomurcuklarda ve ana hücrelerde mtHyPer7 ölçüldü. Maya hücrelerinde mitokondriyal H2O2'de farklılıklar gözlendi ve tomurcuktaki mitokondride ana hücredekilere kıyaslaH2O2biyosensör okumasında ince ama istatistiksel olarak anlamlı bir azalma tespit edildi (Şekil 8). Bu bulgular, tomurcuktaki mitokondrinin oksidatif stresten daha iyi korunduğuna dair önceki bulgularla tutarlıdır. Ayrıca, mtHyPer7'nin tomurcuklanan mayada hücresel ve hücre altı çözünürlüğe sahip mitokondriyalH2O2için kantitatif bir okuma sağlayabileceğine dair belgeler sağlarlar.
Şekil 8: Yavru hücrede mitokondriyalH2O2seviyesi daha düşüktür. (A) Temsili bir hücrede mtHyPer7'nin oransal görüntüsünün maksimum izdüşümü. Sözde renk, oksitlenmiş: azaltılmış mtHyPer7 oranını gösterir (alttaki ölçek). Orandaki hücre altı farklılıklar belirgindir (ok uçları). Ölçek çubuğu = 1 μm. Hücre anahattı: beyaz. (B) Tomurcuk ve ana hücredeki mtHyPer7 oranı arasındaki fark. Her bir hücre için, ana oran değeri tomurcuk oranı değerinden çıkarıldı ve bir nokta olarak çizildi. n = Beş bağımsız deneyden toplanan 193 hücre, her deney için farklı renkli sembollerle gösterilir. Tomurcuk ve ana hücrelerdeki mtHyPer7 oranı arasındaki farkın ortalama ± SEM'i: -0.04297 ± 0.01266. p = 0.0008 (eşleştirilmiş t-testi) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo S1: Bu çalışmada kullanılan suşlar. Kullanılan maya suşlarının listesi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo S2: Bu çalışmada kullanılan plazmitler. Kullanılan plazmitlerin listesi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo S3: Bu çalışmada kullanılan primerler. Kullanılan primerlerin listesi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Biyosensör plazmit yapımı için protokol. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 2: Otomatik analiz için komut dosyaları. Her komut dosyası için örnek girdi dosyaları ve çıktı dosyaları sağlanır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu protokolde, canlı tomurcuklanan maya hücrelerinde mitokondriyalH2O2'yideğerlendirmek için mtHyPer7'yi bir biyosensör olarak kullanmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Biyosensör, CRISPR tabanlı bir yöntem kullanılarak oluşturulur ve seçilebilir belirteçler kullanılmadan maya genomunda korunmuş gen içermeyen bir bölgeye sokulur. Plazmid kaynaklı biyosensörlerle karşılaştırıldığında, entegre olanlar tüm hücrelerde ve tutarlı seviyelerde eksprese edilir ve daha güvenilir miktar tayini sonuçları sağlar. mtHyPer7 eksprese eden hücreler oluşturmak için seçilebilir belirteçler kullanılmaz, bu da daha geniş bir suş arka planı yelpazesinin kullanılmasına izin verir ve biyosensör eksprese eden hücrelerin genetik modifikasyonunu kolaylaştırır. mtHyPer7 proteini, mitokondriyal morfoloji, fonksiyon, dağılım veya hücresel büyüme oranları üzerinde gözle görülür bir etki olmaksızın mitokondriye doğru bir şekilde hedeflenir. mtHyPer7, harici olarak eklenen H2O2'ye dozabağlı bir yanıt gösterir. Ayrıca, mtHyPer7, hücre altı çözünürlük ile mitokondriyal kalitenin heterojenliği hakkında rapor verebilir. Son olarak, mitokondriyal hedefli biyosensörleri görüntülemek için geniş alan mikroskobunun aksine dönen diskli konfokal mikroskop kullanmak, floroforlarda daha az fotoağartmaya neden olur ve hücre altı farklılıkları analiz etmek için yüksek çözünürlüklü görüntüler üretir.
Sınırlılıklar ve alternatif yaklaşımlar
Bu yöntem, hücrelerin lamel altında kuruyacağından, hücreleri 10 dakikadan fazla görüntülemek için uygun değildir. Daha uzun süreli görüntüleme için, agar pedi yöntemini46 kullanmak veya hücreleri SC besiyeri ile doldurulmuş cam tabanlı bir kültür kabında hareketsiz hale getirmek daha iyidir.
Biyosensör seçimi, deneysel koşullar altında hedefin konsantrasyonu tarafından yönlendirilmelidir. HyPer7'nin hassasiyeti çok yüksekse, HyPer3 veya HyPerRed47,48 gibi farklı bir HyPer sürümü önerilir. Bununla birlikte, diğer HyPer problarının pH'a daha duyarlı olduğuna dikkat edilmelidir. Daha yüksek hassasiyet için peroksiredoksin bazlı roGFP daha uygun olabilir (roGFP2Tsa2ΔCR)27.
H2O2 sensörünün oksidasyon kararlı durumu hem oksidasyon hem de indirgeme oranlarına bağlıdır. Biyosensörlerin oksidasyon hızı esas olarakH2O2'denkaynaklanır, ancak indirgeme oranı hücre ve organelde aktif olan antioksidan indirgeme sistemlerine bağlıdır. HyPer7'nin maya sitozolündeki tioredoksin sistemi tarafından ağırlıklı olarak indirgendiği ve indirgenmesinin roGFP2Tsa2ΔCR27'den daha hızlı olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle,H2O2biyosensörlerin ölçümlerini yorumlarken probun farklı indirgeme mekanizmaları ve tepki dinamikleri dikkate alınmalıdır. Özellikle, biyosensör okumasındanH2O2seviyelerini çıkarmak için, indirgeme sisteminin deney sırasında sabit bir kapasiteyi koruduğu varsayılmalıdır. Burada açıklanan komut dosyalarına alternatif olarak, redoks sensörlerinin49 analizi için çeşitli başka yazılımlar ücretsiz olarak kullanıma sunulmuştur.
Kritik adımlar
Herhangi bir biyosensörde, biyosensörün kendisinin ölçülen süreci etkilemediğini göstermek çok önemlidir. Bu nedenle, her deneysel koşul altında suşların büyüme ve mitokondriyal morfolojisinin karşılaştırılması önemlidir. Burada mitokondriyal morfoloji, mitokondriyi membran potansiyeline bağlı bir şekilde boyayan MitoTracker Red kullanılarak değerlendirilir. Bununla birlikte, dönüştürülmemiş ve biyosensöre dönüştürülmüş hücrelerdeki mitokondrinin karşılaştırılması, alternatif bir membran potansiyeli algılayıcı mitokondriyal hayati boya olan tetrametilrodamin metil ester (TMRM) veya membran potansiyelinden bağımsız olarak mitokondriyi boyayan MitoTracker Green ile boyanarak gerçekleştirilebilir. Zararlı etkilerden şüpheleniliyorsa, ifade düzeyini azaltmak veya entegrasyon sitesini değiştirmek yardımcı olabilir.
Probun doz-yanıt davranışını ve görüntüleme tekniğinin sinyal-gürültü oranını doğrulamak da sağlam sonuçlar elde etmek için gereklidir. Bir grup içindeki değişkenlik, gruplar arasındaki değişkenliği aşarsa, farklılıkların tespit edilmesi zorlaşır. Grup içi değişkenlik, gerçek popülasyon varyasyonundan veya algılama sürecindeki gürültüden kaynaklanabilir. Sinyal:gürültü oranını artırmanın temel adımları, görüntü elde etme (piksel değeri aralığı ve gürültü), arka plan çıkarma ve eşiklemedir.
Hesaplama adımları sırasında gürültü efektleri de azaltılabilir. En basit yaklaşım, her pikselin uyarma verimlilikleri arasındaki yerel oranı temsil ettiği oran görüntü ölçümlerinden (Sonuçlar.csv) ağırlıklı ortalama yoğunluğu hesaplamaktır. Bu, "piksel düzeyinde" bir oran üretir. Bununla birlikte, görüntü sinyali:gürültü oranı düşükse, hem pay hem de payda kanallarında bir ROI için ağırlıklı ortalama yoğunluğun hesaplanması ve ardından bu iki ağırlıklı ortalama arasındaki oranın ("bölgesel bazda" oran) hesaplanmasıyla daha sağlam sonuçlar elde edilebilir.
Bir eşik yöntemi seçmek için, Fiji komutu Image | Ayarla | Otomatik Eşik , tüm yerleşik Fiji yöntemlerini otomatik olarak denemek için kullanılabilir. Segmentasyonu (eşikleme) değerlendirmek için, kaydedilmiş bir maske Düzenle | Seçim | Seçim Oluştur, ROI Yöneticisi'ne eklenir ( T tuşuna basarak) ve ardından ham görüntü dosyasında etkinleştirilir. Mitokondri yeterince tespit edilemezse farklı bir segmentasyon yöntemi denenmelidir.
Görüntüleri karşılaştırırken, aynı görüntüleme koşullarına sahip tüm görüntüleri elde etmek ve tüm görüntüleri aynı kontrast geliştirmesiyle görüntülemek önemlidir.
Görüntüleme koşullarını optimize ederken mitokondriyal hareket dikkate alınmalıdır. Mitokondri 405 ve 488 nm'de uyarılma arasında önemli ölçüde hareket ederse, oran görüntüsü doğru olmayacaktır. Pozlama süresinin <500 ms tutulması ve uyarmanın mevcut en hızlı yöntemle (örn. bir tetik darbesi veya akusto-optik ayarlanabilir filtre) değiştirilmesi önerilir. Bir Z yığınını yakalarken, bir sonraki Z adımına geçmeden önce her Z adımı için her iki uyarma işlemi de gerçekleştirilmelidir.
Sonuçların görüntülenmesi için, renk tonundaki (renk) değişiklikler, yoğunluktaki değişikliklerden daha belirgindir. Bu nedenle, oran değeri daha kolay görsel yorumlama için bir renk skalasına dönüştürülür. Renklendirilmiş görüntüler, tüm mitokondriyal piksellerin aynı parlaklıkta göründüğü modüle edilmemiş veya renklendirilmiş görüntüdeki yoğunlukları ayarlamak için orijinal görüntüdeki piksel yoğunluğunun kullanıldığı yoğunluk modülasyonlu olabilir.
Değişiklik ve sorun giderme
Paraquat ile meydan okuyarak mitokondriyal fonksiyonun doğrulanmasına alternatif olarak, hücreler fermente edilebilir ve fermente edilemeyen karbon kaynaklarına çoğaltılabilir veya aşılanabilir.
Arka planda çıkarma, yuvarlanan top çıkarma için ( İşlem | Arka Planı Çıkar...) aydınlatma düzensizliğini gidermek için de kullanılabilir. Hücrelerin varlığının çıkarılan arka planı değiştirmediğinden emin olunmalıdır ( Arka Plan Oluştur seçeneğini işaretleyerek ve sonucu inceleyerek).
Özetle, mtHyPer7 probu, canlı hücrelerde maya mitokondrisinin morfolojik ve fonksiyonel durumunu ilişkilendirmek için tutarlı, minimal invaziv bir yöntem sağlar ve genetik olarak izlenebilir, kolay erişilebilir bir model sistemde önemli bir hücresel stres etkeni ve sinyal molekülünün incelenmesine izin verir.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar, uzman teknik yardım için Katherine Filpo Lopez'e teşekkür eder. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (NIH) (GM122589 ve AG051047) LP'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.
Bu çalışmalar, kısmen NIH / NCI Kanser Merkezi Destek Hibe P30CA013696 tarafından finanse edilen Columbia Üniversitesi'ndeki Herbert Irving Kapsamlı Kanser Merkezi'nin Konfokal ve Özel Mikroskopi Ortak Kaynağını kullandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens | Nikon | MRD01905 | |
| Adenine sulfate | Sigma-Aldrich | A9126 | |
| Bacto Agar | BD Difco | DF0145170 | |
| Bacto Peptone | BD Difco | DF0118170 | |
| Bacto Tryptone | BD Difco | DF211705 | |
| Bacto Yeast Extract | BD Difco | DF0127179 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | |
| Carbenicilin | Sigma-Aldrich | C1389 | |
| Carl Zeiss Immersol Immersion Oil | Carl Zeiss | 444960 | |
| Dextrose (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| E. cloni 10G chemical competent cell | Bioserch Technologies | 60108 | |
| FIJI | NIH | Schindelin et al 2012 | |
| G418 (Geneticin) | Sigma-Aldrich | A1720 | |
| GFP emission filter | Chroma | 525/50 | |
| Gibson assembly | New England Biolabs | E2611 | |
| Graphpad Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| H2O2 (stable) | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO | Pon Lab | JYE057/EP41 | Liao et al 20201 |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | E24 | |
| KAPA HiFi PCR kit | Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK1006 | |
| L-arginine hydrochloride | Sigma-Aldrich | A8094 | |
| laser | Agilent | 405 and 488 nm | |
| L-histidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H5659 | |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8912 | |
| L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | L8662 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5482 | |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T8941 | |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T8566 | |
| mHyPer7 plasmid | This study | JYE116 | |
| Microscope coverslips | ThermoScientific | 3406 | #1.5 (170 µm thickness) |
| Microscope slides | ThermoScientific | 3050 | |
| MitoTracker Red CM-H2Xros | ThermoFisherScientific | M7513 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NEBuilder HiFi Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621 | |
| Nikon Elements | Nikon | Microscope acquisition software | |
| Nikon Ti Eclipse inverted microscope | Nikon | ||
| Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate) | Sigma-Aldrich | Cat. 856177 | |
| RStudio | Posit.co | Free desktop version | |
| Spectrophotometer | Beckman | BU530 | |
| Stagetop incubator | Tokai Hit | INU | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U1128 | |
| Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids | BD Difco | DF0919073 | |
| YN2_1_LT58_X2site | Addgene | 177705 | Pianale et al 2021 |
| Zyla 4.2 sCMOS camera | Andor |
References
- vander Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G.
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: more than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
- Shi, R., Hou, W., Wang, Z. -Q., Xu, X. Biogenesis of iron-sulfur clusters and their role in DNA metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 735678 (2021).
- McFaline-Figueroa, J. R., et al. Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast. Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).
- Higuchi-Sanabria, R., et al. Mitochondrial anchorage and fusion contribute to mitochondrial inheritance and quality control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 27 (5), 776-787 (2016).
- Higuchi-Sanabria, R., et al. Role of asymmetric cell division in lifespan control in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 14 (8), 1133-1146 (2014).
- Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells. Free Radical Biology & Medicine. 50 (8), 963-970 (2011).
- Laun, P., et al. Aged mother cells of Saccharomyces cerevisiae show markers of oxidative stress and apoptosis. Molecular Microbiology. 39 (5), 1166-1173 (2001).
- Doudican, N. A., Song, B., Shadel, G. S., Doetsch, P. W. Oxidative DNA damage causes mitochondrial genomic instability in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 25 (12), 5196-5204 (2005).
- Roca-Portoles, A., Tait, S. W. G. Mitochondrial quality control: from molecule to organelle. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (8), 3853-3866 (2021).
- Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P.
- Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
- Imlay, J. A., Fridovich, I. Assay of metabolic superoxide production in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (11), 6957-6965 (1991).
- Fridovich, I. Mitochondria: are they the seat of senescence. Aging Cell. 3 (1), 13-16 (2004).
- Quinlan, C. L., Perevoshchikova, I. V., Hey-Mogensen, M., Orr, A. L., Brand, M. D. Sites of reactive oxygen species generation by mitochondria oxidizing different substrates. Redox Biology. 1 (1), 304-312 (2013).
- Griendling, K. K., Minieri, C. A., Ollerenshaw, J. D., Alexander, R. W. Angiotensin II stimulates NADH and NADPH oxidase activity in cultured vascular smooth muscle cells. Circulation Research. 74 (6), 1141-1148 (1994).
- Griendling, K. K., Sorescu, D., Ushio-Fukai, M. NAD(P)H oxidase: role in cardiovascular biology and disease. Circulation Research. 86 (5), 494-501 (2000).
- Edmondson, D. E., Binda, C., Wang, J., Upadhyay, A. K., Mattevi, A. Molecular and mechanistic properties of the membrane-bound mitochondrial monoamine oxidases. Biochemistry. 48 (20), 4220-4230 (2009).
- Ramsay, R. R., Singer, T. P. The kinetic mechanisms of monoamine oxidases A and B. Biochemical Society Transactions. 19 (1), 219-223 (1991).
- Ramsay, R. R. Kinetic mechanism of monoamine oxidase A. Biochemistry. 30 (18), 4624-4629 (1991).
- Handy, D. E., Loscalzo, J.
- Wood, Z. A., Schröder, E., Robin Harris, J., Poole, L. B. Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins. Trends in Biochemical Sciences. 28 (1), 32-40 (2003).
- Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
- Pak, V. V., et al. Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function. Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).
- Topell, S., Hennecke, J., Glockshuber, R. Circularly permuted variants of the green fluorescent protein. FEBS Letters. 457 (2), 283-289 (1999).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Methods. 3 (4), 281-286 (2006).
- Kritsiligkou, P., Shen, T. K., Dick, T. P. A comparison of Prx- and OxyR-based H2O2 probes expressed in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100866 (2021).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11241-11246 (1999).
- Abedi, M. R., Caponigro, G., Kamb, A. Green fluorescent protein as a scaffold for intracellular presentation of peptides. Nucleic Acids Research. 26 (2), 623-630 (1998).
- Onukwufor, J. O., et al. A reversible mitochondrial complex I thiol switch mediates hypoxic avoidance behavior in C. elegans. Nature Communications. 13 (1), 2403 (2022).
- Vega, M., et al. Antagonistic effects of mitochondrial matrix and intermembrane space proteases on yeast aging. BMC Biology. 20 (1), 160 (2022).
- Torello Pianale, L., Rugbjerg, P., Olsson, L. Real-time monitoring of the yeast intracellular state during bioprocesses with a toolbox of biosensors. Frontiers in Microbiology. 12, 802169 (2022).
- Imani, M., Mohajeri, N., Rastegar, M., Zarghami, N. Recent advances in FRET-based biosensors for biomedical applications. Analytical Biochemistry. 630, 114323 (2021).
- Zadran, S., et al. Fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensors: visualizing cellular dynamics and bioenergetics. Applied Microbiology and Biotechnology. 96 (4), 895-902 (2012).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
- Liao, P. -C., Wolken, D. M. A., Serrano, E., Srivastava, P., Pon, L. A. Mitochondria-associated degradation pathway (MAD) function beyond the outer membrane. Cell Reports. 32 (2), 107902 (2020).
- Higuchi-Sanabria, R., Swayne, T. C., Boldogh, I. R., Pon, L. A. Live-cell imaging of mitochondria and the actin cytoskeleton in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1365, 25-62 (2016).
- Liao, P. -C., Yang, E. J., Pon, L. A. Live-cell imaging of mitochondrial redox state in yeast cells. STAR Protocols. 1 (3), 100160 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Collins, T. J.
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with MitoTracker dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 990-992 (2011).
- Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nyström, T. Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis. Science. 299 (5613), 1751-1753 (2003).
- Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nyström, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants can be suppressed by overproducing the protein aggregation-remodeling factor Hsp104p. Genes & Development. 21 (19), 2410-2421 (2007).
- Erjavec, N., Cvijovic, M., Klipp, E., Nyström, T. Selective benefits of damage partitioning in unicellular systems and its effects on aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (48), 18764-18769 (2008).
- Erjavec, N., Nyström, T. Sir2p-dependent protein segregation gives rise to a superior reactive oxygen species management in the progeny of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (26), 10877-10881 (2007).
- Davidson, R., Liu, Y., Gerien, K. S., Wu, J. Q. Real-time visualization and quantification of contractile ring proteins in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1369, 9-23 (2016).
- Bilan, D. S., et al. HyPer-3: a genetically encoded H2O2 probe with improved performance for ratiometric and fluorescence lifetime imaging. ACS Chemical Biology. 8 (3), 535-542 (2013).
- Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5 (1), 5222 (2014).
- Fricker, M. D.
- Yang, E. J., Pernice, W. M., Pon, L. A. A role for cell polarity in lifespan and mitochondrial quality control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. iSCIENCE. 25 (3), 103957 (2022).
