Biology

जीवित खमीर कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल पेरोक्साइड के लिए एक अनुपातमीट्रिक बायोसेंसर, एमटीहाइपर 7 की इमेजिंग

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65428

Emily Jie-Ning Yang¹, Istvan R. Boldogh^1,2, Haojie Ji², Liza Pon^1,2, Theresa C. Swayne^1,2

¹Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University Irving Medical Center, ²Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource in the Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University Irving Medical Center

Summary

हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2 ओ₂) ऑक्सीडेटिव क्षति और सिग्नलिंग अणु दोनों का स्रोत है। यह प्रोटोकॉल बताता है कि जीवित खमीरमें माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित हाइपर 7 (एमटीएचवाईपर 7), आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड अनुपातमीट्रिक बायोसेंसर का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ₂ को कैसे मापा जाए। यह बताता है कि इमेजिंग स्थितियों को कैसे अनुकूलित किया जाए और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके मात्रात्मक सेलुलर और उपकोशिकीय विश्लेषण किया जाए।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, या कार्यात्मक परिवर्तन, कई बीमारियों और स्थितियों में पाया जाता है, जिसमें न्यूरोडीजेनेरेटिव और मस्कुलोस्केलेटल विकार, कैंसर और सामान्य उम्र बढ़ने शामिल हैं। यहां, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड, न्यूनतम इनवेसिव, अनुपातमेट्रिक बायोसेंसर का उपयोग करके सेलुलर और उपकोशिकीय संकल्पों पर जीवित खमीर कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है। बायोसेंसर, माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित हाइपर 7 (एमटीएचवाईपर 7), माइटोकॉन्ड्रिया में हाइड्रोजनपेरोक्साइड (एच 2 ओ₂) का पता लगाता है। इसमें एक माइटोकॉन्ड्रियल सिग्नल अनुक्रम होता है जो एक गोलाकार फ्लोरोसेंट प्रोटीन और एक बैक्टीरियल ऑक्सीआर प्रोटीन के एच 2 ओ_{2-उत्तरदायी}डोमेन से जुड़ा होता है। बायोसेंसर को सीआरआईएसपीआर-कैस 9 मार्कर-मुक्त प्रणाली का उपयोग करके खमीर जीनोम में उत्पन्न और एकीकृत किया जाता है, जो प्लास्मिड-जनित संरचनाओं की तुलना में अधिक सुसंगत अभिव्यक्ति के लिए होता है।

एमटीहाइपर 7 मात्रात्मक रूप से माइटोकॉन्ड्रिया को लक्षित है, खमीर विकास दर या माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान पर कोई पता लगाने योग्य प्रभाव नहीं है, और सामान्य विकास स्थितियों के तहत और ऑक्सीडेटिव तनावके संपर्क में माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ₂के लिए एक मात्रात्मक रीडआउट प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल बताता है कि स्पिनिंग-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सिस्टम का उपयोग करके इमेजिंग स्थितियों को कैसे अनुकूलित किया जाए और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके मात्रात्मक विश्लेषण किया जाए। ये उपकरण कोशिकाओं के भीतर और आबादी में कोशिकाओं के बीच माइटोकॉन्ड्रिया पर समृद्ध स्थानिक जानकारी एकत्र करना संभव बनाते हैं। इसके अलावा, यहां वर्णित वर्कफ़्लो का उपयोग अन्य बायोसेंसर को मान्य करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया आवश्यक यूकेरियोटिक सेलुलर ऑर्गेनेल हैं जो ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन और इलेक्ट्रॉन परिवहन¹ के माध्यम से एटीपी के उत्पादन में अपने कार्य के लिए अच्छी तरह से जाने जाते हैं। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया कैल्शियम भंडारण, लिपिड, अमीनो एसिड, फैटी एसिड और लौह-सल्फर क्लस्टर के संश्लेषण और सिग्नल ट्रांसडक्शन ^2,3 के लिए साइटें हैं। कोशिकाओं के भीतर, माइटोकॉन्ड्रिया विशेषता आकृति विज्ञान और वितरण के साथ एक गतिशील नेटवर्क बनाते हैं, जो सेल प्रकार और चयापचय स्थिति के अनुसार भिन्न होता है। इसके अलावा, हालांकि माइटोकॉन्ड्रिया फ्यूज और विभाजित हो सकते हैं, एक सेल में सभी माइटोकॉन्ड्रिया बराबर नहीं होते हैं। कई अध्ययनों ने झिल्ली क्षमता और ऑक्सीडेटिव अवस्था 4,5,6 जैसी विशेषताओं में व्यक्तिगत कोशिकाओं के भीतर माइटोकॉन्ड्रिया की कार्यात्मक विविधता का दस्तावेजीकरण किया ^है। माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में यह भिन्नता एमटीडीएनए उत्परिवर्तन (जो परमाणु डीएनए की तुलना में उच्च दर पर होती है) से ऑर्गेनेल को नुकसान और ऑर्गेनेल ^7,8,9 के भीतर और बाहर उत्पन्न प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) द्वारा ऑक्सीडेटिव क्षति के कारण होती है। ऑर्गेनेल को नुकसान माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र द्वारा कम किया जाता है जो क्षति की मरम्मत करता है या माइटोकॉन्ड्रिया को खत्म करता है जो मरम्मत^से परे क्षतिग्रस्त हो जाते हैं।

हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2 ओ₂) एक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति है जो सेलुलर प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और लिपिड को ऑक्सीडेटिव क्षति का स्रोत है। हालांकि, एच2 ओ₂ एक सिग्नलिंग अणु के रूप में भी कार्य करता है जो लक्ष्य प्रोटीन^11,12 में थिओल के प्रतिवर्ती ऑक्सीकरण के माध्यम से सेलुलर गतिविधियों को नियंत्रित करता है। एच2 ओ₂ इलेक्ट्रॉनों से उत्पन्न होता है जो माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला से और विशिष्ट एंजाइमों द्वारा लीक होते हैं, जैसे कि एनएडीपीएच ऑक्सीडेज और मोनोमाइन ऑक्सीडेज 13,14,15,16,17,18,19,20। यह एंटीऑक्सिडेंट सिस्टम द्वारा भी निष्क्रिय है, जिसमें थियोरेडॉक्सिन और ग्लूटाथियोन^21,22,23 पर आधारित हैं। इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रियल एच 2ओ₂स्तरों का विश्लेषण सामान्य माइटोकॉन्ड्रियल और सेलुलर फ़ंक्शन में और ऑक्सीडेटिव तनाव की स्थितियों में इस मेटाबोलाइट की भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।

इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड अनुपातमीट्रिक एच 2 ओ 2 बायोसेंसर, हाइपर 7 का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ₂का पता लगाना है, जो ऑर्गेनेल (एमटीहाइपर 7) को लक्षित है। एमटीहाइपर 7 एक चिमेरा है जिसमें एटीपी 9 (एसयू 9 प्रीसीक्वेंस) से माइटोकॉन्ड्रियल सिग्नल अनुक्रम, हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) का एक गोलाकार रूप से म्यूट रूप और नीसेरिया मेनिन्जाइटिस²⁴ से ऑक्सीआर प्रोटीन का एच 2 ओ_{2-बाइंडिंग}डोमेन शामिल है (चित्रा 1)। गोलाकार रूप से म्यूट जीएफपी में, देशी जीएफपी के एन- और सी-टर्मिनी को जोड़ा जाता है और क्रोमोफोर के पास नई टर्मिनी का निर्माण किया जाता है, जो प्रोटीन को अधिक गतिशीलता प्रदान करता है और देशी जीएफपी²⁵ की तुलना में इसकी वर्णक्रमीय विशेषताओं की अधिक व्यवहार्यता प्रदान करता है। H2 O 2 के साथ mtHyPer7 के ऑक्सीआर डोमेन की बातचीतउच्च-आत्मीयता, H 2 O_{2-चयनात्मक}है, और संरक्षित सिस्टीन अवशेषों और डाइसल्फ़ाइड पुल गठन के प्रतिवर्ती ऑक्सीकरण की ओर जाता है। ऑक्सीआर के ऑक्सीकरण से जुड़े विरूपण परिवर्तनों को एमटीहाइपर 7 में गोलाकार रूप से म्यूट जीएफपी में स्थानांतरित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एमटीहाइपर 7 क्रोमोफोर की उत्तेजना अधिकतम में कम अवस्था में 405 एनएम से एच 2 ओ_{2-ऑक्सीकृत}अवस्था²⁶ में 488 एनएम तक वर्णक्रमीय बदलाव होता है। इस प्रकार, 488 एनएम बनाम 405 एनएम पर उत्तेजना के जवाब में एमटीहाइपर 7 से प्रतिदीप्ति का अनुपात एच 2 ओ₂द्वारा जांच के ऑक्सीकरण को दर्शाता_है।

आदर्श रूप से, एक बायोसेंसर को अपने लक्ष्य अणु का वास्तविक समय, पूर्ण, मात्रात्मक रीडआउट प्रदान करना चाहिए। दुर्भाग्य से, हालांकि, यह वास्तविक दुनिया के माप में हमेशा संभव नहीं होता है। ऑक्सीकरण सेंसर के मामले में, जैसे कि एमटीहाइपर 7, वास्तविक समय रीडआउट डाइसल्फ़ाइड ब्रिज की कमी की दर से प्रभावित होता है। आरओएस बायोसेंसर द्वारा उपयोग की जाने वाली कमी प्रणाली अलग-अलग होती है, और ये नाटकीय रूप से जांच प्रतिक्रिया गतिशीलता को बदल सकते हैं- जैसा कि थायोरेडॉक्सिन प्रणाली द्वारा कम किए गए हाइपर 7 की तुलना से दिखाया गया है, और आरओजीएफपी 2-टीएसए 2 सी_आर, ग्लूटाथियोन-इन खमीर साइटोसोल²⁷ द्वारा कम किया गया है। इस प्रकार, mtHyPer7 अनुपात से सापेक्ष H₂_O2 एकाग्रता के बारे में निष्कर्ष निकालने के लिए, किसी को यह मानना चाहिए कि प्रयोग के दौरान कमी प्रणाली एक निरंतर क्षमता बनाए रखती है। इन विचारों के बावजूद, जीवित कोशिकाओं^25,28,29 में एच 2 ओ₂के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए विभिन्न संदर्भों में हाइपर 7 और संबंधित जांच का उपयोग किया गया है।

चित्र 1:_H2O₂ बायोसेंसर mtHyPer7 का डिजाइन, आणविक तंत्र और उत्तेजना / उत्सर्जन स्पेक्ट्रा। (A) mtHyPer7 प्रोब निसेरिया मेनिनजाइटिस से ऑक्सीआर-आरडी डोमेन में गोलाकार रूप से म्यूट जीएफपी सम्मिलित करके प्राप्त किया जाता है। इसमें न्यूरोस्पोरा क्रैसा (एसयू 9) से एटीपी सिंथेज़ के सबयूनिट 9 से माइटोकॉन्ड्रियल लक्ष्यीकरण अनुक्रम शामिल है। (बी) एमटीहाइपर 7 के एच 2 ओ_{2-सेंसिंग}तंत्र का चित्रण। आरडी डोमेन में सिस्टीन का ऑक्सीकरण 488 एनएम पर उत्तेजना पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन बढ़ाता है और 405 एनएम पर उत्तेजना द्वारा उत्पादित उत्सर्जन को कम करता है। (सी) ऑक्सीकरण और कम रूपों में हाइपर 7 की उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा। यह आंकड़ा पाक एट अल ²⁴ से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है। संक्षेप: जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; सीपीजीएफपी = गोलाकार जीएफपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एमटीहाइपर 7 की यह अनुपातमेट्रिक इमेजिंग माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ₂मात्रा ^24,27 के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करती है; यह जांच एकाग्रता के लिए एक आंतरिक नियंत्रण प्रदान करता है। इसके अलावा, एच 2 ओ 2 एक्सपोजर द्वारा उत्पादित उत्तेजना शिखर मेंबदलाव पूरा नहीं होता है, यहां तक कि एच 2 ओ ₂की संतृप्त सांद्रता में भी। इस प्रकार, अनुपात इमेजिंग विश्लेषण में दो वर्णक्रमीय बिंदुओं को शामिल करके संवेदनशीलता को बढ़ा सकता है।

यहां उपयोग किए जाने वाले एमटीहाइपर 7 जांच में एच 2 ओ₂ के लिएबहुत अधिक संबंध है और पीएच²⁴ के लिए अपेक्षाकृत कम संवेदनशीलता है, और इसे सफलतापूर्वक केनोरहाब्डिस एलिगेंस माइटोकॉन्ड्रिया³⁰ पर लक्षित किया गया है। इस प्रोटीन का उपयोग खमीर^27,31 में भी किया गया है। हालांकि, पिछले अध्ययनों ने एमटीहाइपर 7 की प्लास्मिड-जनित अभिव्यक्ति पर भरोसा किया, जिसके परिणामस्वरूप जांच अभिव्यक्ति²⁷ में सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता होती है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में वर्णित निर्माण को मार्कर-मुक्त एकीकरण के लिए सीआरआईएसपीआर-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करके क्रोमोसोम एक्स³² पर एक संरक्षित, जीन-मुक्त क्षेत्र में एकीकृत किया गया था। एकीकृत बायोसेंसर जीन की अभिव्यक्ति को मजबूत संवैधानिक टीईएफ 1 प्रमोटर (चित्रा 2) द्वारा भी नियंत्रित किया जाता है। नतीजतन, प्लास्मिड-जनित बायोसेंसर अभिव्यक्ति का उपयोग करके देखे गए की तुलना में खमीर सेल आबादी में बायोसेंसर की अधिक स्थिर, सुसंगत अभिव्यक्ति होती है, और बायोसेंसर को प्रभावित करने वाली कोशिकाओं को चयनात्मक मीडिया की आवश्यकता के बिना प्रचारित किया जा सकता है।

चित्रा 2: CRISPR द्वारा mtHyPer7-व्यक्त कोशिकाओं का उत्पादन। कैस 9 और एसजीआरएनए युक्त प्लास्मिड (YN2_1_LT58_X2site) और पीसीआर-प्रवर्धित एमटीहाइपर 7-युक्त बायोसेंसर निर्माण को लिथियम एसीटेट परिवर्तन द्वारा नवोदित खमीर कोशिकाओं में पेश किया जाता है। क्रोमोसोम एक्स (एक्स 2) पर जीन-मुक्त सम्मिलन साइट को एसजीआरएनए के साथ कैस 9 प्रोटीन द्वारा पहचाना और काटा जाता है, और बायोसेंसर को समरूप पुनर्संयोजन द्वारा जीनोम में एकीकृत किया जाता है। माइक्रोस्कोपिक स्क्रीनिंग, कॉलोनी पीसीआर और अनुक्रमण द्वारा सफल ट्रांसफॉर्मेंट्स की पहचान के बाद, कैस 9 प्लास्मिड को गैर-चयनात्मक मीडिया में वृद्धि से हटा दिया जाता है (ठीक) किया जाता है। संक्षेप: एसजीआरएनए = एकल गाइड आरएनए; टीईएफ = प्रतिलेखन बढ़ाने वाला कारक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अंत में, mtHyPer7 अन्य ROS बायोसेंसर पर लाभ प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, आरओएस का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले कार्बनिक रंजक (उदाहरण के लिए, डाइहाइड्रोएथिडियम [डीएचई]² और मिटोसॉक्स³) असमान या निरर्थक धुंधलापन पैदा कर सकते हैं और अक्सर इथेनॉल या डाइमिथाइल सल्फोक्साइड जैसे सॉल्वैंट्स में वितरित किए जाते हैं, जिन्हें विलायक प्रभावों के लिए अतिरिक्त नियंत्रण की आवश्यकता होती है। आरओएस बायोसेंसर का एक अन्य वर्ग फ्लोरेसेंस रेजोनेंस एनर्जी ट्रांसफर (फ्रेट) आधारित बायोसेंसर (जैसे, सेलुलर रेडॉक्स स्टेट⁴ के लिए रेडॉक्सफ्लोर, और पेरोक्साइड सेंसर एचएसपी-फ्रेट⁵, ऑक्सीफ्रेट 6, और पेरफ्रेट⁶) हैं। ये जांच आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड और सिद्धांत रूप में अत्यधिक संवेदनशील हैं और अच्छी तरह से विशेषता वाले माइटोकॉन्ड्रियल सिग्नल अनुक्रमों का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रिया को मात्रात्मक रूप से लक्षित किया जा सकता है। हालांकि, फ्रेट-आधारित जांच के उपयोग में चुनौतियां हैं, जिसमें क्रॉस-उत्तेजना और ब्लीड-थ्रू के कारण पृष्ठभूमि शामिल है, और फ्रेट के लिए फ्लोरोफोरे की निकटता और अभिविन्यास के लिए कड़ी आवश्यकताएं^33,34 हैं। इसके अलावा, फ्रेट जांच में दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन होते हैं जिन्हें स्पेक्ट्रा-शिफ्टिंग जांच की तुलना में रुचि की कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के लिए बड़े निर्माण की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को हाइपर 7-आधारित बायोसेंसर की ताकत का लाभ उठाने के लिए विकसित किया गया था, और जीवित खमीर में माइटोकॉन्ड्रिया में पेरोक्साइड की मात्रात्मक इमेजिंग के लिए इस कॉम्पैक्ट, अनुपातमेट्रिक, उच्च-आत्मीयता, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड जांच का उपयोग करने के लिए।

Protocol

1. बायोसेंसर प्लास्मिड का उत्पादन, खमीर जीनोम में एकीकरण, और माइटोकॉन्ड्रिया के लिए एमटीहाइपर 7 के लक्ष्यीकरण का आकलन और माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान, सेलुलर विकास दर, या ऑक्सीडेटिव तनाव संवेदनशीलता पर प्रभाव।

नोट: बायोसेंसर निर्माण और लक्षण वर्णन के लिए उपयोग किए जाने वाले बायोसेंसर प्लास्मिड निर्माण, उपभेदों, प्लास्मिड और प्राइमरों के लिए पूरक फ़ाइल 1, पूरक तालिका एस 1, पूरक तालिका एस 2, और पूरक तालिका एस 3 देखें। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों और उपकरणों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के माध्यम से प्राइमर वाई 290 और वाई 291 (चित्रा 2) का उपयोग करके बायोसेंसर प्लास्मिड से बायोसेंसर निर्माण को बढ़ाएं।
गाइड आरएनए प्लास्मिड (YN2_1_LT58_X2site³²) के 500 एनजी को चरण 1.1 (बायोसेंसर निर्माण) से पीसीआर उत्पाद के 50 μL के साथ मिलाएं। लिथियम एसीटेट विधि³⁵ का उपयोग करके मिश्रण को नवोदित खमीर में बदलें और 200 मिलीग्राम / एमएल जी 418 युक्त वाईपीडी प्लेटों पर ट्रांसफॉर्मेंट्स का चयन करें।
प्राइमर वाई 292 और वाई 293 का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए के पीसीआर प्रवर्धन द्वारा स्क्रीन उम्मीदवार ट्रांसफॉर्मेंट्स। अपेक्षित आकार (सकारात्मक: 3.5 केबी; नकारात्मक: 0.3 केबी) के सम्मिलित करने वाले ट्रांसफॉर्मेंट्स के लिए, आगे के सत्यापन के लिए सम्मिलित क्षेत्र को अनुक्रमित करें।
विकास और माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन पर बायोसेंसर के प्रभाव का मूल्यांकन करें (चित्रा 3)। यदि बायोसेंसर कोशिकाओं या माइटोकॉन्ड्रिया के कार्य को प्रभावित करता प्रतीत होता है, तो प्रमोटर, एकीकरण साइट या मूल तनाव को बदलकर प्रभाव को कम करने का प्रयास करें।
1. ऑक्सीडेटिव स्ट्रेसर (जैसे, पैराक्वाट) की उपस्थिति और अनुपस्थिति में विकास दर पर बायोसेंसर निर्माण के प्रभाव को निर्धारित करें, जैसा^{कि पहले वर्णित} है।
  1. मध्य-लॉग चरण कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से फ्लैट-बॉटम प्लेट के प्रत्येक कुएं में उपचार के साथ और बिना उपचार के 200 μL में 0.0035 के 600 एनएम ऑप्टिकल घनत्व (OD₆₀₀) तक पतला करें। प्लेट रीडर का उपयोग करके 72 घंटे के लिए हर 20 मिनट में संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व को मापें। 72 घंटे के पाठ्यक्रम के दौरान 240 मिनट के अंतराल पर ओडी में अधिकतम परिवर्तन के रूप में अधिकतम वृद्धि दर (ढलान) की गणना करें।
2. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं की कल्पना करें और चमक और माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का मूल्यांकन करें जैसा कि पहले वर्णित है³⁷।
  1. कोशिकाओं को मध्य-लॉग चरण में बढ़ाएं, माइटोकॉन्ड्रिया को 30 मिनट के लिए 250 एनएम माइटोट्रैकर लाल रंग से दाग दें, और इमेजिंग से पहले दो बार धो लें। एक विस्तृत क्षेत्र या कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर 0.3 μm अंतराल पर 6 μm गहराई के Z ढेर कैप्चर करें और नेत्रहीन निरीक्षण करें। लम्बी ट्यूबलर संरचनाओं को बनाने वाले माइटोकॉन्ड्रिया की तलाश करें।

चित्रा 3: mtHyPer7 माइटोकॉन्ड्रिया के लिए लक्षित है और माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान, कोशिका वृद्धि, या ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रति संवेदनशीलता को प्रभावित नहीं करता है । (ए) जीवित खमीर कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान एमटीहाइपर 7 व्यक्त करता है। बाएं पैनल: mtHyPer7 488 एनएम उत्तेजना के साथ कल्पना की गई। मध्य पैनल: माइटोकॉन्ड्रिया को 250 एनएम माइटोट्रैकर रेड के साथ लेबल किया गया है। दायां पैनल: मर्ज की गई छवियां। अधिकतम तीव्रता वाले अनुमान दिखाए गए हैं। सेल की रूपरेखा सफेद रंग में दिखाई गई है। स्केल बार = 1 μm. (B, C) जंगली प्रकार की कोशिकाओं और कोशिकाओं की वृद्धि वक्र और अधिकतम वृद्धि दर जो YPD मीडिया में 2.5 mM पैराक्वाट की उपस्थिति (+PQ) या अनुपस्थिति में बढ़ी हुई mtHyPer7 को व्यक्त करती है। (D, E) एससी मीडिया में 2.5 एमएम पैराक्वाट की उपस्थिति (+पीक्यू) या अनुपस्थिति में विकसित जंगली-प्रकार और एमटीहाइपर 7-व्यक्त कोशिकाओं की वृद्धि वक्र और अधिकतम वृद्धि दर। सभी विकास वक्र तीन स्वतंत्र प्रतिकृतियों के साधन हैं। अधिकतम विकास दर को माध्य ± मानक त्रुटि (एसईएम) के रूप में दर्शाया जाता है। विकास वक्र विश्लेषण 96-वेल फ्लैट-बॉटम प्लेट के प्रत्येक कुएं में 200 μL संबंधित मीडिया में 0.0035 के OD₆₀₀ में मध्य-लॉग चरण कोशिकाओं को पतला करके किया गया था। संस्कृति के ओडी को प्लेट रीडर का उपयोग करके 72 घंटे के लिए हर 20 मिनट में मापा गया था। प्रत्येक तनाव/स्थिति को तीन प्रतियों में चढ़ाया गया था और औसत वृद्धि दर को प्लॉट किया गया था। अधिकतम वृद्धि दर (ढलान) की गणना 72 घंटे के दौरान 240 मिनट के अंतराल पर ओडी में परिवर्तन का उपयोग करके की गई थी। संक्षेप: डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; PQ = पैराक्वाट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. सेल संस्कृति और इमेजिंग के लिए तैयारी (चित्रा 4)।

इमेजिंग के लिए मध्य-लॉग चरण में सिंथेटिक माध्यम में कोशिकाओं का प्रचार करें। एक 5 एमएल मिड-लॉग चरण संस्कृति चार या पांच स्लाइडों के लिए पर्याप्त कोशिकाएं और विश्लेषण के लिए कुल >100 बुड्ड कोशिकाएं प्रदान करती है।
1. प्रयोग से एक दिन पहले सुबह में, खमीर कोशिकाओं की एक कॉलोनी के साथ 50 एमएल शंक्वाकार-तल ट्यूब में सिंथेटिक पूर्ण (एससी) माध्यम के 5 मिलीलीटर को शामिल करके तरल प्रीकल्चर तैयार करें।
2. प्रीकल्चर को 200 आरपीएम पर ऑर्बिटल शेकर में इनक्यूबेट करें और 6-8 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर करें। प्रीकल्चर के ओडी 600 को मापें, जो मध्य-लॉग चरण में होना चाहिए: ~ 0.5-1 × 10⁷ सेल / एमएल, ओडी₆₀₀ ~ 0.1-0.3।
3. अगले दिन इमेजिंग के लिए प्रीकल्चर का उपयोग करके एक मध्य-लॉग चरण संस्कृति तैयार करें। रातोंरात विकास (8-16 घंटे) के बाद मध्य-लॉग चरण संस्कृति के लिए आवश्यक प्रीकल्चर की मात्रा की गणना करें। जब कोशिकाओं को एससी माध्यम में उगाया जाता है, तो दोगुना समय ~ 2 घंटे होता है। इसलिए, 5 एमएल रातोंरात संस्कृति के टीकाकरण के लिए प्रीकल्चर की मात्रा (वी) की गणना समीकरण (1) का उपयोग करके की जाती है:
  (1)
4. चरण 2.1.3 में गणना की गई प्रीकल्चर की मात्रा के साथ 50 एमएल शंक्वाकार-तल ट्यूब में एससी माध्यम के 5 मिलीलीटर को टीका लगाएं। 8-16 घंटे के लिए 200 आरपीएम और 30 डिग्री सेल्सियस पर एक ऑर्बिटल शेकर में बढ़ें।
इमेजिंग के दिन, पुष्टि करें कि चरण 2.1.4 में उत्पन्न संस्कृति मध्य-लॉग चरण (ओडी₆₀₀ ~ 0.1-0.3) पर है। 30 सेकंड के लिए 6,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा मध्य-लॉग चरण संस्कृति के 1 एमएल से कोशिकाओं को केंद्रित करें। ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला के 10-20 μL को छोड़कर, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। माइक्रोपिपेट का उपयोग करके अवशिष्ट मीडिया के साथ धीरे से मिश्रण करके सेल गोली को पुन: निलंबित करें।
ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड से धूल हटाने के लिए एक एयर ब्लोअर या लिंट-फ्री ऊतक का उपयोग करें और स्लाइड में सेल सस्पेंशन के 1.8 μL जोड़ें। कोशिकाओं को # 1.5 (170 μm मोटी) ग्लास कवरस्लिप के साथ कवर करें, बुलबुले पेश करने से बचने के लिए कवरस्लिप को धीरे-धीरे एक कोण पर कम करें।
तुरंत छवि बनाएं और इमेजिंग के 10 मिनट के बाद स्लाइड को छोड़ दें।

चित्रा 4: सेल विकास और इमेजिंग। एमटीहाइपर 7 को व्यक्त करने वाली उभरती खमीर कोशिकाओं को मध्य-लॉग चरण में उगाया जाता है। जेड श्रृंखला छवियों को स्पिनिंग-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा एकत्र किया जाता है और फिर 3 डी पुनर्निर्माण और विश्लेषण के अधीन किया जाता है। प्रोटोकॉल अनुभाग 2-3 देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. इमेजिंग स्थितियों और छवि संग्रह का अनुकूलन (चित्रा 5)

किसी इमेजिंग मोड का चयन करें. पोस्टप्रोसेसिंग के बिना ऑप्टिकल सेक्शनिंग के लिए, एक स्पिनिंग-डिस्क कॉन्फोकल इंस्ट्रूमेंट पसंद किया जाता है। हालांकि, यदि सिग्नल कम है, या यह उपकरण अनुपलब्ध है, तो वाइड-फील्ड इमेजिंग का उपयोग करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि वाइड-फील्ड छवियों को आउट-ऑफ-फोकस ब्लर को हटाने के लिए डिकोनवोल्ड किया गया है, जैसा कि पहले³⁸ में वर्णित है।
प्रकाशिकी का चयन करें। एक उच्च-संख्यात्मक एपर्चर तेल-विसर्जन लेंस का उपयोग करें, जैसे कि 100x / 1.45 Plan-Apochromat।
उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का चयन करें। स्पिनिंग-डिस्क कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए, 405 एनएम और 488 एनएम पर लेजर उत्तेजना और एक मानक जीएफपी उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग करें। वाइड-फील्ड इमेजिंग के लिए, एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) या लैंप उत्तेजना का उपयोग करें, लेकिन सुनिश्चित करें कि फ़िल्टर सेटअप मानक जीएफपी फिल्टर के माध्यम से उत्सर्जन पारित करते समय उत्तेजना की भिन्नता की अनुमति देता है।
नोट: यह पूरा किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, जीएफपी क्यूब से उत्तेजना फ़िल्टर को हटाकर और उत्तेजना का चयन करने के लिए एलईडी या फ़िल्टर व्हील का उपयोग करके।
एक्सपोजर समय और रोशनी तीव्रता का चयन करें।
1. अधिग्रहण की स्थिति स्थापित करें जो प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल में आसानी से पता लगाने योग्य संकेत और स्वीकार्य संकल्प उत्पन्न करती है। उदाहरण के लिए, एससीएमओएस कैमरे के साथ स्पिनिंग-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर, 2 x 2 बिनिंग, 20-40% लेजर पावर और 200-600 एमएस एक्सपोजर का उपयोग करें।
2. छवि हिस्टोग्राम की जाँच करें। 12-बिट छवि (4,096 संभावित ग्रे स्तर) में, सुनिश्चित करें कि पिक्सेल मानों की कुल गतिशील सीमा संतृप्ति के बिना कम से कम कई सौ ग्रे स्तर है (चित्रा 5 ए)। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि सीमा शोर स्तर से अधिक परिमाण का एक क्रम है। एक छवि के सेल-मुक्त क्षेत्र में पिक्सेल मानों के मानक विचलन के रूप में शोर स्तर की गणना करें, जैसा कि चरण 4.1.3.1 में वर्णित है।
3. चयनित इमेजिंग स्थितियों के तहत फोटोब्लीचिंग या इमेजिंग-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल तनाव के लिए परीक्षण। यदि अत्यधिक फोटोब्लीचिंग या माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ₂में वृद्धि देखी जाती है, तो लेजर शक्ति को कम करें और एक्सपोजर या बिनिंग बढ़ाएं।
  1. माइटोकॉन्ड्रिया में सिग्नल स्थिरता और ऑक्सीडेटिव तनाव पर इमेजिंग स्थितियों के प्रभावों का आकलन करने के लिए, अधिग्रहण के बीच कोई देरी नहीं होने के साथ छवियों की एक समय-चूक श्रृंखला एकत्र करें। माइक्रोस्कोप अधिग्रहण सॉफ्टवेयर या इमेजजे का उपयोग करके, सिग्नल स्थिरता (<5% परिवर्तन) की पुष्टि करने के लिए प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल में औसत पिक्सेल मूल्य को मापें; चित्रा 5 बी)। यदि प्रयोग में टाइम-लैप्स इमेजिंग शामिल नहीं है, तो सुनिश्चित करें कि प्रतिदीप्ति दो या तीन दोहराए गए जेड स्टैक (25-35 एक्सपोजर) पर स्थिर है।
    नोट: दोनों चैनलों की प्रतिदीप्ति में कमी फोटोब्लीचिंग का संकेत दे सकती है; हालांकि, 488 एनएम-उत्तेजित चैनल में वृद्धि के साथ 405 एनएम-उत्तेजित प्रतिदीप्ति में कमी माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ₂ और ऑर्गेनेलमें इमेजिंग-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव में वृद्धि का संकेत दे सकती है।
छवियाँ प्राप्त करें. यदि जेड स्टैक एकत्र कर रहे हैं, तो सुनिश्चित करें कि जेड अंतराल डेटासेट में सभी छवियों के लिए समान है, और पूरे सेल को शामिल करें। नवोदित खमीर के लिए, 0.5 μm के Z अंतराल और 6 μm की कुल स्टैक गहराई के साथ छवि। सेल सीमाओं को दस्तावेज करने के लिए संचारित-प्रकाश छवियां प्राप्त करें।
इमेजजे³⁹ और सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर आर (चित्रा 6) के फिजी वितरण का उपयोग करते हुए, पूरक फ़ाइल 2 और https://github.com/theresaswayne/biosensor में उपलब्ध स्क्रिप्ट के माध्यम से मैन्युअल रूप से या अर्ध-स्वचालित रूप से छवियों का विश्लेषण करें। सॉफ़्टवेयर निर्देशों में, पदानुक्रमित मेनू कमांड को "|" के साथ बोल्डफेस में दिखाया गया है, जो मेनू चयन के अनुक्रम को दर्शाता है। विकल्प और बटन बोल्डफेस में दिखाए गए हैं।

चित्रा 5: इमेजिंग का अनुकूलन । (ए) सही तीव्रता सीमा के लिए छवियों और हिस्टोग्राम का मूल्यांकन। स्पिनिंग-डिस्क कॉन्फोकल छवियों के अधिकतम तीव्रता वाले अनुमान दिखाए गए हैं। छवि गतिशील सीमा को चित्रित करने के लिए हिस्टोग्राम को रैखिक वाई अक्ष (काला) और लॉग-स्केल वाई अक्ष (ग्रे) दोनों के साथ दिखाया गया है। बाएं पैनल: कम तीव्रता और गतिशील सीमा के साथ एक शोर छवि। केंद्र पैनल: एक स्वीकार्य गतिशील सीमा (~ 1,000 ग्रे स्तर) और तीव्रता के साथ एक छवि। दाएं पैनल: अत्यधिक संतृप्ति उत्पन्न करने के लिए एक छवि अनुचित रूप से कंट्रास्ट-एन्हांस्ड है। स्केल बार = 1 μm (B, C) mtHyPer7 के फोटोब्लीचिंग का विश्लेषण। लगातार जेड स्टैक को बिना किसी देरी के एकत्र किया गया था, जेड स्टैक को अभिव्यक्त किया गया था, और माइटोकॉन्ड्रिया की औसत तीव्रता को मापा गया था और पहली बार बिंदु तक सामान्यीकृत किया गया था। पहले तीन समय बिंदुओं (27 एक्सपोजर) के परिणाम दिखाए गए हैं। (बी) उत्तेजना तरंग दैर्ध्य: 405 एनएम। (सी) उत्तेजना तरंग दैर्ध्य: 488 एनएम। दिखाए गए मान तीन स्वतंत्र परीक्षणों में से प्रत्येक से तीन कोशिकाओं के औसत हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. स्क्रिप्ट के साथ अर्ध-स्वचालित विश्लेषण

बायोसेंसर विश्लेषण स्क्रिप्ट (जैसे, बायोसेंसर.आईजेएम या बायोसेंसर-इमेज-घटाव.आईजेएम) का उपयोग करके अनुपात छवियों को उत्पन्न और मापें।
1. उपयोग करने के लिए स्क्रिप्ट का चयन करें. प्रत्येक स्क्रिप्ट का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल समान है; पाठ में किसी भी अंतर को निर्दिष्ट किया जाएगा।
  1. बायोसेंसर.ijm: इस स्क्रिप्ट में, पृष्ठभूमि और शोर को उपयोगकर्ता-चयनित छवि क्षेत्रों, निश्चित मानों, या बिना घटाव का उपयोग करके ठीक किया जाता है। पृष्ठभूमि और शोर सुधार के लिए स्वतंत्र रूप से विधियों का चयन करें।
  2. बायोसेंसर-इमेज-घटाव.ijm: इस स्क्रिप्ट में, पृष्ठभूमि और शोर दोनों को एक ही उपयोगकर्ता-चयनित विधि द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जो निम्न में से एक हो सकता है: रिक्त छवि, छवि के भीतर उपयोगकर्ता-चयनित क्षेत्र, निश्चित मूल्य, या कोई सुधार नहीं।
2. फिजी में, चरण 3.5 में प्राप्त एक मल्टी-चैनल जेड स्टैक छवि खोलें। वांछित बायोसेंसर विश्लेषण स्क्रिप्ट फ़ाइल खोलें। स्क्रिप्ट संपादक विंडो में चलाएँ क्लिक करके स्क्रिप्ट चलाएँ। प्रकट होने वाली संवाद विंडो में, अनुरोधित जानकारी दर्ज करें.
  1. अनुपात गणना के लिए प्रगणक और भाजक के चैनल संख्या का चयन करें। mtHyPer7 के लिए, प्रगणक 488 nm पर उत्साहित चैनल है, और भाजक 405 nm पर उत्साहित चैनल है। यदि मौजूद है, तो संचारित-प्रकाश छवि का चैनल नंबर चुनें, या यदि कोई नहीं है तो 0 ।
  2. निम्नलिखित चार विकल्पों में से वांछित पृष्ठभूमि घटाव विधि का चयन करें। यदि पृष्ठभूमि अपेक्षाकृत समान है, तो एक छवि क्षेत्र का चयन करें, जो सीधे छवि में पृष्ठभूमि स्तर को मापता है। यदि पृष्ठभूमि पूरे क्षेत्र में काफी भिन्न होती है, तो बायोसेंसर-इमेज-घटाव.ijm स्क्रिप्ट का उपयोग करें और रिक्त छवि का चयन करें (सुधार के लिए एक रिक्त छवि एकत्र करने के लिए, सेल-मुक्त क्षेत्र में समान अधिग्रहण स्थितियों के साथ एक मल्टीचैनल जेड स्टैक कैप्चर करें, या सेल-मुक्त विकास माध्यम से बनाई गई स्लाइड से)। निश्चित मान पहले से मापा पृष्ठभूमि मान के प्रवेश की अनुमति देता है। कोई भी पृष्ठभूमि को गलत नहीं छोड़ता है, लेकिन माप की सटीकता को कम कर सकता है।
  3. वांछित शोर घटाव विधि का चयन करें। डिटेक्टर रीडआउट में यादृच्छिक भिन्नता के प्रभाव को कम करने के लिए पृष्ठभूमि-घटाए गए, नकाबपोश चैनल छवियों पर शोर मान का उपयोग कम सीमा के रूप में किया जाता है। पहले से मापा शोर स्तर के प्रवेश की अनुमति देने के लिए एक छवि क्षेत्र या निश्चित मान का चयन करें, जो आमतौर पर अच्छी तरह से काम करता है क्योंकि इमेजिंग स्थितियों को स्थिर रखने पर शोर का स्तर स्थिर होता है। वैकल्पिक रूप से, कोई नहीं चुनें और निचली सीमा के रूप में 1 के मान का उपयोग करें, जो माप की परिवर्तनशीलता को बढ़ा सकता है।
  4. माइटोकॉन्ड्रिया का सटीक और लगातार पता लगाने के लिए एक थ्रेशोल्डिंग एल्गोरिदम का चयन करें; ओत्सु या मैक्सएन्ट्रॉपी की सिफारिश की जाती है। आदर्श रूप से, एक प्रयोग में सभी छवियों के लिए एक ही एल्गोरिथ्म का उपयोग करें, लेकिन माइटोकॉन्ड्रिया की सटीक पहचान सुनिश्चित करें। यदि किसी प्रयोग के दौरान आकृति विज्ञान में परिवर्तन होते हैं तो एक अलग थ्रेशोल्डिंग विधि का उपयोग करें।
  5. प्रति सेल रुचि के क्षेत्रों (आरओआई) की संख्या का चयन करें। उदाहरण के लिए, यदि माँ-कली के अंतर को मापते हैं, तो 2 का चयन करें।
  6. आउटपुट फ़ोल्डर का चयन करें जहां माप और अनुपात चित्र सहेजे जाएंगे।
3. पृष्ठभूमि और शोर सुधार के लिए संकेतों का पालन करें।
  1. क्षेत्र चयन (यदि लागू हो): यदि पृष्ठभूमि या शोर माप के लिए एक छवि क्षेत्र का चयन किया गया था, तो आयत आरओआई उपकरण का उपयोग करके पृष्ठभूमि क्षेत्र (किसी भी सेल या फ्लोरोसेंट कलाकृतियों के बाहर) खींचने के लिए संकेतों का पालन करें। क्षेत्र आरेखित करने के बाद, OK क्लिक करें.
  2. निश्चित मान प्रविष्टि (यदि लागू हो): यदि पृष्ठभूमि या शोर माप के लिए निश्चित मान चुना गया था, तो प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल के लिए पृष्ठभूमि और / या शोर मान दर्ज करने के लिए संकेतों का पालन करें।
  3. रिक्त संदर्भ छवि (यदि लागू हो): बायोसेंसर-इमेज-घटाव.ijm स्क्रिप्ट में, यदि रिक्त छवि को पृष्ठभूमि या शोर सुधार के लिए चुना गया था, तो रिक्त छवि फ़ाइल का चयन करने के लिए संकेतों का पालन करें।
4. माप के लिए आरओआई चिह्नित करें। मध्य-लॉग चरण संस्कृतियों में, विश्लेषण को बुड्ड कोशिकाओं तक सीमित करें।
  1. उज्ज्वल-क्षेत्र छवि के आधार पर अलग-अलग कोशिकाओं या उपकोशिकीय क्षेत्रों के अनुरूप आरओआई खींचें। आरओआई को सेल की रूपरेखा से बिल्कुल मेल नहीं खाना है, क्योंकि आरओआई के भीतर केवल थ्रेशोल्ड माइटोकॉन्ड्रिया को मापा जाएगा। वैकल्पिक रूप से, पहले सहेजे गए ROI सेट को खोलें: ROI प्रबंधक में, अधिक क्लिक करें, फिर ROI फ़ाइल का चयन करें।
  2. चयनित ROI को ROI प्रबंधक में जोड़ने के लिए प्रत्येक ROI बनाने के बाद T दबाएँ। ROI प्रबंधक में, चिह्नित कक्षों को दस्तावेज़ीकृत करने के लिए सभी दिखाएँ की जाँच करें. प्रत्येक जोड़ा गया क्षेत्र ROI प्रबंधक सूची में एक क्रमांकित आइटम के रूप में दिखाई देगा. यदि प्रति सेल एक से अधिक आरओआई (जैसे, मां और कली) का विश्लेषण करते हैं, तो विश्लेषण किए गए प्रत्येक सेल के लिए आरओआई को समान क्रम में चिह्नित करें।
  3. ROI प्रबंधक में सभी वांछित ROI जोड़े जाने के बाद, चिह्न कक्ष संवाद विंडो में ठीक क्लिक करें.
5. माप तालिका स्वरूप चुनें. प्रकट होने वाली मल्टीमाप संवाद विंडो में, सभी स्लाइस मापें की जाँच करें. वांछित प्रारूप के साथ तालिका बनाने के लिए प्रति टुकड़ा एक पंक्ति विकल्प की जाँच करें। process_multiROI_tables का उपयोग करें। एक पंक्ति प्रति स्लाइस विकल्प के साथ बनाई गई तालिकाओं को संसाधित करने के लिए आर स्क्रिप्ट; एपेंड परिणाम की जांच न करें। इस चरण 3x को दोहराएं (प्रगणक [488], भाजक [405], और अनुपात [488/405] छवियों के माप के लिए)।
6. स्क्रिप्ट आउटपुट फ़ाइलों को चरण 4.1.2.6 में चयनित फ़ोल्डर में सहेजेगी।
प्रत्येक क्षेत्र या सेल के लिए भारित माध्य अनुपात की गणना
1. पिछले चरण में प्राप्त परिणामों का उपयोग करके, समीकरण (2) का उपयोग करके प्रत्येक क्षेत्र या सेल के लिए भारित माध्य अनुपात की गणना करें। या तो "पिक्सेलवाइज" या "क्षेत्रवार" अनुपात की गणना करें (विवरण के लिए चर्चा देखें)।
  (2)
  नोट: क्षेत्र और एकीकृत घनत्व (IntDen) मूल्यों में थ्रेशोल्ड माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर केवल पिक्सेल शामिल हैं। इस गणना को process_multiROI_tables का उपयोग करके स्वचालित किया जा सकता है। आर स्क्रिप्ट और आर सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर।
एक रंगीन अनुपात छवि उत्पन्न करें। चूंकि तीव्रता में परिवर्तन की तुलना में मानव आंखों के लिए रंग (रंग) में परिवर्तन अधिक स्पष्ट हैं, इसलिए आसान दृश्य व्याख्या के लिए अनुपात मूल्य को रंग पैमाने में परिवर्तित करें। colorize_ratio_image.ijm स्क्रिप्ट एक नकाबपोश अनुपात छवि को रंगीन करेगी।
1. फिजी में, चरण 4.1.6 में उत्पन्न अनुपात जेड स्टैक छवि खोलें। colorize_ratio_image.ijm स्क्रिप्ट फ़ाइल खोलें। स्क्रिप्ट संपादक विंडो में चलाएँ क्लिक करके स्क्रिप्ट चलाएँ। प्रकट होने वाली संवाद विंडो में, अनुरोधित जानकारी दर्ज करें.
  1. रंगीकरण विधि: अनमॉड्यूलेटेड विकल्प में, सभी माइटोकॉन्ड्रियल पिक्सेल एक ही चमक पर दिखाई देते हैं। हालांकि, कुछ छवियां शोर दिखाई दे सकती हैं क्योंकि मंद और उज्ज्वल पिक्सेल दोनों अनुपात छवि में योगदान करते हैं। इस प्रभाव को कम करने के लिए, तीव्रता मॉड्यूलेटेड विकल्प का उपयोग करें।
  2. न्यूनतम और अधिकतम प्रदर्शित मान: ये मान रंगीन होने वाले अनुपात मानों की श्रेणी को नियंत्रित करते हैं। एक प्रयोग में देखे गए औसत न्यूनतम और अधिकतम मानों के पास मान चुनें (चरण 4.2.1 में गणना किए गए भारित माध्य अनुपात के आधार पर)। एक प्रयोग के भीतर, समान इमेजिंग स्थितियों के साथ सभी छवियों को प्राप्त करना सुनिश्चित करें और समान न्यूनतम और अधिकतम मूल्यों के साथ सभी छवियों को प्रदर्शित करें।
  3. प्रोजेक्शन मोड: जेड स्टैक को पूरी माइटोकॉन्ड्रियल आबादी दिखाने के लिए अनुमानों के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। प्रक्षेपण रंग से पहले बनाया गया है। अधिकतम-तीव्रता प्रक्षेपण (अधिकतम अनुपात और तीव्रता मूल्यों को संरक्षित करना) या औसत-तीव्रता प्रक्षेपण के लिए औसत के लिए अधिकतम का चयन करें।
  4. आउटपुट फ़ोल्डर: उस फ़ोल्डर का चयन करें जिसमें रंगीन छवियों को सहेजना है।
2. यदि अनमॉड्यूलेटेड विकल्प का चयन किया गया था, तो रंग योजना (लुकअप तालिका; लुकअप तालिका) का चयन करें। LUT) प्रकट होने वाली संवाद विंडो में। फिजी में निर्मित फायर या रेनबो आरजीबी एलयूटी, या इमेजजे के .lut प्रारूप (LUT फ़ाइल से आयात) में किसी भी वांछित LUT का उपयोग करें। इंद्रधनुष चिकनी⁴⁰ एलयूटी की सिफारिश की जाती है ( पूरक फ़ाइल 2 और गिटहब पर शामिल है)।
3. स्क्रिप्ट आउटपुट फ़ाइलों को चरण 4.3.1.4 में चयनित फ़ोल्डर में सहेजता है। इनमें रंगीन अनुपात छवि (Color_RGB.tif) और अंशांकन पट्टी के साथ रंगीन अनुपात छवि शामिल है जो अनुपात मूल्यों और छवि रंग (Color_with_bar.tif) के बीच पत्राचार दिखाती है।

5. मैनुअल विश्लेषण

नोट: इस दृष्टिकोण में अधिक समय लगता है लेकिन प्रीप्रोसेसिंग और दहलीज निर्धारित करने में लचीलापन की अनुमति देता है।

पृष्ठभूमि के लिए सही.
1. फिजी में विकल्प सेट करें।
  1. विश्लेषण पर क्लिक करें | माप सेट करें. प्रकट होने वाली संवाद विंडो में, क्षेत्र, मीन, StdDev, IntDen, और प्रदर्शन लेबल के लिए बॉक्स चेक करें। दशमलव स्थानों को 3 पर सेट करें।
  2. संपादन पर क्लिक करें | विकल्प | इनपुट/आउटपुट। प्रकट होने वाली संवाद विंडो में, पंक्ति संख्यासहेजें और स्तंभ शीर्षलेख सहेजें के लिए बॉक्स चेक करें.
2. अनुपात गणना की संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए, प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल से पृष्ठभूमि को घटाएं। यदि पृष्ठभूमि अपेक्षाकृत समान है, तो एक छवि में सेल-मुक्त क्षेत्र की औसत तीव्रता को मापें, और इस मान को पूरी छवि से घटाएं (चरण 5.1.2.1)। वैकल्पिक रूप से, यदि पृष्ठभूमि फ़ील्ड में काफी भिन्न होती है, तो सुधार के लिए एक रिक्त छवि का उपयोग करें (चरण 5.1.2.2.)।
  1. उपयोगकर्ता-चयनित क्षेत्र को घटाने के लिए, छवि पर क्लिक करें | रंग | चैनलों को विभाजित करें, और सभी चैनल छवियों को खुला रखें, क्योंकि बाद में उनकी आवश्यकता होगी। प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल के लिए, पृष्ठभूमि (किसी भी कोशिका के बाहर) पर एक आरओआई खींचें और विश्लेषण पर क्लिक करें माप, या ढेर के लिए, छवि पर क्लिक करें | ढेर | स्टैक को मापें। परिणाम तालिका में प्रकट होने वाले ROI के माध्य मान का निरीक्षण करें। संपादन पर क्लिक करें | कोई नहीं का चयन करें, फिर प्रक्रिया | गणित | घटाएं। प्रकट होने वाली संवाद विंडो में, मापा गया माध्य पृष्ठभूमि मान दर्ज करें, जो निकटतम पूर्णांक पर गोल है।
    नोट: राउंडिंग बाद में बाइनरी ऑपरेशन के साथ त्रुटियों को रोकता है।
  2. डेटा फ़ाइल से रिक्त छवि को घटाने के लिए, पूरी तरह से सेल-मुक्त दृश्य क्षेत्र से या सेल-मुक्त विकास माध्यम से तैयार स्लाइड से एक रिक्त छवि एकत्र करें। प्रक्रिया पर क्लिक करें | छवि कैलकुलेटर. प्रकट होने वाली संवाद विंडो में, कार्रवाई को घटाने के लिए सेट करें, और छवि 1 और छवि 2 को क्रमशः सेल छवि और रिक्त छवि पर सेट करें। नई विंडो और 32-बिट परिणाम बनाएँ की जाँच करें।
विश्लेषण को माइटोकॉन्ड्रिया तक सीमित करने के लिए, विभाजन करें। क्योंकि प्रत्येक चैनल बायोसेंसर की स्थिति के आधार पर तीव्रता बदल सकता है, माइटोकॉन्ड्रिया के क्षेत्र को लगातार परिभाषित करने के लिए दो चैनलों के योग का उपयोग करें।
1. योग छवि बनाने के लिए, प्रक्रिया पर क्लिक करें | छवि कैलकुलेटर. प्रकट होने वाली संवाद विंडो में, ऑपरेशन को जोड़ें पर सेट करें, और छवि 1 और छवि 2 को किसी भी क्रम में दो पृष्ठभूमि-घटाए गए फ्लोरोसेंट चैनलों पर सेट करें। नई विंडो और 32-बिट परिणाम बनाएँ की जाँच करें और एक योग छवि दिखाई देने की प्रतीक्षा करें।
2. योग छवि पर माइटोकॉन्ड्रिया को परिभाषित करने के लिए दहलीज सेट करें।
  1. छवि पर क्लिक करें | समायोजित करें | दहलीज। दिखाई देने वाली थ्रेशोल्ड विंडो में, डार्क बैकग्राउंड और स्टैक हिस्टोग्राम की जांच करें। विधि को वांछित एल्गोरिथ्म पर सेट करें (उदाहरण के लिए, ओत्सु या मैक्सएन्ट्रॉपी)। प्रजनन क्षमता के लिए स्वचालित थ्रेशोल्डिंग को नियोजित करें, लेकिन यदि कोई स्वचालित विधि उपयुक्त नहीं है, तो मैन्युअल रूप से दहलीज को समायोजित करें।
    नोट: आदर्श रूप से, एक प्रयोग में सभी छवियों के लिए एक ही एल्गोरिथ्म का उपयोग किया जाना चाहिए, लेकिन एक प्रयोग के दौरान आकृति विज्ञान में परिवर्तन कुछ स्थितियों में एक अलग थ्रेशोल्डिंग विधि की आवश्यकता हो सकती है।
  2. जब सीमा संतोषजनक हो, तो लागू करें क्लिक करें. प्रकट होने वाली संवाद विंडो में, मास्क में कनवर्ट करें चुनें. प्रकट होने वाली संवाद विंडो में, काली पृष्ठभूमि की जाँच करें और अन्य बक्से को अनियंत्रित छोड़ दें। विभाजन सटीकता के मूल्यांकन के लिए परिणामी मुखौटा छवि सहेजें।
3. प्रोसेस पर क्लिक करके मास्क मान को क्रमशः 0 और 255 से 0 और 1 में परिवर्तित करें गणित | विभाजित करें। मान को 255 पर सेट करें, और संकेत दिए जाने पर, सभी छवियों को संसाधित करने के लिए विकल्प का चयन करें।
4. प्रोसेस पर क्लिक करके पृष्ठभूमि-घटाए गए प्रतिदीप्ति चैनलों पर मास्क लागू करें छवि कैलकुलेटर. प्रकट होने वाली संवाद विंडो में, कार्रवाई को गुणा करने के लिए सेट करें। छवि 1 और छवि 2 को क्रमशः प्रगणक चैनल और मास्क पर सेट करें। नई विंडो और 32-बिट परिणाम बनाएँ की जाँच करें; भाजक चैनल के साथ मुखौटा गुणन दोहराएं।
5. पृष्ठभूमि पिक्सेल को NaN ("संख्या नहीं") पर सेट करके अनुपात गणना के लिए प्रत्येक नकाबपोश चैनल तैयार करें।
  1. नकाबपोश गणनाकार चैनल का चयन करें और छवि पर क्लिक करें | समायोजित करें | दहलीज। थ्रेशोल्ड विंडो में, सेट क्लिक करें, और प्रकट होने वाली संवाद विंडो में, परिकलित शोर स्तर या 1 पर न्यूनतम सेट करें, और अधिकतम को वैसा ही छोड़ दें जैसा वह है.
  2. थ्रेशोल्ड विंडो में, लागू करें क्लिक करें. अगले संवाद बॉक्स में, NaN पर सेट करें चुनें. नकाबपोश भाजक चैनल के लिए दोहराएं।
अनुपात छवि उत्पन्न करें।
1. प्रक्रिया पर क्लिक करें | छवि कैलकुलेटर. प्रकट होने वाली संवाद विंडो में, विभाजन करने के लिए कार्रवाई सेट करें. छवि 1 और छवि 2 को क्रमशः पृष्ठभूमि-घटाए गए नकाबपोश प्रगणक और भाजक चैनलों पर सेट करें। mtHyPer7 के लिए, प्रगणक 488 nm पर उत्तेजित ऑक्सीकृत रूप है, और भाजक 405 nm पर उत्तेजित कम रूप है। इसलिए, उच्च अनुपात उच्च एच 2 ओ₂का संकेत देते_हैं।
2. नई विंडो और 32-बिट परिणाम बनाएँ की जाँच करें। विश्लेषण के लिए अनुपात छवि सहेजें।
रुचि के क्षेत्रों को चिह्नित करें और उनकी मात्रा निर्धारित करें। प्रत्येक सेल या उपकोशिकीय क्षेत्र को आरओआई प्रबंधक में आरओआई के रूप में चुना और संग्रहीत किया जाता है। आरओआई को पूरी तरह से सेल की रूपरेखा से मेल नहीं खाना पड़ता है, क्योंकि केवल नकाबपोश माइटोकॉन्ड्रिया क्षेत्रों को मापा जाएगा।
1. पूर्वाग्रह को रोकने के लिए संचारित-प्रकाश छवि का उपयोग करके, व्यक्तिगत कोशिकाओं (या उपकोशिकीय क्षेत्रों) के अनुरूप आरओआई बनाएं। मध्य-लॉग चरण संस्कृतियों में, विश्लेषण को खमीर कोशिकाओं वाले कलियों तक सीमित करें, जो सक्रिय रूप से कोशिका विभाजन में लगे हुए हैं। ROI प्रबंधक में जोड़ने के लिए प्रत्येक ROI बनाने के बाद T दबाएँ। चिह्नित किए गए कक्षों को दस्तावेज़ीकृत करने के लिए सभी दिखाएँ की जाँच करें.
2. ऊपर बनाई गई अनुपात छवि पर क्लिक करें, और आरओआई प्रबंधक में, अधिक क्लिक करें ... | मल्टीमेजर। प्रकट होने वाली संवाद विंडो में, सभी स्लाइस मापें जाँचें. एपेंड परिणाम की जांच न करें। वांछित प्रारूप के साथ तालिका बनाने के लिए प्रति टुकड़ा एक पंक्ति विकल्प की जाँच करें। process_multiROI_tables। आर स्क्रिप्ट आर सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर में एक पंक्ति प्रति टुकड़ा विकल्प के साथ बनाई गई तालिकाओं को संसाधित करेगी।
3. परिणामों को सहेजें. परिणाम विंडो पर क्लिक करें, फिर फ़ाइल | सहेजें, और परिणाम तालिका को .csv या .xls स्वरूप में सहेजें. छवि नाम से मेल खाने के लिए फ़ाइल नाम सेट करें।
4. ROI सहेजें. ROI प्रबंधक में, पहले सुनिश्चित करें कि कोई ROI चयनित नहीं है: Desselect पर क्लिक करें, फिर अधिक | सहेजें. छवि के साथ माप को क्रॉस-संदर्भित करने के लिए फिजी में मूल छवि के साथ सहेजे गए आरओआई खोलें।
पिछले चरण और समीकरण (3) में प्राप्त परिणामों का उपयोग करके प्रति सेल या क्षेत्र भारित माध्य अनुपात की गणना करें। या तो "पिक्सेलवाइज" या "क्षेत्रवार" अनुपात की गणना करें (विवरण के लिए चर्चा देखें)।
(3)
नोट: क्षेत्र और एकीकृत घनत्व मूल्यों में थ्रेशोल्ड माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर केवल पिक्सेल शामिल हैं। इस गणना को process_multiROI_tables का उपयोग करके स्वचालित किया जा सकता है। आर सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर में आर स्क्रिप्ट।
एक रंगीन अनुपात छवि उत्पन्न करें।
नोट: रंगीन छवियों को अनमॉड्यूलेटेड किया जा सकता है, जहां सभी माइटोकॉन्ड्रियल पिक्सेल एक ही चमक पर दिखाई देते हैं, या तीव्रता-मॉड्यूलेटेड, जहां मूल छवि में पिक्सेल तीव्रता का उपयोग रंगीन छवि में तीव्रता सेट करने के लिए किया जाता है।
1. एक अनियंत्रित रंगीन छवि बनाने के लिए:
  1. ऊपर उत्पन्न अनुपात छवि खोलें। छवि पर क्लिक करें | छवि की एक प्रतिलिपि उत्पन्न करने के लिए डुप्लिकेट करें, फिर मूल छवि को बंद करें।
  2. यदि छवि एक जेड स्टैक है, तो या तो एक टुकड़ा चुनें, या सभी माइटोकॉन्ड्रिया को देखने के लिए जेड प्रोजेक्शन उत्पन्न करें। या तो अधिकतम-तीव्रता (प्रत्येक XY पिक्सेल समन्वय पर अधिकतम अनुपात और तीव्रता मान को बनाए रखना) या औसत-तीव्रता प्रक्षेपण का उपयोग करें।
  3. छवि पर क्लिक करें | तालिकाओं को देखें और एलयूटी को वांछित रंग योजना पर सेट करें (उदाहरण के लिए, इंद्रधनुष आरजीबी या फायर [इमेजजे में डिफ़ॉल्ट रूप से उपलब्ध])। वैकल्पिक रूप से, फ़ाइल पर क्लिक करें | LUT आयात करें और ImageJ के .lut स्वरूप में किसी भी वांछित LUT का चयन करें, जैसे कि इंद्रधनुष चिकनी⁴⁰ (पूरक फ़ाइल 2 और GitHub पर शामिल)। सुनिश्चित करें कि LUT में 0 मान को सौंपा गया एक गहरा रंग है।
  4. इमेज पर क्लिक करके डिस्प्ले कंट्रास्ट सेट करें | समायोजित करें | चमक/कंट्रास्ट। चमक/कंट्रास्ट विंडो में, सेट क्लिक करें, और प्रकट होने वाली संवाद विंडो में, न्यूनतम और अधिकतम प्रदर्शित मानों के लिए वांछित मान दर्ज करें. देखे गए रंग अंतर को अधिकतम करने के लिए, इन्हें सभी छवियों में प्राप्त न्यूनतम और अधिकतम पर सेट करें। एक प्रयोग में सभी छवियों को एक ही विपरीत स्तर पर सेट करें।
    नोट: लागू करें क्लिक न करें, क्योंकि यह पिक्सेल मानों को बदल देगा और अगले चरण में एक सटीक अंशांकन पट्टी की पीढ़ी को रोक देगा।
  5. विश्लेषण पर क्लिक करके एक रंग अंशांकन पट्टी जोड़ें | उपकरण | अंशांकन पट्टी. दिखाई देने वाली संवाद विंडो में, छवि पर क्लिक करके, बार को हटाने के लिए ओवरले विकल्प की जांच करें। ओवरले | ओवरले को हटा दें।
  6. यदि वांछित हो, तो विश्लेषण पर क्लिक करके एक स्केल बार जोड़ें | उपकरण | स्केल बार. प्रकट होने वाली संवाद विंडो में, पट्टी के लिए वांछित आकार, स्थान और रंग सेट करें. उपयोग किए गए एलयूटी की परवाह किए बिना बार के रंग को बनाए रखने के लिए ओवरले विकल्प की जांच करें।
  7. छवि पर क्लिक करके प्रकाशन के लिए एक आरजीबी छवि उत्पन्न करें | ओवरले | चपटा. परिणामी छवि सहेजें।
    नोट: यह छवि केवल प्रस्तुति या प्रकाशन के लिए है। तीव्रता मान बदल जाते हैं, इसलिए इसे मापा नहीं जा सकता है। छवि पर सलाखों को स्थायी रूप से जला दिया जाता है।
2. तीव्रता मॉड्यूलेटेड छवि बनाने के लिए:
  1. छवि पर क्लिक करें | छवि की एक प्रति उत्पन्न करने के लिए डुप्लिकेट करें, फिर मूल बंद करें।
  2. यदि छवि एक जेड स्टैक है, तो या तो एक टुकड़ा चुनें या सभी माइटोकॉन्ड्रिया को देखने के लिए जेड प्रोजेक्शन उत्पन्न करें।
  3. छवि पर क्लिक करके अनुपात छवि का प्रदर्शन कंट्रास्ट सेट करें | समायोजित करें | ब्राइटनेस/कंट्रास्ट, और ब्राइटनेस/कंट्रास्ट विंडो में, सेट करें क्लिक करें. प्रकट होने वाली संवाद विंडो में, न्यूनतम और अधिकतम प्रदर्शित मानों के लिए वांछित मान दर्ज करें. देखे गए रंग अंतर को अधिकतम करने के लिए, इन्हें सभी छवियों में प्राप्त लगभग न्यूनतम और अधिकतम पर सेट करें, और एक प्रयोग में सभी छवियों को एक ही विपरीत स्तरों पर सेट करें। पिक्सेल मानों को पुन: स्केल करने के लिए लागू करें क्लिक करें.
  4. अंशांकन पट्टी बनाने के लिए, इस उन्नत छवि को डुप्लिकेट करें, और विश्लेषण करने के लिए नेविगेट करके एक बार उत्पन्न करें | उपकरण | अंशांकन पट्टी. छवि पर क्लिक करके छवि और ओवरले को आरजीबी प्रारूप में परिवर्तित करें ओवरले | चपटा. यदि वांछित हो, तो प्रस्तुति या प्रकाशन के लिए चरण 5.6.2.12 में प्राप्त तीव्रता-मॉड्यूलेटेड आरजीबी छवि पर इस पट्टी को चिपकाएँ।
  5. फ़ाइल पर क्लिक करके छवि के समान चौड़ाई और ऊंचाई के साथ एक नई छवि बनाएं | नया | छवि...। खुलने वाली संवाद विंडो में, पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें: प्रकार: RGB; के साथ भरें: काला; चौड़ाई और ऊंचाई: छवि की 9 चौड़ाई और ऊंचाई); स्लाइस: 1.
  6. छवि पर क्लिक करके नए स्टैक को एचएसबी (रंग, संतृप्ति, चमक) छवि स्टैक में परिवर्तित करें प्रकार | एचएसबी स्टैक।
  7. संपादन पर नेविगेट करके कंट्रास्ट-समायोजित अनुपात छवि पर क्लिक करें | सभी का चयन करें, फिर संपादित करें | कॉपी करें। फिर, एचएसबी स्टैक पर क्लिक करें, पहले स्लाइस (ह्यू) का चयन करें, और संपादित करें पर क्लिक करें । अनुपात मानों को स्थानांतरित करने के लिए चिपकाएँ।
  8. एचएसबी स्टैक के स्लाइस 2 (संतृप्ति) का चयन करें। संपादित करने के लिए नेविगेट करके अग्रभूमि रंग को सफेद पर सेट करें | विकल्प | रंग. संपादन पर क्लिक करें | सभी का चयन करें, फिर संपादित करें | भरें और खुलने वाली संवाद विंडो में, केवल वर्तमान स्लाइस को सफेद रंग से भरने के लिए नहीं का चयन करें.
  9. कच्चे डेटा छवि खोलें और छवि पर क्लिक करके चैनलों को विभाजित करें रंग | विभाजित चैनल.
  10. छवि कैलकुलेटर का उपयोग करके दो अनुपात चैनलों का औसत उत्पन्न करें और प्रक्रिया पर क्लिक करें | छवि कैलकुलेटर. प्रकट होने वाली संवाद विंडो में, ऑपरेशन को औसत पर सेट करें, और छवि 1 और छवि 2 को क्रमशः प्रगणक और भाजक छवियों पर सेट करें। नई विंडो बनाएँ की जाँच करें.
  11. संपादित करने के लिए नेविगेट करके ऊपर बनाई गई औसत छवि पर क्लिक करें | सभी का चयन करें, फिर संपादित करें | कॉपी करें। फिर, एचएसबी स्टैक पर क्लिक करें, तीसरे स्लाइस (मान) का चयन करें, और संपादित करें पर क्लिक करें । तीव्रता मूल्यों को स्थानांतरित करने के लिए चिपकाएं।
  12. छवि पर क्लिक करके एचएसबी स्टैक को आरजीबी रंग स्थान में परिवर्तित करें प्रकार | आरजीबी रंग। परिणामी छवि सहेजें।

चित्रा 6: छवि विश्लेषण और प्रस्तुति का योजनाबद्ध। स्पिनिंग-डिस्क कॉन्फोकल छवियों को पहले पृष्ठभूमि-घटाया जाता है। माइटोकॉन्ड्रिया को थ्रेशोल्डिंग द्वारा विभाजित किया जाता है और प्रत्येक स्लाइस के लिए मास्क में परिवर्तित किया जाता है। ये मास्क दोनों चैनलों पर लागू होते हैं और नकाबपोश छवियों का उपयोग अनुपात छवि की गणना करने के लिए किया जाता है। आरओआई कोशिकाओं या उपकोशिकीय क्षेत्रों में mtHyPer7 अनुपात को मापने के लिए तैयार किए जाते हैं। डेटा प्रस्तुति के लिए रंगीन अनुपात छवियां भी उत्पन्न की जा सकती हैं। स्केल बार = 1 μm। संक्षिप्त नाम: ROI = रुचि का क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Representative Results

यह पुष्टि करने के लिए कि mtHyPer7 माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ₂का आकलन करने के लिए एक उपयुक्त जांच है, mtHyPer7 के स्थानीयकरण और खमीर माइटोकॉन्ड्रिया और सेल स्वास्थ्य पर इसके प्रभाव का मूल्यांकन किया गया था। एमटीहाइपर 7 के लक्ष्यीकरण का आकलन करने के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया को खमीर कोशिकाओं और खमीर को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण माइटोकॉन्ड्रिया-विशिष्ट डाई मिटोट्रैकर रेड के साथ दाग दिया गया था जो एमटीहाइपर 7 को व्यक्त करते हैं। माइटोट्रैकर रेड स्टेनिंग का उपयोग करते हुए, माइटोकॉन्ड्रिया को लंबे ट्यूबलर संरचनाओं के रूप में हल किया गया था जो मदर-बड अक्ष के साथ संरेखित होते थे और कली के सिरे और मदर सेल डिस्टल के सिरे में जमा होते^थे। माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान नियंत्रण और mtHyPer7-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में समान था। इसके अलावा, एमटीहाइपर 7 मिटोट्रैकर लाल-दाग वाले माइटोकॉन्ड्रिया (चित्रा 3 ए) के साथ सह-स्थानीयकृत है। इस प्रकार, एमटीहाइपर 7 को सामान्य माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान या वितरण को प्रभावित किए बिना माइटोकॉन्ड्रिया को कुशलतापूर्वक और मात्रात्मक रूप से लक्षित किया गया था।

इसके बाद, सेलुलर फिटनेस और माइटोकॉन्ड्रिया में ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रति संवेदनशीलता पर एमटीहाइपर 7 के प्रभाव का आकलन करने के लिए अतिरिक्त सत्यापन प्रयोग किए गए थे। समृद्ध या सिंथेटिक ग्लूकोज-आधारित मीडिया (वाईपीडी या एससी, क्रमशः) में एमटीहाइपर 7-व्यक्त कोशिकाओं की वृद्धि दर अपरिवर्तित जंगली-प्रकार की कोशिकाओं (चित्रा 3 बी, डी) के समान है। माइटोकॉन्ड्रिया में ऑक्सीडेटिव तनाव पर संभावित प्रभावों का आकलन करने के लिए, नियंत्रण और एमटीहाइपर 7-व्यक्त खमीर का इलाज पैराक्वाट के निम्न स्तर के साथ किया गया था, एक रेडॉक्स-सक्रिय छोटा अणु जो माइटोकॉन्ड्रिया में जमा होता है और इसके परिणामस्वरूप ऑर्गेनेल^24,27 में ऊंचा सुपरऑक्साइड स्तर होता है। यदि एमटीहाइपर 7 अभिव्यक्ति या तो माइटोकॉन्ड्रिया में ऑक्सीडेटिव तनाव को प्रेरित करती है या माइटोकॉन्ड्रिया को ऑक्सीडेटिव तनाव से बचाती है, तो एमटीहाइपर 7-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को क्रमशः पैराक्वाट उपचार के लिए बढ़ी हुई या कम संवेदनशीलता प्रदर्शित करनी चाहिए। पैराक्वाट के निम्न स्तर के साथ उपचार के परिणामस्वरूप खमीर विकास दर में कमी आई। इसके अलावा, पैराक्वाट की उपस्थिति में जंगली-प्रकार और एमटीहाइपर 7-व्यक्त कोशिकाओं की वृद्धि दर समान थी (चित्रा 3 सी, ई)। इसलिए, बायोसेंसर की अभिव्यक्ति ने नवोदित खमीर कोशिकाओं में महत्वपूर्ण सेलुलर तनाव पैदा नहीं किया या माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव तनाव के लिए खमीर की संवेदनशीलता को बदल दिया।

इस सबूत को देखते हुए कि एमटीहाइपर 7 उभरते खमीर में माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ 2 का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है, यह परीक्षण किया गया था कि क्या एमटीहाइपर 7 मध्य-लॉग चरण जंगली-प्रकार के खमीर में माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ 2 और बाहरी रूप से जोड़े गए एच 2 ओ₂ द्वारा प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ ₂ में परिवर्तन का पता लगा सकता है। एक एच2 ओ₂ अनुमापन प्रयोग किया गया था और माइटोकॉन्ड्रिया में औसत ऑक्सीकृत: कम (ओ / आर) एमटीएचवाईपर 7 अनुपात मापा गया था।

स्वचालित विश्लेषण स्क्रिप्ट ने कई आउटपुट फ़ाइलों का उत्पादन किया।

अनुपात छवि (अनुपात.tif): एक जेड स्टैक जिसमें पृष्ठभूमि-सही किए गए अनुपात शामिल हैं, थ्रेशोल्ड 488 एनएम और 405 एनएम स्टैक। इस स्टैक को अतिरिक्त प्रसंस्करण के बिना फिजी में देखा जा सकता है; हालांकि, देखने से पहले प्रोटोकॉल चरण 4.3 या 5.6 में वर्णित छवि के कंट्रास्ट को बढ़ाने और / या रंग देने की सिफारिश की जाती है।

मुखौटा छवि (मुखौटा.tif): एक जेड स्टैक जिसमें विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले थ्रेशोल्ड माइटोकॉन्ड्रियल क्षेत्र शामिल हैं। थ्रेशोल्डिंग की सटीकता का मूल्यांकन करने के लिए इस छवि का उपयोग किया जाना चाहिए।

विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले आरओआई (आरओआई.zip): जब यह फ़ाइल फिजी में खोली जाती है, तो स्रोत छवि के साथ, आरओआई को परिणाम तालिका और स्रोत छवि को क्रॉस-संदर्भ ति करने के लिए छवि पर सुपरइम्पोज किया जाता है। प्रत्येक ROI को एक सेल नंबर और ROI नंबर के साथ नाम दिया गया है।

मापन तालिकाएँ (NumResults.csv, DenomResults.csv, परिणाम.csv) जिसमें क्रमशः गणनाकार, भाजक और अनुपात छवियों में प्रत्येक टुकड़े के लिए थ्रेशोल्ड माइटोकॉन्ड्रिया का क्षेत्र, माध्य और एकीकृत घनत्व होता है। स्लाइस में जहां माइटोकॉन्ड्रिया अनुपस्थित थे या फोकस से बाहर थे, एनएएन दर्ज किया जाता है।

पृष्ठभूमि और शोर सुधार, थ्रेशोल्डिंग और अनुपात गणना के लिए उपयोग किए जाने वाले विकल्पों का दस्तावेजीकरण करने वाली एक लॉग फ़ाइल (लॉग.txt)।

mtHyPer7 के O/R अनुपात ने H2_O2सांद्रता के लिए एक खुराक-निर्भर प्रतिक्रिया दिखाई, जो 1-2 mM पर एक पठार तक पहुंच गई, जिसे बाहरी रूप से H 2 O₂ (चित्रा 7) जोड़ा गया। हैरानी की बात है, नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में 0.1 mM H₂_O2 के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं में HyPer7 अनुपात कम था, हालांकि यह अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था। इस घटना के लिए एक स्पष्टीकरण एक होर्मेसिस प्रतिक्रिया हो सकती है, जिसमें तनाव के निम्न स्तर के संपर्क में तनाव प्रतिक्रियाएं हो सकती हैं, जैसे कि एंटीऑक्सिडेंट तंत्र, जो बदले में जांच द्वारा पता लगाने योग्य आरओएस की मात्रा को कम करता है। इसके विपरीत, तनाव के उच्च स्तर, आंतरिक तनाव प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं और इसके परिणामस्वरूप हाइपर 7 से उच्च रीडआउट हो सकता है।

चित्र 7: बाहरी रूप से जोड़े गए H 2 O 2 के लिए mtHyPer7 की प्रतिक्रिया (A) 405 nm और 488 nm उत्तेजित छवियों का अधिकतम प्रक्षेपण और_H2O₂ की विभिन्न सांद्रता के संपर्क में आने वाले मध्य-लॉग चरण कोशिकाओं में mtHyPer7 की अनुपातमीट्रिक छवियों का औसत तीव्रता प्रक्षेपण। स्यूडोकलर ऑक्सीकृत: कम mtHyPer7 अनुपात (नीचे पर पैमाने) को इंगित करता है। स्केल बार = 1 μm। सेल की रूपरेखा सफेद रंग में दिखाई गई है; n प्रति स्थिति 100 कोशिकाओं > है। (बी) एच 2 ओ₂ की विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किए गए नवोदित खमीर कोशिकाओं में एमटीहाइपर 7 ऑक्सीकृत: कमअनुपात का परिमाणीकरण। पांच स्वतंत्र परीक्षणों के साधन दिखाए गए हैं, प्रत्येक परीक्षण के लिए अलग-अलग आकार और रंगीन प्रतीकों के साथ। ऑक्सीकृत के अनुपात का औसत ± एसईएम: कम एमटीहाइपर 7: 1.794 ± 0.07627 (कोई उपचार नहीं), 1.357 ± 0.03295 (0.1 एमएम), 2.571 ± 0.3186 (0.5 एमएम), 6.693 ± 0.5194 (1 एमएम), 7.017 ± 0.1197 (2 एमएम)। पी < 0.0001 (टुकी के कई तुलना परीक्षण के साथ वन-वे एनोवा)। पी मान को इस प्रकार निरूपित किया जाता है: ****पी < 0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अंत में, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि फिटर माइटोकॉन्ड्रिया, जो अधिक कम हो जाते हैं और कम सुपरऑक्साइड होते हैं, अधिमानतः खमीर बेटी कोशिकाओं⁴ द्वारा विरासत में मिलते हैं, और यह कि साइटोसोलिक कैटालसेस को खमीर बेटी कोशिकाओं 42,43,44,45 में ले जाया जाता है और सक्रिय किया जाता है। ये अध्ययन खमीर कोशिका विभाजन के दौरान माइटोकॉन्ड्रिया की असममित विरासत और बेटी सेल फिटनेस और जीवनकाल में इस प्रक्रिया के लिए एक भूमिका के साथ-साथ मां-बेटी की आयु विषमता का दस्तावेजीकरण करते हैं। यह जांचने के लिए कि क्या माताओं और कलियों के बीच एच 2 ओ₂में अंतर मौजूद है, एमटीहाइपर 7 को कलियों और मां कोशिकाओं में मापा गया था। खमीर कोशिकाओं के भीतरमाइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ 2 में अंतर देखा गया था, और मातृ कोशिका की तुलना में कली में माइटोकॉन्ड्रिया में एच 2 ओ ₂ बायोसेंसर रीडआउट में सूक्ष्म लेकिन सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कमी का पता चला था (चित्रा 8)। ये निष्कर्ष पिछले निष्कर्षों के अनुरूप हैं कि कली में माइटोकॉन्ड्रिया ऑक्सीडेटिव तनाव से बेहतर संरक्षित हैं। वे यह भी दस्तावेज प्रदान करते हैं कि एमटीहाइपर 7 उभरते खमीर में सेलुलर और उपकोशिकीय संकल्प के साथ माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ₂के लिए मात्रात्मक रीडआउट प्रदान कर सकता है।

चित्रा 8: बेटी सेल में माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ₂स्तर कम है। (ए) एक प्रतिनिधि सेल में एमटीहाइपर 7 की अनुपातमीट्रिक छवि का अधिकतम प्रक्षेपण। स्यूडोकलर ऑक्सीकृत: कम mtHyPer7 अनुपात (नीचे पर पैमाने) को इंगित करता है। अनुपात में उपकोशिकीय अंतर स्पष्ट हैं (तीर)। स्केल बार = 1 μm। सेल की रूपरेखा: सफेद। (बी) कली और मातृ कोशिका में mtHyPer7 अनुपात के बीच अंतर। प्रत्येक व्यक्तिगत सेल के लिए, मां अनुपात मान को कली अनुपात मूल्य से घटाया गया था और एक बिंदु के रूप में प्लॉट किया गया था। एन = 193 कोशिकाओं को पांच स्वतंत्र प्रयोगों से एकत्र किया गया, प्रत्येक प्रयोग के लिए अलग-अलग रंगीन प्रतीकों के साथ दिखाया गया। कली और मातृ कोशिकाओं में mtHyPer7 अनुपात के बीच अंतर का औसत ± एसईएम: -0.04297 ± 0.01266। p = 0.0008 (युग्मित t-test) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले उपभेद। उपयोग किए गए खमीर उपभेदों की सूची। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 2: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड। उपयोग किए गए प्लास्मिड की सूची। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 3: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर। उपयोग किए गए प्राइमरों की सूची। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: बायोसेंसर प्लास्मिड निर्माण के लिए प्रोटोकॉल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: स्वचालित विश्लेषण के लिए स्क्रिप्ट। प्रत्येक स्क्रिप्ट के लिए, नमूना इनपुट फ़ाइलों और आउटपुट फ़ाइलों की आपूर्ति की जाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस प्रोटोकॉल में, जीवित नवोदित खमीर कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ₂का आकलन करने के लिए बायोसेंसर के रूप में एमटीहाइपर 7 का उपयोग करने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। बायोसेंसर का निर्माण सीआरआईएसपीआर-आधारित विधि का उपयोग करके किया जाता है और चयन योग्य मार्करों के उपयोग के बिना खमीर जीनोम में एक संरक्षित जीन-मुक्त क्षेत्र में पेश किया जाता है। प्लास्मिड-जनित बायोसेंसर की तुलना में, एकीकृत लोगों को सभी कोशिकाओं में और लगातार स्तरों पर व्यक्त किया जाता है, जो अधिक विश्वसनीय परिमाणीकरण परिणाम प्रदान करते हैं। एमटीहाइपर 7-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए कोई चयन योग्य मार्कर ों का उपयोग नहीं किया जाता है, जो तनाव पृष्ठभूमि की एक विस्तृत श्रृंखला के उपयोग की अनुमति देता है और बायोसेंसर-व्यक्त कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन की सुविधा प्रदान करता है। एमटीहाइपर 7 प्रोटीन को माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान, कार्य, वितरण या सेलुलर विकास दर पर ध्यान देने योग्य प्रभाव के बिना माइटोकॉन्ड्रिया को सही ढंग से लक्षित किया जाता है। mtHyPer7 बाहरी रूप से जोड़े गए H 2 O₂के लिए एक खुराक-निर्भर प्रतिक्रिया दिखाता_है। इसके अलावा, एमटीहाइपर 7 उपकोशिकीय संकल्प के साथ माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता की विविधता पर रिपोर्ट करने में सक्षम है। अंत में, इमेजिंग माइटोकॉन्ड्रियल-लक्षित बायोसेंसर के लिए वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी के विपरीत स्पिनिंग-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करने से फ्लोरोफोरे को कम फोटोब्लीचिंग होती है और उपकोशिकीय मतभेदों का विश्लेषण करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां उत्पन्न होती हैं।

सीमाएं और वैकल्पिक दृष्टिकोण
यह विधि 10 मिनट से अधिक समय तक इमेजिंग कोशिकाओं के लिए उपयुक्त नहीं है, क्योंकि कोशिकाएं कवरस्लिप के नीचे सूख जाएंगी। लंबी अवधि की इमेजिंग के लिए, अगर पैड विधि⁴⁶ का उपयोग करना या एससी माध्यम से भरे ग्लास-बॉटम कल्चर डिश में कोशिकाओं को गतिहीन करना बेहतर है।

बायोसेंसर की पसंद प्रयोगात्मक परिस्थितियों में लक्ष्य की एकाग्रता द्वारा निर्देशित होनी चाहिए। यदि HyPer7 की संवेदनशीलता बहुत अधिक है, तो एक अलग HyPer संस्करण की सिफारिश की जाएगी, जैसे HyPer3 या HyPerRed^47,48। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अन्य हाइपर जांच अधिक पीएच-संवेदनशील हैं। उच्च संवेदनशीलता के लिए, पेरोक्सीरेडॉक्सिन-आधारित आरओजीएफपी अधिक उपयुक्त हो सकता है (roGFP2Tsa2ΜCR)²⁷.

एच 2 ओ₂सेंसर की ऑक्सीकरण स्थिर स्थिति ऑक्सीकरण और कमी दर दोनों से जुड़ी है। बायोसेंसर की ऑक्सीकरण दर मुख्य रूप से एच 2 ओ₂के कारण होती है, लेकिन कमी दर सेल और ऑर्गेनेल में सक्रिय एंटीऑक्सिडेंट कमी प्रणालियों पर निर्भर करती है। यह दिखाया गया है कि हाइपर 7 मुख्य रूप से खमीर साइटोसोल में थियोरेडॉक्सिन प्रणाली द्वारा कम हो जाता है, और इसकी कमी आरओजीएफपी 2टीएसए 2 2 सीआर²⁷ की तुलना में तेजी से होती है। इसलिए, एच 2 ओ₂बायोसेंसर के माप की व्याख्या करते समय जांच के विभिन्न कमी तंत्र और प्रतिक्रिया गतिशीलता को ध्यान में रखा जाना चाहिए। विशेष रूप से, बायोसेंसर रीडआउट सेएच 2 ओ₂स्तरों का अनुमान लगाने के लिए, यह माना जाना चाहिए कि प्रयोग के दौरान कमी प्रणाली एक निरंतर क्षमता बनाए रखती है। यहां वर्णित स्क्रिप्ट के विकल्प के रूप में, रेडॉक्स सेंसर⁴⁹ के विश्लेषण के लिए कई अन्य सॉफ्टवेयर स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कराए गए हैं।

महत्वपूर्ण कदम
किसी भी बायोसेंसर के साथ, यह प्रदर्शित करना महत्वपूर्ण है कि बायोसेंसर स्वयं मापी जा रही प्रक्रिया को प्रभावित नहीं करता है। इसलिए, प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के तहत उपभेदों के विकास और माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान की तुलना करना महत्वपूर्ण है। यहां, माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का मूल्यांकन माइटोट्रैकर रेड का उपयोग करके किया जाता है, जो माइटोकॉन्ड्रिया को झिल्ली संभावित-निर्भर तरीके से दाग देता है। हालांकि, अपरिवर्तित और बायोसेंसर-रूपांतरित कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया की तुलना टेट्रामेथिलरोडामाइन मिथाइल एस्टर (टीएमआरएम), एक वैकल्पिक झिल्ली क्षमता-संवेदी माइटोकॉन्ड्रियल महत्वपूर्ण डाई, या मिटोट्रैकर ग्रीन के साथ धुंधला करके पूरा किया जा सकता है, जो झिल्ली क्षमता से स्वतंत्र माइटोकॉन्ड्रिया को दाग देता है। यदि हानिकारक प्रभावों का संदेह है, तो अभिव्यक्ति स्तर को कम करने या एकीकरण साइट को बदलने में मदद मिल सकती है।

मजबूत परिणाम एकत्र करने के लिए जांच के खुराक-प्रतिक्रिया व्यवहार और इमेजिंग तकनीक के सिग्नल-टू-शोर अनुपात को मान्य करना भी आवश्यक है। यदि किसी समूह के भीतर परिवर्तनशीलता समूहों के बीच परिवर्तनशीलता से अधिक है, तो मतभेदों का पता लगाना मुश्किल हो जाता है। इंट्राग्रुप परिवर्तनशीलता वास्तविक जनसंख्या भिन्नता, या पहचान प्रक्रिया में शोर के परिणामस्वरूप हो सकती है। सिग्नल: शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण कदम छवि अधिग्रहण (पिक्सेल मूल्य सीमा और शोर), पृष्ठभूमि घटाव और थ्रेशोल्डिंग हैं।

गणना चरणों के दौरान शोर प्रभाव को भी कम किया जा सकता है। सबसे सीधा तरीका अनुपात छवि माप (परिणाम .csv) से भारित औसत तीव्रता की गणना करना है, जहां प्रत्येक पिक्सेल उत्तेजना क्षमता के बीच स्थानीय अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है। यह एक "पिक्सेलवाइज" अनुपात पैदा करता है। हालांकि, यदि छवि संकेत: शोर अनुपात कम है, तो प्रगणक और भाजक चैनलों दोनों में आरओआई के लिए भारित औसत तीव्रता की गणना करके और फिर इन दो भारित साधनों ("क्षेत्रवार" अनुपात) के बीच अनुपात की गणना करके अधिक मजबूत परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं।

थ्रेशोल्डिंग विधि का चयन करने के लिए, फिजी कमांड इमेज | समायोजित करें | ऑटो थ्रेशोल्ड का उपयोग स्वचालित रूप से सभी अंतर्निहित फिजी विधियों को आज़माने के लिए किया जा सकता है। विभाजन (थ्रेशोल्डिंग) का मूल्यांकन करने के लिए, एक सहेजे गए मास्क को संपादित करें पर क्लिक करके चयन में परिवर्तित किया जाता है चयन | चयन बनाएँ, ROI प्रबंधक में जोड़ा गया ( T दबाकर), और फिर कच्ची छवि फ़ाइल पर सक्रिय करें। यदि माइटोकॉन्ड्रिया का पर्याप्त रूप से पता नहीं लगाया जाता है, तो एक अलग विभाजन विधि का प्रयास किया जाना चाहिए।

छवियों की तुलना करते समय, समान इमेजिंग स्थितियों के साथ सभी छवियों को प्राप्त करना आवश्यक है, साथ ही समान विपरीत वृद्धि के साथ सभी छवियों को प्रदर्शित करना आवश्यक है।

इमेजिंग स्थितियों को अनुकूलित करते समय माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलन पर विचार किया जाना चाहिए। यदि माइटोकॉन्ड्रिया 405 और 488 एनएम पर उत्तेजना के बीच काफी आगे बढ़ते हैं, तो अनुपात छवि सटीक नहीं होगी। एक्सपोजर समय <500 एमएस रखने और उपलब्ध सबसे तेज़ विधि (जैसे ट्रिगर पल्स या एकोस्टो-ऑप्टिक टैपेबल फिल्टर) द्वारा उत्तेजना को बदलने की सिफारिश की जाती है। जेड स्टैक को कैप्चर करते समय, अगले जेड चरण में जाने से पहले प्रत्येक जेड चरण के लिए दोनों उत्तेजना ओं का प्रदर्शन किया जाना चाहिए।

परिणामों के प्रदर्शन के लिए, तीव्रता में परिवर्तन की तुलना में मानव आंखों के लिए रंग (रंग) में परिवर्तन अधिक स्पष्ट हैं। इसलिए, अनुपात मान को आसान दृश्य व्याख्या के लिए रंग पैमाने में परिवर्तित किया जाता है। रंगीन छवियों को अनमॉड्यूलेटेड किया जा सकता है, जहां सभी माइटोकॉन्ड्रियल पिक्सेल एक ही चमक, या तीव्रता-मॉड्यूलेटेड पर दिखाई देते हैं, जहां मूल छवि में पिक्सेल तीव्रता का उपयोग रंगीन छवि में तीव्रता सेट करने के लिए किया जाता है।

संशोधन और समस्या निवारण
पैराक्वाट के साथ चुनौती द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन की पुष्टि करने के विकल्प के रूप में, कोशिकाओं को प्रतिकृति-चढ़ाया जा सकता है या किण्वनीय और गैर-किण्वनीय कार्बन स्रोतों में टीका लगाया जा सकता है।

पृष्ठभूमि घटाव के लिए, रोलिंग बॉल घटाव (प्रक्रिया पर नेविगेट करके ) पृष्ठभूमि घटाएं ...) रोशनी की गैर-एकरूपता को दूर करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है। यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि कोशिकाओं की उपस्थिति पृष्ठभूमि को घटाए जाने में बदलाव नहीं करती है ( पृष्ठभूमि बनाने और परिणाम की जांच करने के विकल्प की जांच करके)।

सारांश में, एमटीहाइपर 7 जांच जीवित कोशिकाओं में खमीर माइटोकॉन्ड्रिया की रूपात्मक और कार्यात्मक स्थिति से संबंधित एक सुसंगत, न्यूनतम इनवेसिव विधि प्रदान करती है, और आनुवंशिक रूप से साध्य, आसानी से सुलभ मॉडल प्रणाली में एक महत्वपूर्ण सेलुलर तनाव और सिग्नलिंग अणु के अध्ययन की अनुमति देती है।

Disclosures

लेखक ों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए कैथरीन फिल्पो लोपेज़ को धन्यवाद देते हैं। इस काम को एलपी को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) (GM122589 और AG051047) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

इन अध्ययनों ने कोलंबिया विश्वविद्यालय में हर्बर्ट इरविंग कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर के कॉन्फोकल और स्पेशलाइज्ड माइक्रोस्कोपी साझा संसाधन का उपयोग किया, जिसे एनआईएच / एनसीआई कैंसर सेंटर सपोर्ट ग्रांट P30CA013696 के माध्यम से वित्त पोषित किया गया।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens	Nikon	MRD01905
Adenine sulfate	Sigma-Aldrich	A9126
Bacto Agar	BD Difco	DF0145170
Bacto Peptone	BD Difco	DF0118170
Bacto Tryptone	BD Difco	DF211705
Bacto Yeast Extract	BD Difco	DF0127179
BamHI	New England Biolabs	R0136S
BglII	New England Biolabs	R0144S
Carbenicilin	Sigma-Aldrich	C1389
Carl Zeiss Immersol Immersion Oil	Carl Zeiss	444960
Dextrose (D-(+)-Glucose)	Sigma-Aldrich	G8270
E. cloni 10G chemical competent cell	Bioserch Technologies	60108
FIJI	NIH		Schindelin et al 2012
G418 (Geneticin)	Sigma-Aldrich	A1720
GFP emission filter	Chroma		525/50
Gibson assembly	New England Biolabs	E2611
Graphpad Prism 7	GraphPad		https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
H₂O₂ (stable)	Sigma-Aldrich	H1009
HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO	Pon Lab	JYE057/EP41	Liao et al 20201
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific	E24
KAPA HiFi PCR kit	Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA	KK1006
L-arginine hydrochloride	Sigma-Aldrich	A8094
laser	Agilent		405 and 488 nm
L-histidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	H5659
L-leucine	Sigma-Aldrich	L8912
L-lysine hydrochloride	Sigma-Aldrich	L8662
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625
L-phenylalanine	Sigma-Aldrich	P5482
L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T8941
L-tyrosine	Sigma-Aldrich	T8566
mHyPer7 plasmid	This study	JYE116
Microscope coverslips	ThermoScientific	3406	#1.5 (170 µm thickness)
Microscope slides	ThermoScientific	3050
MitoTracker Red CM-H2Xros	ThermoFisherScientific	M7513
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NEBuilder HiFi Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2621
Nikon Elements	Nikon		Microscope acquisition software
Nikon Ti Eclipse inverted microscope	Nikon
Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate)	Sigma-Aldrich	Cat. 856177
RStudio	Posit.co	Free desktop version
Spectrophotometer	Beckman	BU530
Stagetop incubator	Tokai Hit	INU
Uracil	Sigma-Aldrich	U1128
Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids	BD Difco	DF0919073
YN2_1_LT58_X2site	Addgene	177705	Pianale et al 2021
Zyla 4.2 sCMOS camera	Andor

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References

vander Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genetics. 207 (3), 843-871 (2017).
McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: more than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
Shi, R., Hou, W., Wang, Z. -Q., Xu, X. Biogenesis of iron-sulfur clusters and their role in DNA metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 735678 (2021).
McFaline-Figueroa, J. R., et al. Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast. Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).
Higuchi-Sanabria, R., et al. Mitochondrial anchorage and fusion contribute to mitochondrial inheritance and quality control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 27 (5), 776-787 (2016).
Higuchi-Sanabria, R., et al. Role of asymmetric cell division in lifespan control in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 14 (8), 1133-1146 (2014).
Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells. Free Radical Biology & Medicine. 50 (8), 963-970 (2011).
Laun, P., et al. Aged mother cells of Saccharomyces cerevisiae show markers of oxidative stress and apoptosis. Molecular Microbiology. 39 (5), 1166-1173 (2001).
Doudican, N. A., Song, B., Shadel, G. S., Doetsch, P. W. Oxidative DNA damage causes mitochondrial genomic instability in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 25 (12), 5196-5204 (2005).
Roca-Portoles, A., Tait, S. W. G. Mitochondrial quality control: from molecule to organelle. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (8), 3853-3866 (2021).
Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative stress. Annual Review of Biochemistry. 86, 715-748 (2017).
Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
Imlay, J. A., Fridovich, I. Assay of metabolic superoxide production in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (11), 6957-6965 (1991).
Fridovich, I. Mitochondria: are they the seat of senescence. Aging Cell. 3 (1), 13-16 (2004).
Quinlan, C. L., Perevoshchikova, I. V., Hey-Mogensen, M., Orr, A. L., Brand, M. D. Sites of reactive oxygen species generation by mitochondria oxidizing different substrates. Redox Biology. 1 (1), 304-312 (2013).
Griendling, K. K., Minieri, C. A., Ollerenshaw, J. D., Alexander, R. W. Angiotensin II stimulates NADH and NADPH oxidase activity in cultured vascular smooth muscle cells. Circulation Research. 74 (6), 1141-1148 (1994).
Griendling, K. K., Sorescu, D., Ushio-Fukai, M. NAD(P)H oxidase: role in cardiovascular biology and disease. Circulation Research. 86 (5), 494-501 (2000).
Edmondson, D. E., Binda, C., Wang, J., Upadhyay, A. K., Mattevi, A. Molecular and mechanistic properties of the membrane-bound mitochondrial monoamine oxidases. Biochemistry. 48 (20), 4220-4230 (2009).
Ramsay, R. R., Singer, T. P. The kinetic mechanisms of monoamine oxidases A and B. Biochemical Society Transactions. 19 (1), 219-223 (1991).
Ramsay, R. R. Kinetic mechanism of monoamine oxidase A. Biochemistry. 30 (18), 4624-4629 (1991).
Handy, D. E., Loscalzo, J. Redox regulation of mitochondrial function. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (11), 1323-1367 (2012).
Wood, Z. A., Schröder, E., Robin Harris, J., Poole, L. B. Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins. Trends in Biochemical Sciences. 28 (1), 32-40 (2003).
Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
Pak, V. V., et al. Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function. Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).
Topell, S., Hennecke, J., Glockshuber, R. Circularly permuted variants of the green fluorescent protein. FEBS Letters. 457 (2), 283-289 (1999).
Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Methods. 3 (4), 281-286 (2006).
Kritsiligkou, P., Shen, T. K., Dick, T. P. A comparison of Prx- and OxyR-based H2O2 probes expressed in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100866 (2021).
Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11241-11246 (1999).
Abedi, M. R., Caponigro, G., Kamb, A. Green fluorescent protein as a scaffold for intracellular presentation of peptides. Nucleic Acids Research. 26 (2), 623-630 (1998).
Onukwufor, J. O., et al. A reversible mitochondrial complex I thiol switch mediates hypoxic avoidance behavior in C. elegans. Nature Communications. 13 (1), 2403 (2022).
Vega, M., et al. Antagonistic effects of mitochondrial matrix and intermembrane space proteases on yeast aging. BMC Biology. 20 (1), 160 (2022).
Torello Pianale, L., Rugbjerg, P., Olsson, L. Real-time monitoring of the yeast intracellular state during bioprocesses with a toolbox of biosensors. Frontiers in Microbiology. 12, 802169 (2022).
Imani, M., Mohajeri, N., Rastegar, M., Zarghami, N. Recent advances in FRET-based biosensors for biomedical applications. Analytical Biochemistry. 630, 114323 (2021).
Zadran, S., et al. Fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensors: visualizing cellular dynamics and bioenergetics. Applied Microbiology and Biotechnology. 96 (4), 895-902 (2012).
Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
Liao, P. -C., Wolken, D. M. A., Serrano, E., Srivastava, P., Pon, L. A. Mitochondria-associated degradation pathway (MAD) function beyond the outer membrane. Cell Reports. 32 (2), 107902 (2020).
Higuchi-Sanabria, R., Swayne, T. C., Boldogh, I. R., Pon, L. A. Live-cell imaging of mitochondria and the actin cytoskeleton in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1365, 25-62 (2016).
Liao, P. -C., Yang, E. J., Pon, L. A. Live-cell imaging of mitochondrial redox state in yeast cells. STAR Protocols. 1 (3), 100160 (2020).
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
Chazotte, B. Labeling mitochondria with MitoTracker dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 990-992 (2011).
Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nyström, T. Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis. Science. 299 (5613), 1751-1753 (2003).
Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nyström, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants can be suppressed by overproducing the protein aggregation-remodeling factor Hsp104p. Genes & Development. 21 (19), 2410-2421 (2007).
Erjavec, N., Cvijovic, M., Klipp, E., Nyström, T. Selective benefits of damage partitioning in unicellular systems and its effects on aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (48), 18764-18769 (2008).
Erjavec, N., Nyström, T. Sir2p-dependent protein segregation gives rise to a superior reactive oxygen species management in the progeny of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (26), 10877-10881 (2007).
Davidson, R., Liu, Y., Gerien, K. S., Wu, J. Q. Real-time visualization and quantification of contractile ring proteins in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1369, 9-23 (2016).
Bilan, D. S., et al. HyPer-3: a genetically encoded H2O2 probe with improved performance for ratiometric and fluorescence lifetime imaging. ACS Chemical Biology. 8 (3), 535-542 (2013).
Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5 (1), 5222 (2014).
Fricker, M. D. Quantitative redox imaging software. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (13), 752-762 (2016).
Yang, E. J., Pernice, W. M., Pon, L. A. A role for cell polarity in lifespan and mitochondrial quality control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. iSCIENCE. 25 (3), 103957 (2022).

Biology

जीवित खमीर कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल पेरोक्साइड के लिए एक अनुपातमीट्रिक बायोसेंसर, एमटीहाइपर 7 की इमेजिंग

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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