हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2 ओ2) ऑक्सीडेटिव क्षति और सिग्नलिंग अणु दोनों का स्रोत है। यह प्रोटोकॉल बताता है कि जीवित खमीरमें माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित हाइपर 7 (एमटीएचवाईपर 7), आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड अनुपातमीट्रिक बायोसेंसर का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ2 को कैसे मापा जाए। यह बताता है कि इमेजिंग स्थितियों को कैसे अनुकूलित किया जाए और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके मात्रात्मक सेलुलर और उपकोशिकीय विश्लेषण किया जाए।
माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, या कार्यात्मक परिवर्तन, कई बीमारियों और स्थितियों में पाया जाता है, जिसमें न्यूरोडीजेनेरेटिव और मस्कुलोस्केलेटल विकार, कैंसर और सामान्य उम्र बढ़ने शामिल हैं। यहां, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड, न्यूनतम इनवेसिव, अनुपातमेट्रिक बायोसेंसर का उपयोग करके सेलुलर और उपकोशिकीय संकल्पों पर जीवित खमीर कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है। बायोसेंसर, माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित हाइपर 7 (एमटीएचवाईपर 7), माइटोकॉन्ड्रिया में हाइड्रोजनपेरोक्साइड (एच 2 ओ2) का पता लगाता है। इसमें एक माइटोकॉन्ड्रियल सिग्नल अनुक्रम होता है जो एक गोलाकार फ्लोरोसेंट प्रोटीन और एक बैक्टीरियल ऑक्सीआर प्रोटीन के एच 2 ओ2-उत्तरदायीडोमेन से जुड़ा होता है। बायोसेंसर को सीआरआईएसपीआर-कैस 9 मार्कर-मुक्त प्रणाली का उपयोग करके खमीर जीनोम में उत्पन्न और एकीकृत किया जाता है, जो प्लास्मिड-जनित संरचनाओं की तुलना में अधिक सुसंगत अभिव्यक्ति के लिए होता है।
एमटीहाइपर 7 मात्रात्मक रूप से माइटोकॉन्ड्रिया को लक्षित है, खमीर विकास दर या माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान पर कोई पता लगाने योग्य प्रभाव नहीं है, और सामान्य विकास स्थितियों के तहत और ऑक्सीडेटिव तनाव के संपर्क में माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ2के लिए एक मात्रात्मक रीडआउट प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल बताता है कि स्पिनिंग-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सिस्टम का उपयोग करके इमेजिंग स्थितियों को कैसे अनुकूलित किया जाए और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके मात्रात्मक विश्लेषण किया जाए। ये उपकरण कोशिकाओं के भीतर और आबादी में कोशिकाओं के बीच माइटोकॉन्ड्रिया पर समृद्ध स्थानिक जानकारी एकत्र करना संभव बनाते हैं। इसके अलावा, यहां वर्णित वर्कफ़्लो का उपयोग अन्य बायोसेंसर को मान्य करने के लिए किया जा सकता है।
माइटोकॉन्ड्रिया आवश्यक यूकेरियोटिक सेलुलर ऑर्गेनेल हैं जो ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन और इलेक्ट्रॉन परिवहन1 के माध्यम से एटीपी के उत्पादन में अपने कार्य के लिए अच्छी तरह से जाने जाते हैं। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया कैल्शियम भंडारण, लिपिड, अमीनो एसिड, फैटी एसिड और लौह-सल्फर क्लस्टर के संश्लेषण और सिग्नल ट्रांसडक्शन 2,3 के लिए साइटें हैं। कोशिकाओं के भीतर, माइटोकॉन्ड्रिया विशेषता आकृति विज्ञान और वितरण के साथ एक गतिशील नेटवर्क बनाते हैं, जो सेल प्रकार और चयापचय स्थिति के अनुसार भिन्न होता है। इसके अलावा, हालांकि माइटोकॉन्ड्रिया फ्यूज और विभाजित हो सकते हैं, एक सेल में सभी माइटोकॉन्ड्रिया बराबर नहीं होते हैं। कई अध्ययनों ने झिल्ली क्षमता और ऑक्सीडेटिव अवस्था 4,5,6 जैसी विशेषताओं में व्यक्तिगत कोशिकाओं के भीतर माइटोकॉन्ड्रिया की कार्यात्मक विविधता का दस्तावेजीकरण किया है। माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में यह भिन्नता एमटीडीएनए उत्परिवर्तन (जो परमाणु डीएनए की तुलना में उच्च दर पर होती है) से ऑर्गेनेल को नुकसान और ऑर्गेनेल 7,8,9 के भीतर और बाहर उत्पन्न प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) द्वारा ऑक्सीडेटिव क्षति के कारण होती है। ऑर्गेनेल को नुकसान माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र द्वारा कम किया जाता है जो क्षति की मरम्मत करता है या माइटोकॉन्ड्रिया को खत्म करता है जो मरम्मतसे परे क्षतिग्रस्त हो जाते हैं।
हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2 ओ2) एक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति है जो सेलुलर प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और लिपिड को ऑक्सीडेटिव क्षति का स्रोत है। हालांकि, एच2 ओ2 एक सिग्नलिंग अणु के रूप में भी कार्य करता है जो लक्ष्य प्रोटीन11,12 में थिओल के प्रतिवर्ती ऑक्सीकरण के माध्यम से सेलुलर गतिविधियों को नियंत्रित करता है। एच2 ओ2 इलेक्ट्रॉनों से उत्पन्न होता है जो माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला से और विशिष्ट एंजाइमों द्वारा लीक होते हैं, जैसे कि एनएडीपीएच ऑक्सीडेज और मोनोमाइन ऑक्सीडेज 13,14,15,16,17,18,19,20। यह एंटीऑक्सिडेंट सिस्टम द्वारा भी निष्क्रिय है, जिसमें थियोरेडॉक्सिन और ग्लूटाथियोन21,22,23 पर आधारित हैं। इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रियल एच 2ओ2 स्तरों का विश्लेषण सामान्य माइटोकॉन्ड्रियल और सेलुलर फ़ंक्शन में और ऑक्सीडेटिव तनाव की स्थितियों में इस मेटाबोलाइट की भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।
इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड अनुपातमीट्रिक एच 2 ओ 2 बायोसेंसर, हाइपर 7 का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ2का पता लगाना है, जो ऑर्गेनेल (एमटीहाइपर 7) को लक्षित है। एमटीहाइपर 7 एक चिमेरा है जिसमें एटीपी 9 (एसयू 9 प्रीसीक्वेंस) से माइटोकॉन्ड्रियल सिग्नल अनुक्रम, हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) का एक गोलाकार रूप से म्यूट रूप और नीसेरिया मेनिन्जाइटिस24 से ऑक्सीआर प्रोटीन का एच 2 ओ2-बाइंडिंगडोमेन शामिल है (चित्रा 1)। गोलाकार रूप से म्यूट जीएफपी में, देशी जीएफपी के एन- और सी-टर्मिनी को जोड़ा जाता है और क्रोमोफोर के पास नई टर्मिनी का निर्माण किया जाता है, जो प्रोटीन को अधिक गतिशीलता प्रदान करता है और देशी जीएफपी25 की तुलना में इसकी वर्णक्रमीय विशेषताओं की अधिक व्यवहार्यता प्रदान करता है। H2 O 2 के साथ mtHyPer7 के ऑक्सीआर डोमेन की बातचीतउच्च-आत्मीयता, H 2 O 2-चयनात्मकहै, और संरक्षित सिस्टीन अवशेषों और डाइसल्फ़ाइड पुल गठन के प्रतिवर्ती ऑक्सीकरण की ओर जाता है। ऑक्सीआर के ऑक्सीकरण से जुड़े विरूपण परिवर्तनों को एमटीहाइपर 7 में गोलाकार रूप से म्यूट जीएफपी में स्थानांतरित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एमटीहाइपर 7 क्रोमोफोर की उत्तेजना अधिकतम में कम अवस्था में 405 एनएम से एच 2 ओ2-ऑक्सीकृतअवस्था26 में 488 एनएम तक वर्णक्रमीय बदलाव होता है। इस प्रकार, 488 एनएम बनाम 405 एनएम पर उत्तेजना के जवाब में एमटीहाइपर 7 से प्रतिदीप्ति का अनुपात एच 2 ओ2द्वारा जांच के ऑक्सीकरण को दर्शाताहै।
आदर्श रूप से, एक बायोसेंसर को अपने लक्ष्य अणु का वास्तविक समय, पूर्ण, मात्रात्मक रीडआउट प्रदान करना चाहिए। दुर्भाग्य से, हालांकि, यह वास्तविक दुनिया के माप में हमेशा संभव नहीं होता है। ऑक्सीकरण सेंसर के मामले में, जैसे कि एमटीहाइपर 7, वास्तविक समय रीडआउट डाइसल्फ़ाइड ब्रिज की कमी की दर से प्रभावित होता है। आरओएस बायोसेंसर द्वारा उपयोग की जाने वाली कमी प्रणाली अलग-अलग होती है, और ये नाटकीय रूप से जांच प्रतिक्रिया गतिशीलता को बदल सकते हैं- जैसा कि थायोरेडॉक्सिन प्रणाली द्वारा कम किए गए हाइपर 7 की तुलना से दिखाया गया है, और आरओजीएफपी 2-टीएसए 2 सीआर, ग्लूटाथियोन-इन खमीर साइटोसोल27 द्वारा कम किया गया है। इस प्रकार, mtHyPer7 अनुपात से सापेक्ष H2O2 एकाग्रता के बारे में निष्कर्ष निकालने के लिए, किसी को यह मानना चाहिए कि प्रयोग के दौरान कमी प्रणाली एक निरंतर क्षमता बनाए रखती है। इन विचारों के बावजूद, जीवित कोशिकाओं25,28,29 में एच 2 ओ2के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए विभिन्न संदर्भों में हाइपर 7 और संबंधित जांच का उपयोग किया गया है।
चित्र 1:H2O2 बायोसेंसर mtHyPer7 का डिजाइन, आणविक तंत्र और उत्तेजना / उत्सर्जन स्पेक्ट्रा। (A) mtHyPer7 प्रोब निसेरिया मेनिनजाइटिस से ऑक्सीआर-आरडी डोमेन में गोलाकार रूप से म्यूट जीएफपी सम्मिलित करके प्राप्त किया जाता है। इसमें न्यूरोस्पोरा क्रैसा (एसयू 9) से एटीपी सिंथेज़ के सबयूनिट 9 से माइटोकॉन्ड्रियल लक्ष्यीकरण अनुक्रम शामिल है। (बी) एमटीहाइपर 7 के एच 2 ओ2-सेंसिंगतंत्र का चित्रण। आरडी डोमेन में सिस्टीन का ऑक्सीकरण 488 एनएम पर उत्तेजना पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन बढ़ाता है और 405 एनएम पर उत्तेजना द्वारा उत्पादित उत्सर्जन को कम करता है। (सी) ऑक्सीकरण और कम रूपों में हाइपर 7 की उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा। यह आंकड़ा पाक एट अल 24 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है। संक्षेप: जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; सीपीजीएफपी = गोलाकार जीएफपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
एमटीहाइपर 7 की यह अनुपातमेट्रिक इमेजिंग माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ2मात्रा 24,27 के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करती है; यह जांच एकाग्रता के लिए एक आंतरिक नियंत्रण प्रदान करता है। इसके अलावा, एच 2 ओ 2 एक्सपोजर द्वारा उत्पादित उत्तेजना शिखर मेंबदलाव पूरा नहीं होता है, यहां तक कि एच 2 ओ 2की संतृप्त सांद्रता में भी। इस प्रकार, अनुपात इमेजिंग विश्लेषण में दो वर्णक्रमीय बिंदुओं को शामिल करके संवेदनशीलता को बढ़ा सकता है।
यहां उपयोग किए जाने वाले एमटीहाइपर 7 जांच में एच 2 ओ2 के लिएबहुत अधिक संबंध है और पीएच24 के लिए अपेक्षाकृत कम संवेदनशीलता है, और इसे सफलतापूर्वक केनोरहाब्डिस एलिगेंस माइटोकॉन्ड्रिया30 पर लक्षित किया गया है। इस प्रोटीन का उपयोग खमीर27,31 में भी किया गया है। हालांकि, पिछले अध्ययनों ने एमटीहाइपर 7 की प्लास्मिड-जनित अभिव्यक्ति पर भरोसा किया, जिसके परिणामस्वरूप जांच अभिव्यक्ति27 में सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता होती है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में वर्णित निर्माण को मार्कर-मुक्त एकीकरण के लिए सीआरआईएसपीआर-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करके क्रोमोसोम एक्स32 पर एक संरक्षित, जीन-मुक्त क्षेत्र में एकीकृत किया गया था। एकीकृत बायोसेंसर जीन की अभिव्यक्ति को मजबूत संवैधानिक टीईएफ 1 प्रमोटर (चित्रा 2) द्वारा भी नियंत्रित किया जाता है। नतीजतन, प्लास्मिड-जनित बायोसेंसर अभिव्यक्ति का उपयोग करके देखे गए की तुलना में खमीर सेल आबादी में बायोसेंसर की अधिक स्थिर, सुसंगत अभिव्यक्ति होती है, और बायोसेंसर को प्रभावित करने वाली कोशिकाओं को चयनात्मक मीडिया की आवश्यकता के बिना प्रचारित किया जा सकता है।
चित्रा 2: CRISPR द्वारा mtHyPer7-व्यक्त कोशिकाओं का उत्पादन। कैस 9 और एसजीआरएनए युक्त प्लास्मिड (YN2_1_LT58_X2site) और पीसीआर-प्रवर्धित एमटीहाइपर 7-युक्त बायोसेंसर निर्माण को लिथियम एसीटेट परिवर्तन द्वारा नवोदित खमीर कोशिकाओं में पेश किया जाता है। क्रोमोसोम एक्स (एक्स 2) पर जीन-मुक्त सम्मिलन साइट को एसजीआरएनए के साथ कैस 9 प्रोटीन द्वारा पहचाना और काटा जाता है, और बायोसेंसर को समरूप पुनर्संयोजन द्वारा जीनोम में एकीकृत किया जाता है। माइक्रोस्कोपिक स्क्रीनिंग, कॉलोनी पीसीआर और अनुक्रमण द्वारा सफल ट्रांसफॉर्मेंट्स की पहचान के बाद, कैस 9 प्लास्मिड को गैर-चयनात्मक मीडिया में वृद्धि से हटा दिया जाता है (ठीक) किया जाता है। संक्षेप: एसजीआरएनए = एकल गाइड आरएनए; टीईएफ = प्रतिलेखन बढ़ाने वाला कारक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
अंत में, mtHyPer7 अन्य ROS बायोसेंसर पर लाभ प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, आरओएस का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले कार्बनिक रंजक (उदाहरण के लिए, डाइहाइड्रोएथिडियम [डीएचई]2 और मिटोसॉक्स3) असमान या निरर्थक धुंधलापन पैदा कर सकते हैं और अक्सर इथेनॉल या डाइमिथाइल सल्फोक्साइड जैसे सॉल्वैंट्स में वितरित किए जाते हैं, जिन्हें विलायक प्रभावों के लिए अतिरिक्त नियंत्रण की आवश्यकता होती है। आरओएस बायोसेंसर का एक अन्य वर्ग फ्लोरेसेंस रेजोनेंस एनर्जी ट्रांसफर (फ्रेट) आधारित बायोसेंसर (जैसे, सेलुलर रेडॉक्स स्टेट4 के लिए रेडॉक्सफ्लोर, और पेरोक्साइड सेंसर एचएसपी-फ्रेट5, ऑक्सीफ्रेट 6, और पेरफ्रेट6) हैं। ये जांच आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड और सिद्धांत रूप में अत्यधिक संवेदनशील हैं और अच्छी तरह से विशेषता वाले माइटोकॉन्ड्रियल सिग्नल अनुक्रमों का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रिया को मात्रात्मक रूप से लक्षित किया जा सकता है। हालांकि, फ्रेट-आधारित जांच के उपयोग में चुनौतियां हैं, जिसमें क्रॉस-उत्तेजना और ब्लीड-थ्रू के कारण पृष्ठभूमि शामिल है, और फ्रेट के लिए फ्लोरोफोरे की निकटता और अभिविन्यास के लिए कड़ी आवश्यकताएं33,34 हैं। इसके अलावा, फ्रेट जांच में दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन होते हैं जिन्हें स्पेक्ट्रा-शिफ्टिंग जांच की तुलना में रुचि की कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के लिए बड़े निर्माण की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को हाइपर 7-आधारित बायोसेंसर की ताकत का लाभ उठाने के लिए विकसित किया गया था, और जीवित खमीर में माइटोकॉन्ड्रिया में पेरोक्साइड की मात्रात्मक इमेजिंग के लिए इस कॉम्पैक्ट, अनुपातमेट्रिक, उच्च-आत्मीयता, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड जांच का उपयोग करने के लिए।
इस प्रोटोकॉल में, जीवित नवोदित खमीर कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ2का आकलन करने के लिए बायोसेंसर के रूप में एमटीहाइपर 7 का उपयोग करने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। बायोसेंसर का निर्माण सीआरआईएसपीआर-आधारित विधि का उपयोग करके किया जाता है और चयन योग्य मार्करों के उपयोग के बिना खमीर जीनोम में एक संरक्षित जीन-मुक्त क्षेत्र में पेश किया जाता है। प्लास्मिड-जनित बायोसेंसर की तुलना में, एकीकृत लोगों को सभी कोशिकाओं में और लगातार स्तरों पर व्यक्त किया जाता है, जो अधिक विश्वसनीय परिमाणीकरण परिणाम प्रदान करते हैं। एमटीहाइपर 7-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए कोई चयन योग्य मार्कर ों का उपयोग नहीं किया जाता है, जो तनाव पृष्ठभूमि की एक विस्तृत श्रृंखला के उपयोग की अनुमति देता है और बायोसेंसर-व्यक्त कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन की सुविधा प्रदान करता है। एमटीहाइपर 7 प्रोटीन को माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान, कार्य, वितरण या सेलुलर विकास दर पर ध्यान देने योग्य प्रभाव के बिना माइटोकॉन्ड्रिया को सही ढंग से लक्षित किया जाता है। mtHyPer7 बाहरी रूप से जोड़े गए H 2 O2के लिए एक खुराक-निर्भर प्रतिक्रिया दिखाताहै। इसके अलावा, एमटीहाइपर 7 उपकोशिकीय संकल्प के साथ माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता की विविधता पर रिपोर्ट करने में सक्षम है। अंत में, इमेजिंग माइटोकॉन्ड्रियल-लक्षित बायोसेंसर के लिए वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी के विपरीत स्पिनिंग-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करने से फ्लोरोफोरे को कम फोटोब्लीचिंग होती है और उपकोशिकीय मतभेदों का विश्लेषण करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां उत्पन्न होती हैं।
सीमाएं और वैकल्पिक दृष्टिकोण
यह विधि 10 मिनट से अधिक समय तक इमेजिंग कोशिकाओं के लिए उपयुक्त नहीं है, क्योंकि कोशिकाएं कवरस्लिप के नीचे सूख जाएंगी। लंबी अवधि की इमेजिंग के लिए, अगर पैड विधि46 का उपयोग करना या एससी माध्यम से भरे ग्लास-बॉटम कल्चर डिश में कोशिकाओं को गतिहीन करना बेहतर है।
बायोसेंसर की पसंद प्रयोगात्मक परिस्थितियों में लक्ष्य की एकाग्रता द्वारा निर्देशित होनी चाहिए। यदि HyPer7 की संवेदनशीलता बहुत अधिक है, तो एक अलग HyPer संस्करण की सिफारिश की जाएगी, जैसे HyPer3 या HyPerRed47,48। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अन्य हाइपर जांच अधिक पीएच-संवेदनशील हैं। उच्च संवेदनशीलता के लिए, पेरोक्सीरेडॉक्सिन-आधारित आरओजीएफपी अधिक उपयुक्त हो सकता है (roGFP2Tsa2ΜCR)27.
एच 2 ओ2सेंसर की ऑक्सीकरण स्थिर स्थिति ऑक्सीकरण और कमी दर दोनों से जुड़ी है। बायोसेंसर की ऑक्सीकरण दर मुख्य रूप से एच 2 ओ2के कारण होती है, लेकिन कमी दर सेल और ऑर्गेनेल में सक्रिय एंटीऑक्सिडेंट कमी प्रणालियों पर निर्भर करती है। यह दिखाया गया है कि हाइपर 7 मुख्य रूप से खमीर साइटोसोल में थियोरेडॉक्सिन प्रणाली द्वारा कम हो जाता है, और इसकी कमी आरओजीएफपी 2टीएसए 2 2 सीआर27 की तुलना में तेजी से होती है। इसलिए, एच 2 ओ2बायोसेंसर के माप की व्याख्या करते समय जांच के विभिन्न कमी तंत्र और प्रतिक्रिया गतिशीलता को ध्यान में रखा जाना चाहिए। विशेष रूप से, बायोसेंसर रीडआउट से एच 2 ओ2स्तरों का अनुमान लगाने के लिए, यह माना जाना चाहिए कि प्रयोग के दौरान कमी प्रणाली एक निरंतर क्षमता बनाए रखती है। यहां वर्णित स्क्रिप्ट के विकल्प के रूप में, रेडॉक्स सेंसर49 के विश्लेषण के लिए कई अन्य सॉफ्टवेयर स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कराए गए हैं।
महत्वपूर्ण कदम
किसी भी बायोसेंसर के साथ, यह प्रदर्शित करना महत्वपूर्ण है कि बायोसेंसर स्वयं मापी जा रही प्रक्रिया को प्रभावित नहीं करता है। इसलिए, प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के तहत उपभेदों के विकास और माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान की तुलना करना महत्वपूर्ण है। यहां, माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का मूल्यांकन माइटोट्रैकर रेड का उपयोग करके किया जाता है, जो माइटोकॉन्ड्रिया को झिल्ली संभावित-निर्भर तरीके से दाग देता है। हालांकि, अपरिवर्तित और बायोसेंसर-रूपांतरित कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया की तुलना टेट्रामेथिलरोडामाइन मिथाइल एस्टर (टीएमआरएम), एक वैकल्पिक झिल्ली क्षमता-संवेदी माइटोकॉन्ड्रियल महत्वपूर्ण डाई, या मिटोट्रैकर ग्रीन के साथ धुंधला करके पूरा किया जा सकता है, जो झिल्ली क्षमता से स्वतंत्र माइटोकॉन्ड्रिया को दाग देता है। यदि हानिकारक प्रभावों का संदेह है, तो अभिव्यक्ति स्तर को कम करने या एकीकरण साइट को बदलने में मदद मिल सकती है।
मजबूत परिणाम एकत्र करने के लिए जांच के खुराक-प्रतिक्रिया व्यवहार और इमेजिंग तकनीक के सिग्नल-टू-शोर अनुपात को मान्य करना भी आवश्यक है। यदि किसी समूह के भीतर परिवर्तनशीलता समूहों के बीच परिवर्तनशीलता से अधिक है, तो मतभेदों का पता लगाना मुश्किल हो जाता है। इंट्राग्रुप परिवर्तनशीलता वास्तविक जनसंख्या भिन्नता, या पहचान प्रक्रिया में शोर के परिणामस्वरूप हो सकती है। सिग्नल: शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण कदम छवि अधिग्रहण (पिक्सेल मूल्य सीमा और शोर), पृष्ठभूमि घटाव और थ्रेशोल्डिंग हैं।
गणना चरणों के दौरान शोर प्रभाव को भी कम किया जा सकता है। सबसे सीधा तरीका अनुपात छवि माप (परिणाम .csv) से भारित औसत तीव्रता की गणना करना है, जहां प्रत्येक पिक्सेल उत्तेजना क्षमता के बीच स्थानीय अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है। यह एक “पिक्सेलवाइज” अनुपात पैदा करता है। हालांकि, यदि छवि संकेत: शोर अनुपात कम है, तो प्रगणक और भाजक चैनलों दोनों में आरओआई के लिए भारित औसत तीव्रता की गणना करके और फिर इन दो भारित साधनों (“क्षेत्रवार” अनुपात) के बीच अनुपात की गणना करके अधिक मजबूत परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं।
थ्रेशोल्डिंग विधि का चयन करने के लिए, फिजी कमांड इमेज | समायोजित करें | ऑटो थ्रेशोल्ड का उपयोग स्वचालित रूप से सभी अंतर्निहित फिजी विधियों को आज़माने के लिए किया जा सकता है। विभाजन (थ्रेशोल्डिंग) का मूल्यांकन करने के लिए, एक सहेजे गए मास्क को संपादित करें पर क्लिक करके चयन में परिवर्तित किया जाता है चयन | चयन बनाएँ, ROI प्रबंधक में जोड़ा गया ( T दबाकर), और फिर कच्ची छवि फ़ाइल पर सक्रिय करें। यदि माइटोकॉन्ड्रिया का पर्याप्त रूप से पता नहीं लगाया जाता है, तो एक अलग विभाजन विधि का प्रयास किया जाना चाहिए।
छवियों की तुलना करते समय, समान इमेजिंग स्थितियों के साथ सभी छवियों को प्राप्त करना आवश्यक है, साथ ही समान विपरीत वृद्धि के साथ सभी छवियों को प्रदर्शित करना आवश्यक है।
इमेजिंग स्थितियों को अनुकूलित करते समय माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलन पर विचार किया जाना चाहिए। यदि माइटोकॉन्ड्रिया 405 और 488 एनएम पर उत्तेजना के बीच काफी आगे बढ़ते हैं, तो अनुपात छवि सटीक नहीं होगी। एक्सपोजर समय <500 एमएस रखने और उपलब्ध सबसे तेज़ विधि (जैसे ट्रिगर पल्स या एकोस्टो-ऑप्टिक टैपेबल फिल्टर) द्वारा उत्तेजना को बदलने की सिफारिश की जाती है। जेड स्टैक को कैप्चर करते समय, अगले जेड चरण में जाने से पहले प्रत्येक जेड चरण के लिए दोनों उत्तेजना ओं का प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
परिणामों के प्रदर्शन के लिए, तीव्रता में परिवर्तन की तुलना में मानव आंखों के लिए रंग (रंग) में परिवर्तन अधिक स्पष्ट हैं। इसलिए, अनुपात मान को आसान दृश्य व्याख्या के लिए रंग पैमाने में परिवर्तित किया जाता है। रंगीन छवियों को अनमॉड्यूलेटेड किया जा सकता है, जहां सभी माइटोकॉन्ड्रियल पिक्सेल एक ही चमक, या तीव्रता-मॉड्यूलेटेड पर दिखाई देते हैं, जहां मूल छवि में पिक्सेल तीव्रता का उपयोग रंगीन छवि में तीव्रता सेट करने के लिए किया जाता है।
संशोधन और समस्या निवारण
पैराक्वाट के साथ चुनौती द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन की पुष्टि करने के विकल्प के रूप में, कोशिकाओं को प्रतिकृति-चढ़ाया जा सकता है या किण्वनीय और गैर-किण्वनीय कार्बन स्रोतों में टीका लगाया जा सकता है।
पृष्ठभूमि घटाव के लिए, रोलिंग बॉल घटाव (प्रक्रिया पर नेविगेट करके ) पृष्ठभूमि घटाएं …) रोशनी की गैर-एकरूपता को दूर करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है। यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि कोशिकाओं की उपस्थिति पृष्ठभूमि को घटाए जाने में बदलाव नहीं करती है ( पृष्ठभूमि बनाने और परिणाम की जांच करने के विकल्प की जांच करके)।
सारांश में, एमटीहाइपर 7 जांच जीवित कोशिकाओं में खमीर माइटोकॉन्ड्रिया की रूपात्मक और कार्यात्मक स्थिति से संबंधित एक सुसंगत, न्यूनतम इनवेसिव विधि प्रदान करती है, और आनुवंशिक रूप से साध्य, आसानी से सुलभ मॉडल प्रणाली में एक महत्वपूर्ण सेलुलर तनाव और सिग्नलिंग अणु के अध्ययन की अनुमति देती है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए कैथरीन फिल्पो लोपेज़ को धन्यवाद देते हैं। इस काम को एलपी को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) (GM122589 और AG051047) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
इन अध्ययनों ने कोलंबिया विश्वविद्यालय में हर्बर्ट इरविंग कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर के कॉन्फोकल और स्पेशलाइज्ड माइक्रोस्कोपी साझा संसाधन का उपयोग किया, जिसे एनआईएच / एनसीआई कैंसर सेंटर सपोर्ट ग्रांट P30CA013696 के माध्यम से वित्त पोषित किया गया।
100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens | Nikon | MRD01905 | |
Adenine sulfate | Sigma-Aldrich | #A9126 | |
Bacto Agar | BD Difco | #DF0145170 | |
Bacto Peptone | BD Difco | #DF0118170 | |
Bacto Tryptone | BD Difco | #DF211705 | |
Bacto Yeast Extract | BD Difco | #DF0127179 | |
BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
BglII | New England Biolabs | R0144S | |
Carbenicilin | Sigma-Aldrich | C1389 | |
Carl Zeiss Immersol Immersion Oil | Carl Zeiss | 444960 | |
Dextrose (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | #G8270 | |
E. cloni 10G chemical competent cell | Bioserch Technologies | 60108 | |
FIJI | NIH | Schindelin et al 2012 | |
G418 (Geneticin) | Sigma-Aldrich | A1720 | |
GFP emission filter | Chroma | 525/50 | |
Gibson assembly | New England Biolabs | E2611 | |
Graphpad Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
H2O2 (stable) | Sigma-Aldrich | H1009 | |
HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO | Pon Lab | JYE057/EP41 | Liao et al 20201 |
Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | E24 | |
KAPA HiFi PCR kit | Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK1006 | |
L-arginine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #A8094 | |
laser | Agilent | 405 and 488 nm | |
L-histidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #H5659 | |
L-leucine | Sigma-Aldrich | #L8912 | |
L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #L8662 | |
L-methionine | Sigma-Aldrich | #M9625 | |
L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | #P5482 | |
L-tryptophan | Sigma-Aldrich | #T8941 | |
L-tyrosine | Sigma-Aldrich | #T8566 | |
mHyPer7 plasmid | This study | JYE116 | |
Microscope coverslips | ThermoScientific | 3406 | #1.5 (170 µm thickness) |
Microscope slides | ThermoScientific | 3050 | |
MitoTracker Red CM-H2Xros | ThermoFisherScientific | M7513 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
NEBuilder HiFi Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621 | |
Nikon Elements | Nikon | Microscope acquisition software | |
Nikon Ti Eclipse inverted microscope | Nikon | ||
Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate) | Sigma-Aldrich | Cat. #856177 | |
RStudio | Posit.co | Free desktop version | |
Spectrophotometer | Beckman | BU530 | |
Stagetop incubator | Tokai Hit | INU | |
Uracil | Sigma-Aldrich | #U1128 | |
Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids | BD Difco | #DF0919073 | |
YN2_1_LT58_X2site | Addgene | 177705 | Pianale et al 2021 |
Zyla 4.2 sCMOS camera | Andor |