Summary
过氧化氢 （H 2O2） 既是氧化损伤的来源，也是信号分子。该协议描述了如何使用线粒体靶向HyPer7（mtHyPer7），一种遗传编码的比率生物传感器，在活酵母中测量线粒体H 2 O2。它详细介绍了如何使用免费软件优化成像条件并执行定量细胞和亚细胞分析。
Abstract
线粒体功能障碍或功能改变存在于许多疾病和病症中，包括神经退行性疾病和肌肉骨骼疾病、癌症和正常衰老。在这里，描述了一种使用基因编码的微创比例生物传感器以细胞和亚细胞分辨率评估活酵母细胞中线粒体功能的方法。生物传感器，线粒体靶向HyPer7（mtHyPer7），检测线粒体中的过氧化氢（H 2O2）。它由融合到环状置换荧光蛋白的线粒体信号序列和细菌 OxyR 蛋白的 H 2 O2 响应结构域组成。该生物传感器使用无 CRISPR-Cas9 标记系统生成并整合到酵母基因组中，与质粒携带的构建体相比，表达更加一致。
mtHyPer7 定量靶向线粒体，对酵母生长速率或线粒体形态没有可检测的影响，并在正常生长条件下和暴露于氧化应激时提供线粒体 H 2 O2 的定量读数。该协议解释了如何使用转盘共聚焦显微镜系统优化成像条件，并使用免费提供的软件进行定量分析。这些工具可以收集细胞内和细胞群中细胞间线粒体的丰富时空信息。此外，这里描述的工作流程可用于验证其他生物传感器。
Introduction
线粒体是必不可少的真核细胞器，以其通过氧化磷酸化和电子传递产生 ATP 的功能而闻名1。此外，线粒体是钙储存、脂质、氨基酸、脂肪酸和铁硫簇的合成以及信号转导的场所 2,3。在细胞内，线粒体形成一个具有特征形态和分布的动态网络，该网络根据细胞类型和代谢状态而变化。此外，尽管线粒体可以融合和分裂，但并非细胞中的所有线粒体都是等效的。大量研究记录了单个细胞内线粒体在膜电位和氧化态等属性方面的功能异质性 4,5,6。线粒体功能的这种变化部分是由于 mtDNA 突变对细胞器的损害（其发生率高于核 DNA）以及细胞器内外产生的活性氧 （ROS） 的氧化损伤 7,8,9。线粒体质量控制机制可修复损伤或消除损伤无法修复的线粒体，从而减轻对细胞器的损伤10。
过氧化氢 （H 2O2） 是一种活性氧，是细胞蛋白质、核酸和脂质氧化损伤的来源。然而，H2 O2 也是一种信号分子，通过靶蛋白中硫醇的可逆氧化来调节细胞活性11,12。H2 O2 由从线粒体电子传递链泄漏的电子和特定酶产生，例如 NADPH 氧化酶和单胺氧化酶 13、14、15、16、17、18、19、20。它还被抗氧化系统灭活，包括基于硫氧还蛋白和谷胱甘肽21、22、23 的抗氧化系统。因此，线粒体 H 2 O2水平的分析对于了解该代谢物在线粒体和细胞正常功能以及氧化应激条件下的作用至关重要。
该协议的总体目标是使用靶向细胞器（mtHyPer7）的遗传编码比率H 2 O 2生物传感器HyPer7检测线粒体H2O2。mtHyPer7 是一种嵌合体，由来自 ATP9 的线粒体信号序列（Su9 前序列）、绿色荧光蛋白 （GFP） 的环状置换形式和来自脑膜炎奈瑟菌24 的 OxyR 蛋白的 H 2 O2结合域组成（图 1）。在圆形置换 GFP 中，天然 GFP 的 N 端和 C 端融合，并在发色团附近形成新的末端，与天然 GFP25 相比，这赋予蛋白质更大的迁移率和更大的光谱特性的不稳定性。mtHyPer7 的 OxyR 结构域与 H 2 O 2 的相互作用是高亲和力的，H 2 O 2选择性，并导致保守的半胱氨酸残基的可逆氧化和二硫键的形成。与 OxyR 氧化相关的构象变化转移到 mtHyPer7 中的圆形置换 GFP，这导致 mtHyPer7 发色团的最大激发波长从还原态的 405 nm 到 H 2 O2-氧化态的 488 nm26。因此，mtHyPer7 响应 488 nm 与 405 nm 激发的荧光比反映了探针被 H 2 O2氧化。
理想情况下，生物传感器应提供其目标分子的实时、绝对、定量读数。然而，不幸的是，这在实际测量中并不总是可行的。对于氧化传感器，如mtHyPer7，实时读数受二硫键还原速率的影响。ROS生物传感器使用的还原系统不同，它们可以显着改变探针响应动态 - 如被硫氧还蛋白系统还原的HyPer7和被酵母胞质溶胶中的谷胱甘肽还原的roGFP2-Tsa2ΔCR的比较所示27。因此，要从 mtHyPer7 比率得出关于相对 H 2 O2浓度的结论，必须假设还原系统在实验过程中保持恒定的容量。尽管有这些考虑，HyPer7 和相关探针已在各种情况下用于获取有关活细胞中 H 2 O2 的信息25,28,29。
图 1：H 2 O2生物传感器 mtHyPer7 的设计、分子机制和激发/发射光谱。 （A） mtHyPer7 探针是通过将环状置换的 GFP 插入脑膜炎奈瑟菌的 OxyR-RD 结构域而获得的。它包含来自 Neurospora crassa （Su9） 的 ATP 合酶亚基 9 的线粒体靶向序列。 （B） mtHyPer7 的 H 2 O2 感应机制图示。RD结构域中半胱氨酸的氧化增加了488 nm激发时的荧光发射，并减少了405 nm激发产生的发射。（C） HyPer7氧化和还原形式的激发和发射光谱。本图经 Pak et al.24 许可转载。缩写：GFP=绿色荧光蛋白;cpGFP = 循环置换 GFP。请点击这里查看此图的较大版本.
mtHyPer7 的这种比例成像为线粒体 H 2 O2 定量提供了重要益处24,27;它为探针浓度提供内部控制。此外，即使在H 2 O2的饱和浓度下，H 2 O2暴露产生的激发峰的偏移也不完全。因此，比率成像可以通过在分析中加入两个光谱点来提高灵敏度。
这里使用的mtHyPer7探针对H 2 O2具有非常高的亲和力，对pH24的敏感性相对较低，并已成功靶向秀丽隐杆线虫线粒体30。这种蛋白质也已用于酵母27,31。然而，以前的研究依赖于 mtHyPer7 的质粒表达，这导致探针表达的细胞间变异性27。此外，使用基于CRISPR的无标记整合方法将该协议中描述的构建体整合到X32染色体上保守的无基因区域中。整合的生物传感器基因的表达也受强组成型TEF1启动子的控制（图2）。因此，与使用质粒携带的生物传感器表达观察到的生物传感器在酵母细胞群中的表达更稳定、更一致，并且携带生物传感器的细胞可以在不需要选择性培养基的情况下繁殖。
图 2：通过 CRISPR 生成表达 mtHyPer7 的细胞。 通过醋酸锂转化将含有 Cas9 和 sgRNA 的质粒 （YN2_1_LT58_X2site） 和 PCR 扩增的含有 mtHyPer7 的生物传感器构建体引入出芽酵母细胞中。X染色体（X2）上的无基因插入位点被Cas9蛋白与sgRNA识别切割，生物传感器通过同源重组整合到基因组中。在通过显微镜筛选、菌落PCR和测序鉴定成功的转化体后，通过在非选择性培养基中生长去除（固化）Cas9质粒。缩写：sgRNA = 单向导 RNA;TEF = 转录增强因子。 请点击这里查看此图的较大版本.
最后，mtHyPer7 与其他 ROS 生物传感器相比具有优势。例如，用于检测 ROS 的有机染料（例如二氢乙锭 [DHE]2 和 MitoSOX3）会产生不均匀或非特异性染色，并且通常在乙醇或二甲基亚砜等溶剂中递送，这需要额外的溶剂效应控制。另一类 ROS 生物传感器是基于荧光共振能量转移 （FRET） 的生物传感器（例如，用于细胞氧化还原态4 的 Redoxfluor，以及过氧化物传感器 HSP-FRET5、OxyFRET 6 和 PerFRET6）。这些探针是基因编码的，原则上是高度敏感的，可以使用表征良好的线粒体信号序列定量靶向线粒体。然而，使用基于 FRET 的探针存在挑战，包括交叉激发和渗漏导致的背景，以及对发生 FRET 的荧光基团的接近度和方向的严格要求33,34。此外，FRET探针由两种荧光蛋白组成，与光谱偏移探针相比，它们需要更大的构建体才能在目标细胞中表达。这里描述的方案是为了利用基于HyPer7的生物传感器的优势而开发的，并使用这种紧凑的、比例的、高亲和力的、遗传编码的探针对活酵母中线粒体中的过氧化物进行定量成像。
Protocol
1. 生物传感器质粒的生成，整合到酵母基因组中，并评估 mtHyPer7 对线粒体的靶向性以及对线粒体形态、细胞生长速率或氧化应激敏感性的影响
注：有关用于生物传感器构建和表征的生物传感器质粒构建、菌株、质粒和引物，请参阅补充文件 1、补充表 S1、补充表 S2 和补充表 S3。有关本协议中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参阅材料表。
- 使用引物 Y290 和 Y291（图 2）通过聚合酶链反应 （PCR） 从生物传感器质粒扩增生物传感器构建体。
- 将 500 ng Cas9/向导 RNA 质粒 （YN2_1_LT58_X2site32） 与步骤 1.1（生物传感器构建体）的 50 μL PCR 产物混合。 使用醋酸锂方法35 将混合物转化为出芽酵母，并在含有200mg / mL G418的YPD板上选择转化体。
- 使用引物 Y292 和 Y293 通过基因组 DNA 的 PCR 扩增来筛选候选转化体。对于携带预期大小（阳性：3.5 kb;阴性：0.3 kb）插入片段的转化体，对插入区域进行测序以进行进一步验证。
- 评估生物传感器对生长和线粒体功能的影响（图3）。如果生物传感器似乎会影响细胞或线粒体的功能，请尝试通过改变启动子、整合位点或亲本菌株来尽量减少影响。
- 如前所述，确定生物传感器构建体在存在和不存在氧化应激源（例如百草枯）的情况下对生长速率的影响36.
- 在 200 μL 相应培养基中将对数期细胞稀释至 600 nm 光密度 （OD600） 为 0.0035，无论是否处理到 96 孔平底板的每个孔中。使用酶标仪每20分钟测量培养物的光密度，持续72小时。计算最大增长率（斜率）作为72小时过程中240分钟间隔内OD的最大变化。
- 通过荧光显微镜观察细胞并评估亮度和线粒体形态，如前所述37。
- 将细胞生长至对数中期，用250nM MitoTracker Red染色线粒体30分钟，并在成像前洗涤两次。在宽视场或共聚焦荧光显微镜上以 0.3 μm 的间隔捕获 6 μm 深度的 Z 堆栈并目视检查。寻找形成细长管状结构的线粒体。
- 如前所述，确定生物传感器构建体在存在和不存在氧化应激源（例如百草枯）的情况下对生长速率的影响36.
图 3：mtHyPer7 靶向线粒体，不影响线粒体形态、细胞生长或对氧化应激的敏感性。 （A） 表达 mtHyPer7 的活酵母细胞中的线粒体形态。左图：mtHyPer7 在 488 nm 激发下可视化。中图：用 250 nM MitoTracker Red 标记的线粒体。右面板：合并的图像。显示了最大强度投影。单元格轮廓以白色显示。比例尺 = 1 μm。 （B，C） 野生型细胞和表达 mtHyPer7 的细胞的生长曲线和最大生长速率，在 YPD 培养基中存在 （+PQ） 或不存在 2.5 mM 百草枯的情况下生长。（D，E）在 SC 培养基中存在 （+PQ） 或不存在 2.5 mM 百草枯的情况下生长的野生型和表达 mtHyPer7 的细胞的生长曲线和最大生长速率。所有生长曲线都是三个独立重复的平均值。最大增长率表示为平均值±均值标准误差 （SEM）。通过将 200 μL 相应培养基中的中期对数期细胞稀释至 OD600 为 0.0035 到 96 孔平底板的每个孔中来完成生长曲线分析。使用酶标仪每20分钟测量培养物的OD，持续72小时。将每个菌株/条件一式三份接种，并绘制平均生长速率。使用72小时240分钟间隔内OD的变化计算最大增长率（斜率）。缩写：WT=野生型;PQ = 百草枯。请点击这里查看此图的较大版本.
2. 细胞培养和成像准备（图4）
- 将合成培养基中的细胞传播到对数中期进行成像。5 mL 对数中期培养物可提供足够的细胞用于 4 或 5 张载玻片，总共提供 >100 个出芽细胞用于分析。
- 在实验前一天的早晨，通过在50mL锥形底管中接种5mL合成完全（SC）培养基来制备液体预培养物，该培养基具有单个酵母细胞菌落。
- 将预培养物在轨道振荡器中以200rpm和30°C孵育6-8小时。测量预培养物的OD600 ，应处于对数中期：~0.5-1×107 个细胞/ mL，OD600 ~0.1-0.3。
- 使用预培养物准备对数中期培养物，以便在第二天成像。计算过夜生长（8-16小时）后对数中期培养所需的预培养量。当细胞在SC培养基中生长时，倍增时间为~2小时。因此，使用公式（1）计算用于接种5mL过夜培养物的预培养物体积（V）：
（一） - 在50mL锥形底管中接种5mL的SC培养基，预培养量在步骤2.1.3中计算。在轨道振荡器中以200rpm和30°C生长8-16小时。
- 在成像当天，确认在步骤2.1.4中生成的培养物处于对数中期（OD600 ~0.1-0.3）。通过以 6,000 × g 离心 30 秒，从 1 mL 对数中期培养物中浓缩细胞。除去上清液，在试管中留下 10-20 μL 的上清液。通过使用微量移液器与残留培养基轻轻混合来重悬细胞沉淀。
- 使用鼓风机或无绒纸巾去除玻璃显微镜载玻片上的灰尘，并向载玻片中加入 1.8 μL 细胞悬液。用#1.5（170μm厚）玻璃盖玻片覆盖细胞，以一定角度缓慢降低盖玻片以避免引入气泡。
- 立即成像，并在成像10分钟后丢弃载玻片。
（一）
图 4：细胞生长和成像。 表达mtHyPer7的出芽酵母细胞生长到对数中期。Z系列图像通过转盘共聚焦显微镜收集，然后进行3D重建和分析。请参阅协议第 2-3 节。 请点击这里查看此图的较大版本.
3. 成像条件和图像采集的优化（图5）
- 选择 成像模式。对于无需后处理的光学切片，首选转盘共聚焦仪器。但是，如果信号低，或者该仪器不可用，则使用宽视场成像，确保对宽视场图像进行去卷积以消除失焦模糊，如前所述38。
- 选择 光学器件。使用高数值孔径油浸镜头，例如 100x/1.45 平场复消色差镜头。
- 选择 激发 和 发射波长。对于 转盘共聚焦成像，请使用 405 nm 和 488 nm 的激光激发和 标准 GFP 发射滤光片。对于 宽视场成像，请使用发光二极管 （LED） 或灯激发，但要确保滤光片设置允许激发变化，同时将发射通过标准 GFP 滤光片。
注意： 例如，这可以通过从 GFP 立方体中移除激发滤光片并使用 LED 或滤光片轮来选择激发来实现。 - 选择曝光时间和照明强度。
- 建立采集条件，在每个荧光通道中产生易于检测的信号和可接受的分辨率。例如，在带有sCMOS相机的转盘共聚焦显微镜上，使用2 x 2像素合并、20-40%激光功率和200-600 ms曝光。
- 检查图像直方图。在 12 位图像（4,096 个可能的灰度级别）中，确保像素值的总动态范围至少为几百个灰度级别，没有饱和度（图 5A）。此外，请确保范围比噪音水平高一个数量级。将噪声水平计算为图像无细胞区域中像素值的标准偏差，如步骤 4.1.3.1 中所述进行测量。
- 在选定的成像条件下测试光漂白或成像诱导的线粒体应激。如果观察到过度的光漂白或线粒体H 2 O2的增加，请降低激光功率并增加曝光或分档。
- 收集一系列延时图像，采集之间没有延迟，以评估成像条件对线粒体信号稳定性和氧化应激的影响。使用显微镜采集软件或ImageJ，测量每个荧光通道中 的平均像素值 ，以确认信号稳定性（<5%变化; 图5B）。如果实验不涉及延时成像，请确保荧光在两个或三个重复的Z堆栈（25-35次曝光）上是稳定的。
注：两个通道的荧光降低可能表明光漂白;然而，405 nm 激发荧光的减少伴随着 488 nm 激发通道的增加可能表明线粒体 H 2 O2增加和成像诱导的细胞器氧化应激。
- 收集一系列延时图像，采集之间没有延迟，以评估成像条件对线粒体信号稳定性和氧化应激的影响。使用显微镜采集软件或ImageJ，测量每个荧光通道中 的平均像素值 ，以确认信号稳定性（<5%变化; 图5B）。如果实验不涉及延时成像，请确保荧光在两个或三个重复的Z堆栈（25-35次曝光）上是稳定的。
- 获取图像。如果收集 Z 堆栈，请确保数据集中所有影像的 Z 间隔相同，并包括整个像元。对于出芽酵母， Z 间隔 为 0.5 μm， 总堆叠深度 为 6 μm 的图像。 采集透射光图像以记录细胞边界。
- 使用 ImageJ39 的斐济分布和统计软件 R，通过补充文件 2 和 https://github.com/theresaswayne/biosensor 中提供的脚本手动或半自动分析图像（图 6）。在软件说明中，分层菜单命令以粗体显示，带有“|”，表示菜单选择的顺序。选项和按钮以粗体显示。
图 5：成像优化。 （A） 评估图像和直方图是否具有正确的强度范围。图中显示了转盘共聚焦图像的最大强度投影。直方图以线性 Y 轴（黑色）和对数刻度 Y 轴（灰色）显示，以说明图像动态范围。左面板：图像噪点，强度和动态范围低。中央面板：具有可接受的动态范围（~1,000 级灰度）和强度的图像。右面板：图像对比度增强不当，导致饱和度过高。比例尺 = 1 μm。 （B，C） mtHyPer7 的光漂白分析。无延迟地收集连续的Z堆栈，对Z堆栈求和，测量线粒体的平均强度并将其归一化到第一个时间点。显示了前三个时间点（27 次曝光）的结果。（B） 激发波长：405 nm。（C） 激发波长：488 nm。显示的值是来自三个独立试验中每个试验的三个细胞的平均值。请点击这里查看此图的较大版本.
4. 使用脚本进行半自动分析
- 使用生物传感器分析脚本（例如，biosensor.ijm 或 biosensor-image-subtraction.ijm）生成和测量比率图像。
- 选择要使用的脚本。使用每个脚本的协议是相似的;任何差异都将在正文中指定。
- biosensor.ijm：在此脚本中，使用用户选择的图像区域、固定值或无减法来校正背景和噪点。独立选择背景和噪声校正方法。
- biosensor-image-subtraction.ijm：在此脚本中，背景和噪声都由相同的用户选择方法处理，该方法可能是以下方法之一：空白图像、图像中用户选择的区域、固定值或无校正。
- 在斐济，打开在步骤 3.5 中获取的多通道 Z 堆栈映像。打开所需的生物传感器分析脚本文件。通过单击“脚本编辑器”窗口中的“运行”来运行脚本。在显示的对话窗口中，输入请求的信息。
- 选择分子和分母的 通道号 进行比率计算。 对于mtHyPer7，分子是 488 nm激发的通道，分母是 405 nm激发的通道。选择透射光图像的 通道号 （如果存在）或 0 （如果没有）。
- 从以下四个选项中选择所需的背景减法方法。如果背景相对均匀，请选择 “选择图像区域”，直接测量图像中的背景级别。如果整个视场的背景差异很大，请使用 biosensor-image-subtraction.ijm 脚本并选择空白图像（要收集 空白图像 进行校正，请在无细胞视野中捕获具有相同采集条件的多通道 Z 堆栈，或从使用无细胞生长培养基制作的载玻片中捕获）。 固定 值允许输入先前测量的背景值。 没有一个 会使背景未得到校正，但可能会降低测量精度。
- 选择所需的噪声减法。噪声值用作减去背景的掩蔽通道图像的较低阈值，以减少检测器读数中随机变化的影响。选择“ 选择图像区域 ”或 “固定值 ”以允许输入先前测量的噪声水平，这通常效果很好，因为如果成像条件保持不变，噪声水平是恒定的。或者，选择 “无 ”并使用值 1 作为下限阈值，这可能会增加测量值的可变性。
- 选择阈值算法以准确、一致地检测线粒体;建议使用 Otsu 或 MaxEntropy 。理想情况下，对实验中的所有图像使用相同的算法，但要确保线粒体的准确识别。如果在实验过程中形态发生变化，请使用不同的阈值方法。
- 选择每个单元格的感兴趣区域 （ROI） 数。例如，如果测量 母芽差异，请选择 2。
- 选择将保存测量值和比率图像的输出文件夹。
- 按照提示进行 背景 和 噪音校正。
- 区域选择（如果适用）：如果选择了 “选择图像区域 ”进行背景或噪点测量，请按照提示使用 矩形 ROI 工具绘制背景区域（在任何单元格或荧光伪影之外）。绘制区域后，单击“ 确定”。
- 固定值输入（如果适用）：如果背景或噪声测量选择了 固定 值，请按照提示输入每个荧光通道 的背景 和/或 噪声值 。
- 空白参考图像（如果适用）：在 biosensor-image-subtraction.ijm 脚本中，如果选择 “ 空白图像”进行背景或噪点校正，请按照提示选择 空白图像文件。
- 标记 ROI 以进行衡量。在对数中期培养中，将分析限制在出芽细胞上。
- 根据明场图像绘制对应于单个细胞或亚细胞区域的 ROI。ROI 不必与细胞轮廓完全匹配，因为只会测量 ROI 内的阈值线粒体。或者，打开之前存储的 ROI 集：在 ROI 管理器中，单击 “更多”，然后选择 ROI 文件。
- 创建每个 ROI 后按 T 将选定的 ROI 添加到 ROI 管理器。在 ROI 管理器中，选中 “全部显示” 以记录已标记的单元格。每个添加的区域都将在 ROI 管理器列表中显示为编号项。如果分析每个细胞（例如，母细胞和芽细胞）的多个 ROI，请以相同的顺序标记每个分析细胞的 ROI。
- 将所有所需的 ROI 添加到 ROI 管理器后，单击“标记单元格”对话框窗口中的“确定”。
- 选择测量表格式。在出现的“ MultiMeasure ”对话框窗口中，选中 “测量所有切片”。选中“ 每片一行 ”选项以生成具有所需格式的表。使用process_multiROI_tables。R 脚本，用于处理使用 “每片一行 ”选项创建的表; 不要选中 Append Results。重复此步骤 3 次（用于测量分子 [488]、分母 [405] 和比率 [488/405] 图像）。
- 该脚本会将输出文件保存到步骤 4.1.2.6 中选择的文件夹中。
- 选择要使用的脚本。使用每个脚本的协议是相似的;任何差异都将在正文中指定。
- 计算每个区域或单元格的加权均值比率
- 使用在上一步中获得的结果，使用公式 （2） 计算每个区域或单元格的加权均值比率。计算“像素”或“区域”比率（有关详细信息，请参阅讨论）。
（二）
注意：面积和积分密度 （IntDen） 值仅包括阈值线粒体内的像素。可以使用process_multiROI_tables自动进行此计算。R 脚本和 R 统计软件。
- 使用在上一步中获得的结果，使用公式 （2） 计算每个区域或单元格的加权均值比率。计算“像素”或“区域”比率（有关详细信息，请参阅讨论）。
- 生成彩色比例图像。由于色调（颜色）的变化对人眼来说比强度的变化更明显，因此将比率值转换为色标，以便于视觉解释。colorize_ratio_image.ijm 脚本将对蒙版比例图像进行着色。
- 在斐济，打开在步骤 4.1.6 中生成的比率 Z 堆栈映像。打开 colorize_ratio_image.ijm 脚本文件。通过单击“脚本编辑器”窗口中的“运行”来运行脚本。在显示的对话窗口中，输入请求的信息。
- 着色方法：在 “未调制 ”选项中，所有线粒体像素都以相同的亮度显示。但是，有些图像可能会出现噪点，因为昏暗和明亮的像素都会影响图像的比例。要减少这种影响，请使用“ 强度调制 ”选项。
- 最小和最大显示值：这些值控制将着色的比率值的范围。选择接近实验中观察到的平均最小值和最大值的值（基于步骤 4.2.1 中计算的加权均值）。在实验中，确保采集具有相同成像条件的所有图像，并以相同的最小值和最大值显示所有图像。
- 投影模式：Z 堆栈显示为投影，以显示整个线粒体群体。投影在着色之前创建。选择“最大”作为最大强度投影（保留最大比率和强度值），或选择“平均值”作为平均强度投影。
- 输出文件夹：选择要保存彩色图像的文件夹。
- 如果选择了 “未调制 ”选项，请选择配色方案（查找表;LUT） 在出现的对话窗口中。使用斐济内置的 Fire 或 Rainbow RGB LUT，或 ImageJ 的 .lut 格式的任何所需 LUT（从 LUT 文件导入）。建议使用 Rainbow Smooth40 LUT（包含在 补充文件 2 和 GitHub 上）。
- 该脚本将输出文件保存到步骤 4.3.1.4 中选择的文件夹。其中包括彩色比例图像 （Color_RGB.tif） 和带有校准条的彩色比例图像，显示比率值和图像颜色 （Color_with_bar.tif） 之间的对应关系。
- 在斐济，打开在步骤 4.1.6 中生成的比率 Z 堆栈映像。打开 colorize_ratio_image.ijm 脚本文件。通过单击“脚本编辑器”窗口中的“运行”来运行脚本。在显示的对话窗口中，输入请求的信息。
（二）5. 人工分析
注意：此方法需要更多时间，但可以灵活地进行预处理和设置阈值。
- 校正背景。
- 在斐济设置选项。
- 单击 “分析”|”设置测量值。在显示的对话窗口中，选中 Area、Mean、StdDev、IntDen 和 Display Label 复选框。将小数位设置为 3。
- 单击 “编辑”|”选项 |输入/输出。在显示的对话框窗口中，选中 “保存行号 ”和“ 保存列标题”复选框。
- 为了提高比率计算的灵敏度，请从每个荧光通道中减去背景。如果背景相对均匀，则测量图像中无细胞区域的平均强度，并从整个图像中减去该值（步骤5.1.2.1）。或者，如果整个视场的背景差异很大，请使用空白图像进行校正（步骤 5.1.2.2）。
- 要减去用户选择的区域，请单击“图像”|”颜色 |拆分通道，并保持所有通道图像处于打开状态，因为稍后将需要它们。对于每个荧光通道，在背景（任何单元格外）绘制一个 ROI，然后单击“分析”|”测量，或者对于堆栈，单击“图像”|”堆栈 |测量堆栈。观察结果表中显示的 ROI 的平均值。单击“编辑”|”选择“无”，然后选择“处理”|”数学 |减去。在显示的对话框窗口中，输入测得的平均背景值，四舍五入到最接近的整数。
注意：舍入可防止以后出现二进制操作错误。 - 要从数据文件中减去空白图像，请从完全无细胞的视野或用无细胞生长培养基制备的载玻片中收集空白图像。单击“ 处理”|”图像计算器。在显示的对话窗口中，将操作设置为“ 减法”，并将“图像 1”和“图像 2”分别设置为单元格图像和空白图像。选中 创建新窗口 和 32 位结果。
- 要减去用户选择的区域，请单击“图像”|”颜色 |拆分通道，并保持所有通道图像处于打开状态，因为稍后将需要它们。对于每个荧光通道，在背景（任何单元格外）绘制一个 ROI，然后单击“分析”|”测量，或者对于堆栈，单击“图像”|”堆栈 |测量堆栈。观察结果表中显示的 ROI 的平均值。单击“编辑”|”选择“无”，然后选择“处理”|”数学 |减去。在显示的对话框窗口中，输入测得的平均背景值，四舍五入到最接近的整数。
- 在斐济设置选项。
- 要将分析限制在线粒体，请执行分割。由于每个通道可能会根据生物传感器的状态改变强度，因此请使用两个通道的总和来一致地定义线粒体的面积。
- 要创建总和图像，请单击“ 处理”|”图像计算器。在出现的对话窗口中，将操作设置为 “添加”，然后按任意顺序将“Image1”和“Image2”设置为两个背景减去的荧光通道。选中 Create New Window and 32-bit Result 并等待总和图像出现。
- 设置阈值以在总和图像上定义线粒体。
- 点击 图片 |调整 |阈值。在出现的“ 阈值 ”窗口中，选中“ 深色背景 ”和 “堆栈直方图”。将 Method 设置为所需的算法（例如， Otsu 或 MaxEntropy）。采用自动阈值以提高可重复性，但如果没有合适的自动方法，请手动调整阈值。
注意：理想情况下，实验中的所有图像都应使用相同的算法，但在某些情况下，实验期间形态的变化可能需要不同的阈值方法。 - 当阈值令人满意时，单击 应用。在显示的对话窗口中，选择 “转换为蒙版”。在显示的对话窗口中，选中 黑色背景 ，并取消选中其他框。保存生成的掩模图像以评估分割精度。
- 点击 图片 |调整 |阈值。在出现的“ 阈值 ”窗口中，选中“ 深色背景 ”和 “堆栈直方图”。将 Method 设置为所需的算法（例如， Otsu 或 MaxEntropy）。采用自动阈值以提高可重复性，但如果没有合适的自动方法，请手动调整阈值。
- 通过单击“ 处理”|”数学 |除法。将值设置为 255，并在出现提示时选择处理所有图像的选项。
- 通过单击 “处理”|”图像计算器。在显示的对话窗口中，将操作设置为 “乘法”。将 Image1 和 Image2 分别设置为分子通道和掩码。检查 创建新窗口 和 32 位结果;用分母通道重复掩码乘法。
- 通过将背景像素设置为 NaN （“不是数字”），准备每个遮罩通道进行比率计算。
- 选择屏蔽分子通道，然后单击“图像”|”调整 |阈值。在“阈值”窗口中，单击“设置”，然后在显示的对话窗口中，将最小值设置为计算出的噪声级或 1，并保留最大值。
- 在 “阈值 ”窗口中，单击“ 应用”。在下一个对话框中，选择 “设置为 NaN”。对屏蔽分母通道重复上述步骤。
- 生成比率图像。
- 单击“处理”|”图像计算器。在显示的对话窗口中，将操作设置为除法。将 Image1 和 Image2 分别设置为背景减去屏蔽分子和分母通道。对于mtHyPer7，分子是在488 nm处激发的氧化形式，分母是在405 nm处激发的还原形式。因此，比率越高表示 H 2O2 越高。
- 选中 创建新窗口 和 32 位结果。保存比率图像以供分析。
- 标记和量化感兴趣的区域。每个细胞或亚细胞区域都被选择并存储为 ROI 管理器中的 ROI。ROI不必与细胞轮廓完美匹配，因为只会测量被掩盖的线粒体区域。
- 使用透射光图像来防止偏差，创建与单个细胞（或亚细胞区域）相对应的 ROI。在对数中期培养中，将分析限制在携带芽的酵母细胞上，这些芽积极参与细胞分裂。创建每个 ROI 后按 T 将其添加到 ROI 管理器中。选中“ 全部显示 ”以记录已标记的单元格。
- 单击上面创建的比率图像，然后在 ROI 管理器中，单击 更多 ... |多测量。在显示的对话窗口中，选中 测量所有切片。 不要 选中 Append Results。选中“ 每片一行 ”选项以生成具有所需格式的表。process_multiROI_tables。R 脚本将处理使用 R 统计软件中的“ 每片一行 ”选项创建的表。
- 保存结果。单击“ 结果 ”窗口，然后单击 “文件”|”保存结果表，并以 .csv 或 .xls 格式保存。设置文件名以匹配图像名称。
- 保存 ROI。在 ROI 管理器中，首先确保未选择任何 ROI：单击 取消选择，然后单击 “更多”|”保存。在斐济中打开保存的 ROI 和原始图像，以将测量结果与图像进行交叉引用。
- 使用上一步和公式 （3） 中获得的结果计算每个细胞或区域的加权平均比率。计算“像素”或“区域”比率（有关详细信息，请参阅讨论）。
（三）
注意：面积和积分密度值仅包括阈值线粒体内的像素。可以使用process_multiROI_tables自动进行此计算。R 统计软件中的 R 脚本。 - 生成彩色比例图像。
注意：彩色图像可以是未调制的，其中所有线粒体像素都以相同的亮度出现，也可以是强度调制的，其中原始图像中的像素强度用于设置彩色图像中的强度。- 要生成未调制的彩色图像：
- 打开上面生成的比例图像。点击 图片 |复制 以生成图像的副本，然后关闭原始图像。
- 如果图像是 Z 堆栈，请选择单个切片，或生成 Z 投影以查看所有线粒体。使用最大强度（保留每个 XY 像素坐标处的最大比率和强度值）或平均强度投影。
- 点击图片 |查找表并将 LUT 设置为所需的配色方案（例如，彩虹 RGB 或 Fire [在 ImageJ 中默认可用]）。或者，单击“文件”|”导入 LUT 并以 ImageJ 的 .lut 格式选择任何所需的 LUT，例如 Rainbow Smooth40（包含在补充文件 2 和 GitHub 上）。确保 LUT 为 0 值指定了深色。
- 通过单击 “图像”|”调整 |亮度/对比度。在“ 亮度/对比度”窗口中，单击“ 设置”，然后在出现的对话框窗口中，为 “最小 值”和“ 最大 值”显示值输入所需的值。要最大化观察到的色差，请将其设置为在所有图像中获得的最小值和最大值。将实验中的所有图像设置为相同的对比度级别。
注意： 请勿 单击 “应用”，因为这会更改像素值并阻止在下一步中生成准确的校准条。 - 通过单击 “分析”|“ 添加颜色校准栏工具 |校准杆。 在出现的对话窗口中，选中 “叠加 ”选项以根据需要删除条形图，方法是单击 “图像”|”叠加 |删除覆盖层。
- 如果需要，通过单击 “分析”|”工具 |比例尺。在显示的对话窗口中，设置条形图所需的大小、位置和颜色。选中 “叠加 ”选项以保持条形的颜色，而不考虑使用何种 LUT。
- 通过单击“ 图像”|”叠加 |展平。保存生成的图像。
注意：此图像仅用于演示或发布。强度值会改变，因此无法测量。这些条也会在图像上永久刻录。
- 要创建强度调制图像：
- 点击 图片 |复制 以生成图像的副本，然后关闭原始图像。
- 如果图像是 Z 堆栈，请选择单个切片或生成 Z 投影以查看所有线粒体。
- 通过单击“图像”|”调整 |亮度/对比度，然后在“亮度/对比度”窗口中，单击“设置”。在显示的对话窗口中，为“最小值”和“最大值”显示值输入所需的值。为了最大化观察到的色差，请将其设置为在所有图像中获得的最小值和最大值，并将实验中的所有图像设置为相同的对比度级别。单击“应用”以重新缩放像素值。
- 要创建校准条，请复制此增强图像，然后通过导航到 “分析”|”工具 |校准棒。通过单击 “图像”|”叠加 |展平。如果需要，将此条粘贴到步骤 5.6.2.12 中获得的强度调制 RGB 图像上，以便演示或发布。
- 通过单击“ 文件”|”新品 |图像....在打开的对话框窗口中，按如下方式设置参数： 类型：RGB; 填充物：黑色;宽度和高度：图像的 9 宽度 和 高度）; 切片：1。
- 通过单击 “图像”|“ 将新堆栈转换为 HSB（色相、饱和度、亮度）图像堆栈类型 |HSB 堆栈。
- 通过导航到 “编辑”|”选择“全部”，然后选择 “编辑”|”复制。然后，单击 HSB 堆栈，选择 第一个切片 （Hue），然后单击 Edit |粘贴 以传输比率值。
- 选择 HSB 堆栈的切片 2（饱和度）。通过导航到 “编辑”|”选项 |颜色。单击“编辑”|”选择“全部”，然后选择“编辑”|”填充，然后在打开的对话框窗口中，选择“否”以仅用白色填充当前切片。
- 打开原始数据图像，然后单击 “图像”|”颜色 |拆分通道。
- 使用图像计算器生成两个比率通道的平均值，然后单击“处理”|”图像计算器。在显示的对话窗口中，将操作设置为“平均”，并将“图像1”和“图像2”分别设置为分子和分母图像。选中创建新窗口。
- 通过导航到 “编辑”|”选择“全部”，然后选择 “编辑”|”复制。然后，单击 HSB 堆栈，选择 第三个切片（值），然后单击 “编辑”|”粘贴 以传输强度值。
- 通过单击 “图像”|”类型 |RGB颜色。保存生成的图像。
- 要生成未调制的彩色图像：
（三）
图 6：图像分析和演示示意图。 首先减去转盘共聚焦图像的背景。线粒体通过阈值进行分割，并转换为每个切片的掩膜。这些蒙版应用于两个通道，遮罩图像用于计算比率图像。绘制 ROI 以测量细胞或亚细胞区域中的 mtHyPer7 比率。还可以生成彩色比例图像以进行数据显示。比例尺 = 1 μm。缩写：ROI = 感兴趣区域。 请点击这里查看此图的较大版本.
Representative Results
为了确认 mtHyPer7 是评估线粒体 H 2 O2 的合适探针，评估了 mtHyPer7 的定位及其对酵母线粒体和细胞健康的影响。为了评估 mtHyPer7 的靶向性，在表达 mtHyPer7 的对照酵母细胞和酵母中，用重要的线粒体特异性染料 MitoTracker Red 对线粒体进行染色。使用 MitoTracker Red 染色，线粒体被解析为沿母芽轴排列的长管状结构，并积聚在芽的尖端和芽远端的母细胞尖端41。对照细胞和表达mtHyPer7的细胞的线粒体形态相似。此外，mtHyPer7 与 MitoTracker 红色染色的线粒体共定位（图 3A）。因此，mtHyPer7 有效和定量地靶向线粒体，而不影响正常的线粒体形态或分布。
接下来，进行了额外的验证实验，以评估mtHyPer7对线粒体细胞适应性和氧化应激敏感性的影响。在富集或合成葡萄糖基培养基（分别为YPD或SC）中表达mtHyPer7的细胞的生长速率与未转化的野生型细胞的生长速率相似（图3B，D）。为了评估对线粒体氧化应激的可能影响，对照酵母和表达 mtHyPer7 的酵母采用低浓度百草枯处理，百草枯是一种具有氧化还原活性的小分子，在线粒体中积累，导致细胞器中的超氧化物水平升高24,27。如果 mtHyPer7 的表达诱导线粒体中的氧化应激或保护线粒体免受氧化应激，则表达 mtHyPer7 的细胞对百草枯处理的敏感性应分别增加或降低。使用低浓度百草枯处理可降低酵母菌的生长速度。此外，在百草枯存在下，野生型细胞和表达 mtHyPer7 的细胞的生长速率相似（图 3C、E）。因此，生物传感器的表达不会在出芽酵母细胞中产生显着的细胞应激，也不会改变酵母对线粒体氧化应激的敏感性。
鉴于mtHyPer7适用于研究出芽酵母中的线粒体H 2 O 2，测试了mtHyPer7是否能检测对数中期野生型酵母中的线粒体H 2 O 2和外加H 2 O 2诱导的线粒体H 2 O 2的变化。进行H2 O2滴定实验，测量线粒体中平均氧化：还原（O/R）mtHyPer7比值。
自动分析脚本生成了多个输出文件。
比率图像（ratio.tif）：由背景校正的阈值488 nm和405 nm堆栈的比率组成的Z堆栈。此堆栈可以在斐济查看，无需额外处理;但是，建议在查看之前按照协议步骤 4.3 或 5.6 中的描述增强对比度和/或对图像进行着色。
掩模图像（mask.tif）：由用于分析的阈值线粒体区域组成的Z堆栈。此图像必须用于评估阈值的准确性。
用于分析的 ROI （ROIs.zip）：在斐济打开此文件时，与源图像一起打开时，ROI 将叠加在图像上，以交叉引用结果表和源图像。每个 ROI 都使用单元格编号和 ROI 编号重命名。
测量表（NumResults.csv、DenomResults.csv、Results.csv）分别包含分子、分母和比率图像中每个切片的阈值线粒体的面积、平均值和积分密度。在线粒体缺失或失焦的切片中，记录NaN。
日志文件 （Log.txt），记录用于背景和噪声校正、阈值和比率计算的选项。
mtHyPer7 的 O/R 比显示出对 H 2 O 2 浓度的剂量依赖性反应，在 1-2 mM 外部添加 H 2 O 2 时达到平台期（图 7）。令人惊讶的是，暴露于0.1mM H 2 O2的细胞中的HyPer7比率低于对照细胞，尽管这种差异没有统计学意义。对这种现象的一种解释可能是激素反应，其中暴露于低水平的压力源可能会诱发应激反应，例如抗氧化机制，这反过来又降低了探针可检测到的ROS量。相反，较高水平的压力源可能会压倒内部应力反应，并导致 HyPer7 的读数更高。
图 7：mtHyPer7 对外部添加的 H 2 O 2 的响应。 （A） 405 nm 和 488 nm 激发图像的最大投影以及暴露于不同浓度 H 2 O 2 的中期对数期细胞中 mtHyPer7 比例图像的平均强度投影。伪彩表示氧化：还原的 mtHyPer7 比率（底部刻度）。比例尺 = 1 μm。单元格轮廓以白色显示;n >每种条件下 100 个细胞。（B） 用不同浓度的 H 2 O2处理的出芽酵母细胞中 mtHyPer7 氧化：还原比例的定量。图中显示了五个独立试验的手段，每个试验都有不同形状和颜色的符号。氧化：还原mtHyPer7比率的平均值±SEM：1.794±0.07627（未处理），1.357±0.03295（0.1mM），2.571±0.3186（0.5mM），6.693±0.5194（1mM），7.017±0.1197（2mM）。p < 0.0001（Tukey 多重比较检验的单因素方差分析）。 p 值表示为：****p < 0.0001。请点击这里查看此图的较大版本.
最后，先前的研究表明，更健康的线粒体，其还原度更高，含有更少的超氧化物，优先由酵母子细胞遗传 4，并且胞质过氧化氢酶被转运到酵母子细胞中并在酵母子细胞中激活42,43,44,45。这些研究记录了酵母细胞分裂过程中线粒体的不对称遗传，以及这一过程在子细胞健康和寿命中的作用，以及母女年龄不对称。为了测试母细胞和芽之间是否存在 H 2 O2的差异，在芽和母细胞中测量了 mtHyPer7。在酵母细胞内观察到线粒体 H 2 O 2 的差异，与母细胞中的线粒体相比，在芽中的线粒体中检测到 H 2 O 2 生物传感器读数的细微但具有统计学意义的降低（图 8）。这些发现与先前的研究结果一致，即芽中的线粒体可以更好地保护线粒体免受氧化应激的影响。他们还提供了 mtHyPer7 可以为出芽酵母中具有细胞和亚细胞分辨率的线粒体H 2 O2 提供定量读数的文件。
图 8：子细胞中的线粒体 H2 O2 水平较低。 （A） mtHyPer7 在代表性细胞中的比率图像的最大投影。伪彩表示氧化：还原的 mtHyPer7 比率（底部刻度）。该比率的亚细胞差异很明显（箭头）。比例尺 = 1 μm。单元格轮廓：白色。（B） 芽细胞和母细胞中 mtHyPer7 比率之间的差异。对于每个单独的细胞，从芽比值中减去母比值并绘制为一个点。n = 193 个细胞，这些细胞来自五个独立实验，每个实验都用不同颜色的符号显示。芽细胞和母细胞中mtHyPer7比率之间差异的平均±SEM：-0.04297±0.01266。p = 0.0008 （配对 t 检验） 请点击这里查看此图的较大版本.
补充表 S1：本研究中使用的菌株。 使用的酵母菌株列表。 请点击这里下载此文件。
补充表S2：本研究中使用的质粒。 使用的质粒列表。 请点击这里下载此文件。
补充表 S3：本研究中使用的引物。 使用的引物列表。 请点击这里下载此文件。
补充文件1：生物传感器质粒构建方案。请点击这里下载此文件。
补充文件 2：用于自动分析的脚本。 对于每个脚本，都提供了示例输入文件和输出文件。 请点击这里下载此文件。
Discussion
在该协议中，描述了一种使用mtHyPer7作为生物传感器来评估活出芽酵母细胞中的线粒体H2 O2的方法。该生物传感器使用基于CRISPR的方法构建，并在不使用可选标记的情况下引入酵母基因组中的保守无基因区域。与质粒携带的生物传感器相比，集成的生物传感器在所有细胞中以一致的水平表达，从而提供更可靠的定量结果。没有选择的标记用于生成表达mtHyPer7的细胞，这允许使用更广泛的菌株背景，并促进生物传感器表达细胞的基因修饰。mtHyPer7 蛋白正确靶向线粒体，对线粒体形态、功能、分布或细胞生长速率没有明显影响。mtHyPer7 对外部添加的 H 2 O2 表现出剂量依赖性反应。此外，mtHyPer7 能够报告线粒体质量的异质性，并具有亚细胞分辨率。最后，与宽视场显微镜相比，使用转盘共聚焦显微镜对线粒体靶向生物传感器进行成像，可以减少对荧光团的光漂白，并生成用于分析亚细胞差异的高分辨率图像。
局限性和替代方法
这种方法不适用于超过10分钟的细胞成像，因为细胞会在盖玻片下变干。对于长期成像，最好使用琼脂垫方法46 或将细胞固定在充满SC培养基的玻璃底培养皿中。
生物传感器的选择应以实验条件下靶标的浓度为指导。如果 HyPer7 的灵敏度过高，建议使用其他 HyPer 版本，例如 HyPer3 或 HyPerRed47,48。但是，应该注意的是，其他HyPer探头对pH值更敏感。为了获得更高的灵敏度，基于过氧化物还蛋白的 roGFP 可能更合适 （roGFP2Tsa2ΔCR）27。
H 2 O2传感器的氧化稳态与氧化速率和还原速率有关。生物传感器的氧化速率主要由H 2 O2引起，但还原速率取决于细胞和细胞器中活跃的抗氧化还原系统。研究表明，HyPer7 在酵母胞质溶胶中主要被硫氧还蛋白系统还原，其还原速度快于 roGFP2Tsa2ΔCR27。因此，在解释 H 2 O2 生物传感器的测量值时，应考虑探针的不同还原机制和响应动力学。特别是，为了从生物传感器读数推断出 H 2 O2水平，必须假设还原系统在实验过程中保持恒定容量。作为这里描述的脚本的替代方法，已经免费提供了各种其它软件用于分析氧化还原传感器49。
关键步骤
对于任何生物传感器，证明生物传感器本身不会影响被测量的过程至关重要。因此，比较菌株在每种实验条件下的生长和线粒体形态是很重要的。在这里，使用MitoTracker Red评估线粒体形态，MitoTracker Red以膜电位依赖性方式染色线粒体。然而，未转化细胞和生物传感器转化细胞中线粒体的比较可以通过用四甲基罗丹明甲酯 （TMRM）（一种替代膜电位感应线粒体生命染料）或 MitoTracker Green 染色来完成，后者对线粒体进行染色，而线粒体不受膜电位的影响。如果怀疑有害影响，降低表达水平或改变整合位点可能会有所帮助。
验证探头的剂量反应行为和成像技术的信噪比对于收集可靠的结果也至关重要。如果组内的变异性超过组之间的变异性，则难以检测差异。组内变异性可能是由真实的种群变异引起的，也可能是由检测过程中的噪声引起的。提高信噪比的关键步骤是图像采集（像素值范围和噪声）、背景减法和阈值。
在计算步骤中也可以减少噪声影响。最直接的方法是根据图像测量值（Results.csv）计算加权平均强度，其中每个像素表示激发效率之间的局部比率。这会产生“像素”比率。但是，如果图像信号噪声比较低，则可以通过计算分子和分母通道中ROI的加权平均强度，然后计算这两个加权平均值之间的比率（“区域”比率）来获得更可靠的结果。
要选择阈值方法，斐济命令 Image |调整 |自动阈值可用于自动 尝试所有内置的斐济方法。要评估分割（阈值），通过单击 “编辑”|”甄选 |创建选区，添加到 ROI 管理器（按 T），然后在原始图像文件上激活。如果线粒体未被充分检测到，应尝试不同的分割方法。
在比较图像时，必须以相同的成像条件采集所有图像，并以相同的对比度增强显示所有图像。
优化成像条件时，必须考虑线粒体运动。如果线粒体在 405 和 488 nm 的激发之间显着移动，则比率图像将不准确。建议将曝光时间保持在 500 毫秒<，并通过最快的方法（例如触发脉冲或声光可调谐滤波器）改变激励。捕获 Z 堆栈时，在移动到下一个 Z 步骤之前，应对每个 Z 步骤执行两次激励。
为了显示结果，色调（颜色）的变化对人眼来说比强度的变化更明显。因此，比率值被转换为色标，以便于视觉解释。彩色图像可以是未调制的，其中所有线粒体像素都以相同的亮度出现，也可以是强度调制的，其中原始图像中的像素强度用于设置彩色图像中的强度。
修改和故障排除
除了使用百草枯激发试验来确认线粒体功能外，还可以将细胞复制接种或接种到可发酵和不可发酵的碳源中。
对于背景减法，滚动球减法（通过导航到 “处理”|”减去背景...）也可用于消除照明不均匀性。应确保单元格的存在不会改变被减去的背景（通过选中 “创建背景 ”选项并检查结果）。
总之，mtHyPer7探针提供了一种一致的微创方法来关联活细胞中酵母线粒体的形态和功能状态，并允许在遗传易处理、易于访问的模型系统中研究重要的细胞应激源和信号分子。
Disclosures
作者声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢凯瑟琳·菲尔波·洛佩兹（Katherine Filpo Lopez）的专家技术援助。这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）（GM122589和AG051047）对LP的资助。
这些研究使用了哥伦比亚大学赫伯特欧文综合癌症中心的共聚焦和专业显微镜共享资源，部分资金来自NIH/NCI癌症中心支持资助P30CA013696。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens | Nikon | MRD01905 | |
| Adenine sulfate | Sigma-Aldrich | A9126 | |
| Bacto Agar | BD Difco | DF0145170 | |
| Bacto Peptone | BD Difco | DF0118170 | |
| Bacto Tryptone | BD Difco | DF211705 | |
| Bacto Yeast Extract | BD Difco | DF0127179 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | |
| Carbenicilin | Sigma-Aldrich | C1389 | |
| Carl Zeiss Immersol Immersion Oil | Carl Zeiss | 444960 | |
| Dextrose (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| E. cloni 10G chemical competent cell | Bioserch Technologies | 60108 | |
| FIJI | NIH | Schindelin et al 2012 | |
| G418 (Geneticin) | Sigma-Aldrich | A1720 | |
| GFP emission filter | Chroma | 525/50 | |
| Gibson assembly | New England Biolabs | E2611 | |
| Graphpad Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| H2O2 (stable) | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO | Pon Lab | JYE057/EP41 | Liao et al 20201 |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | E24 | |
| KAPA HiFi PCR kit | Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK1006 | |
| L-arginine hydrochloride | Sigma-Aldrich | A8094 | |
| laser | Agilent | 405 and 488 nm | |
| L-histidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H5659 | |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8912 | |
| L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | L8662 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5482 | |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T8941 | |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T8566 | |
| mHyPer7 plasmid | This study | JYE116 | |
| Microscope coverslips | ThermoScientific | 3406 | #1.5 (170 µm thickness) |
| Microscope slides | ThermoScientific | 3050 | |
| MitoTracker Red CM-H2Xros | ThermoFisherScientific | M7513 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NEBuilder HiFi Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621 | |
| Nikon Elements | Nikon | Microscope acquisition software | |
| Nikon Ti Eclipse inverted microscope | Nikon | ||
| Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate) | Sigma-Aldrich | Cat. 856177 | |
| RStudio | Posit.co | Free desktop version | |
| Spectrophotometer | Beckman | BU530 | |
| Stagetop incubator | Tokai Hit | INU | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U1128 | |
| Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids | BD Difco | DF0919073 | |
| YN2_1_LT58_X2site | Addgene | 177705 | Pianale et al 2021 |
| Zyla 4.2 sCMOS camera | Andor |
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