Hydrogenperoksid (H 2 O2) er både en kilde til oksidativ skade og et signalmolekyl. Denne protokollen beskriver hvordan man måler mitokondriell H2 O2 ved hjelp av mitokondrie-målrettet HyPer7 (mtHyPer7), en genetisk kodet ratiometrisk biosensor, i levende gjær. Den beskriver hvordan du optimaliserer bildeforholdene og utfører kvantitativ cellulær og subcellulær analyse ved hjelp av fritt tilgjengelig programvare.
Mitokondriell dysfunksjon, eller funksjonell endring, finnes i mange sykdommer og tilstander, inkludert nevrodegenerative og muskuloskeletale lidelser, kreft og normal aldring. Her beskrives en tilnærming for å vurdere mitokondriefunksjonen i levende gjærceller ved cellulære og subcellulære oppløsninger ved hjelp av en genetisk kodet, minimalt invasiv, ratiometrisk biosensor. Biosensoren, mitokondrie-målrettet HyPer7 (mtHyPer7), detekterer hydrogenperoksid (H 2 O2) imitokondrier. Den består av en mitokondriell signalsekvens fusjonert til et sirkulært permutert fluorescerende protein og H2O2-responsivt domene av et bakterielt OxyR-protein. Biosensoren genereres og integreres i gjærgenomet ved hjelp av et CRISPR-Cas9 markørfritt system, for mer konsistent uttrykk sammenlignet med plasmidbårne konstruksjoner.
mtHyPer7 er kvantitativt målrettet mot mitokondrier, har ingen påviselig effekt på gjærvekst eller mitokondriell morfologi, og gir en kvantitativ avlesning for mitokondriell H 2 O2under normale vekstforhold og ved eksponering for oksidativt stress. Denne protokollen forklarer hvordan du optimaliserer bildeforholdene ved hjelp av et konfokalmikroskopsystem med spinnskiver og utfører kvantitativ analyse ved hjelp av fritt tilgjengelig programvare. Disse verktøyene gjør det mulig å samle rik romlig informasjon om mitokondrier både i celler og mellom celler i en populasjon. Videre kan arbeidsflyten beskrevet her brukes til å validere andre biosensorer.
Mitokondrier er essensielle eukaryote cellulære organeller som er kjent for sin funksjon i å produsere ATP gjennom oksidativ fosforylering og elektrontransport1. I tillegg er mitokondrier steder for kalsiumlagring, syntese av lipider, aminosyrer, fettsyrer og jern-svovelklynger og signaltransduksjon 2,3. I cellene danner mitokondriene et dynamisk nettverk med karakteristisk morfologi og distribusjon, som varierer etter celletype og metabolsk tilstand. Videre, selv om mitokondrier kan smelte sammen og dele seg, er ikke alle mitokondriene i en celle ekvivalente. Tallrike studier har dokumentert funksjonell heterogenitet av mitokondrier i individuelle celler i attributter som membranpotensial og oksidativ tilstand 4,5,6. Denne variasjonen i mitokondriell funksjon skyldes delvis skade på organellen fra mtDNA-mutasjoner (som forekommer med høyere hastighet enn i nukleært DNA) og oksidativ skade av reaktive oksygenarter (ROS) generert både innenfor og utenfor organellen 7,8,9. Skader på organellen reduseres av mitokondrielle kvalitetskontrollmekanismer som reparerer skaden eller eliminerer mitokondrier som er skadet utover reparasjon10.
Hydrogenperoksid (H 2 O2) er en reaktiv oksygenart som er en kilde til oksidativ skade på cellulære proteiner, nukleinsyrer og lipider. Imidlertid tjener H 2O2 også som et signalmolekyl som regulerer cellulære aktiviteter gjennom reversibel oksidasjon av tioler i målproteiner11,12. H 2 O2er produsert fra elektroner som lekker fra mitokondriell elektrontransportkjede og av spesifikke enzymer, slik som NADPH-oksidase og monoaminoxidaser 13,14,15,16,17,18,19,20. Det er også inaktivert av antioksidantsystemer, inkludert de som er basert på tioredoksin og glutation21,22,23. Dermed er analyse av mitokondrielle H2O2-nivåer avgjørende for å forstå rollen til denne metabolitten i normal mitokondriell og cellulær funksjon og under forhold med oksidativt stress.
Det overordnede målet med denne protokollen er å oppdage mitokondriell H 2O 2 ved hjelp av en genetisk kodet ratiometrisk H 2 O 2biosensor, HyPer7, som er målrettet mot organellen (mtHyPer7). mtHyPer7 er en kimær som består av mitokondriell signalsekvens fra ATP9 (Su9-presekvensen), en sirkulært permutert form av grønt fluorescerende protein (GFP) og H2O2-bindende domene av OxyR-proteinet fra Neisseria meningitidis24 (figur 1). I sirkulært permutert GFP smeltes N- og C-terminalene til innfødt GFP sammen og nye terminaler dannes nær kromoforen, noe som gir større mobilitet til proteinet og større labilitet av dets spektrale egenskaper sammenlignet med innfødt GFP25. Samspillet mellom mtHyPer7s OxyR-domene og H2O2 er høy affinitet,H2O2-selektiv, ogfører til reversibel oksidasjon av konserverte cysteinrester og disulfidbrodannelse. Konformasjonsendringer assosiert med oksidasjon av OxyR overføres til den sirkulært permuterte GFP i mtHyPer7, noe som resulterer i en spektral forskyvning i eksitasjonsmaksimumet av mtHyPer7-kromoforen fra 405 nm i redusert tilstand til 488 nm iH2O2-oksiderttilstand26. Dermed reflekterer forholdet mellom fluorescens fra mtHyPer7 som respons på eksitasjon ved 488 nm mot 405 nm oksydasjonen av sonden ved H 2 O2.
Ideelt sett bør en biosensor gi en sanntids, absolutt, kvantitativ avlesning av målmolekylet. Dessverre er dette imidlertid ikke alltid mulig i virkelige målinger. Når det gjelder oksidasjonssensorer, som mtHyPer7, påvirkes sanntidsavlesningen av reduksjonshastigheten til disulfidbroen. Reduksjonssystemene som brukes av ROS-biosensorer er forskjellige, og disse kan dramatisk endre sonderesponsdynamikken – som vist ved sammenligning av HyPer7, redusert av tioredoksinsystemet, og roGFP2-Tsa2ΔCR, redusert av glutation i gjærcytosol27. For å trekke en konklusjon om den relative H2O2-konsentrasjonen fra mtHyPer7-forhold, må man derfor anta at reduksjonssystemet opprettholder en konstant kapasitet under forsøket. Til tross for disse betraktningene har HyPer7 og relaterte sonder blitt brukt i ulike sammenhenger for å få informasjon om H 2 O2 i levendeceller25,28,29.
Figur 1: Design, molekylær mekanisme og eksitasjon/emisjonsspektra til H 2 O2biosensoren mtHyPer7. (A) mtHyPer7-sonden er avledet ved å sette inn sirkulært permutert GFP i OxyR-RD-domenet fra Neisseria meningitidis. Den inneholder mitokondriell målrettingssekvens fra subenhet 9 av ATP-syntasen fra Neurospora crassa (Su9). (B) Illustrasjon av H 2 O2-sensormekanismentil mtHyPer7. Oksidasjon av cysteiner i RD-domenet øker fluorescensutslipp ved eksitasjon ved 488 nm og reduserer utslipp produsert ved eksitasjon ved 405 nm. (C) Eksitasjons- og emisjonsspektra av HyPer7 i oksiderte og reduserte former. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Pak et al.24. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; cpGFP = sirkulært permutert GFP. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Denne ratiometriske avbildningen av mtHyPer7 gir viktige fordeler for mitokondriell H2 O2 kvantifisering24,27; Det gir en intern kontroll for sondekonsentrasjon. I tillegg er skiftet i eksitasjonstopp produsert av H 2 O 2 eksponering ikke fullført, selv i mettende konsentrasjoner av H 2 O2. Dermed kan ratio imaging øke følsomheten ved å inkorporere to spektrale punkter i analysen.
mtHyPer7-sonden som brukes her har en meget høy affinitet for H 2 O2og relativt lav følsomhet for pH24, og har blitt målrettet mot Caenorhabditis elegans mitokondrier30. Dette proteinet har også blitt brukt i gjær 27,31. Tidligere studier baserte seg imidlertid på plasmidbårent uttrykk av mtHyPer7, noe som resulterer i celle-til-celle-variabilitet i probeuttrykk27. I tillegg ble konstruksjonen beskrevet i denne protokollen integrert i en konservert, genfri region på kromosom X32 ved hjelp av en CRISPR-basert tilnærming for markørfri integrasjon. Ekspresjon av det integrerte biosensorgenet styres også av den sterke konstitutive TEF1-promotoren (figur 2). Som et resultat er det mer stabilt, konsistent uttrykk for biosensoren i gjærcellepopulasjoner sammenlignet med det som observeres ved bruk av plasmidbåren biosensoruttrykk, og celler som bærer biosensoren kan forplantes uten behov for selektive medier.
Figur 2: Generering av mtHyPer7-uttrykkende celler med CRISPR. Cas9 og sgRNA-holdig plasmid (YN2_1_LT58_X2site) og PCR-forsterket mtHyPer7-holdig biosensorkonstruksjon blir introdusert i spirende gjærceller ved litiumacetattransformasjon. Det genfrie innsettingsstedet på kromosom X (X2) gjenkjennes og kuttes av Cas9-protein med sgRNA, og biosensoren integreres i genomet ved homolog rekombinasjon. Etter identifisering av de vellykkede transformantene ved mikroskopisk screening, koloni-PCR og sekvensering, fjernes Cas9-plasmidet (herdes) ved vekst i ikke-selektive medier. Forkortelser: sgRNA = single guide RNA; TEF = transkripsjonsforsterkerfaktor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Endelig gir mtHyPer7 fordeler i forhold til andre ROS-biosensorer. For eksempel kan organiske fargestoffer som brukes til å oppdage ROS (f.eks. Dihydroethidium [DHE]2 og MitoSOX3) produsere ujevn eller uspesifikk farging og leveres ofte i løsningsmidler som etanol eller dimetylsulfoksid, som krever ytterligere kontroller for løsningsmiddeleffekter. En annen klasse av ROS-biosensorer er fluorescensresonansenergioverføring (FRET) -baserte biosensorer (f.eks. Redoksfluor for cellulær redokstilstand4, og peroksidsensorene HSP-FRET5, OxyFRET 6 og PerFRET6). Disse probene er genetisk kodede og svært følsomme i prinsippet og kan kvantitativt målrettes mot mitokondrier ved hjelp av godt karakteriserte mitokondrielle signalsekvenser. Det er imidlertid utfordringer ved bruk av FRET-baserte sonder, inkludert bakgrunn på grunn av krysseksitasjon og gjennomblødning, og strenge krav til nærhet og orientering av fluoroforene for at FRET skal forekomme33,34. I tillegg består FRET-sonder av to fluorescerende proteiner som krever større konstruksjoner for ekspresjon i celler av interesse sammenlignet med spektra-skiftende sonder. Protokollen beskrevet her ble utviklet for å dra nytte av styrken til den HyPer7-baserte biosensoren, og for å bruke denne kompakte, ratiometriske, genetisk kodede sonden med høy affinitet for kvantitativ avbildning av peroksid i mitokondrier i levende gjær.
I denne protokollen beskrives en metode for bruk av mtHyPer7 som biosensor for å vurdere mitokondriellH2O2i levende spirende gjærceller. Biosensoren er konstruert ved hjelp av en CRISPR-basert metode og introdusert i en konservert genfri region i gjærgenomet uten bruk av valgbare markører. Sammenlignet med plasmidbårne biosensorer, uttrykkes integrerte i alle celler og på konsistente nivåer, noe som gir mer pålitelige kvantifiseringsresultater. Ingen valgbare markører brukes til å generere mtHyPer7-uttrykkende celler, noe som muliggjør bruk av et bredere spekter av belastningsbakgrunner og letter den genetiske modifikasjonen av biosensoruttrykkende celler. mtHyPer7-proteinet er riktig målrettet mot mitokondrier uten merkbare effekter på mitokondriell morfologi, funksjon, distribusjon eller cellulære veksthastigheter. mtHyPer7 viser en doseavhengig respons på eksternt tilsatt H 2 O2. Videre er mtHyPer7 i stand til å rapportere om heterogeniteten av mitokondriell kvalitet med subcellulær oppløsning. Til slutt, ved hjelp av et spinnskivekonfokalmikroskop i motsetning til bredfeltsmikroskopi for avbildning av mitokondrie-målrettede biosensorer, forårsaker mindre fotobleking til fluoroforer og genererer høyoppløselige bilder for å analysere subcellulære forskjeller.
Begrensninger og alternative tilnærminger
Denne metoden er ikke egnet for avbildning av celler i mer enn 10 minutter, da cellene vil tørke ut under dekselet. For langsiktig avbildning er det bedre å bruke agarputemetoden46 eller å immobilisere celler i en glassbunnkulturskål fylt med SC-medium.
Valget av biosensor bør styres av konsentrasjonen av målet under eksperimentelle forhold. Hvis følsomheten til HyPer7 er for høy, vil en annen HyPer-versjon anbefales, for eksempel HyPer3 eller HyPerRed47,48. Det skal imidlertid bemerkes at andre HyPer-sonder er mer pH-følsomme. For høyere sensitivitet kan peroksiredoksinbasert roGFP være mer hensiktsmessig (roGFP2Tsa2ΔCR)27.
Oksidasjonsstabil tilstand til H 2 O2-sensorener knyttet til både oksidasjons- og reduksjonshastigheter. Oksidasjonshastigheten til biosensorer er hovedsakelig forårsaket av H 2 O2, men reduksjonshastigheten avhenger av antioksidantreduksjonssystemene som er aktive i cellen og organellen. Det har vist seg at HyPer7 hovedsakelig reduseres av tioredoksinsystemet i gjærcytosol, og reduksjonen er raskere enn for roGFP2Tsa2ΔCR27. Derfor bør sondens forskjellige reduksjonsmekanismer og responsdynamikk tas i betraktning ved tolkning av målinger av H 2 O2 biosensorer. Spesielt, for å utledeH 2 O2 nivåer fra biosensoravlesningen, må det antas at reduksjonssystemet opprettholder en konstant kapasitet under forsøket. Som et alternativ til skriptene som er beskrevet her, har en rekke annen programvare blitt gjort fritt tilgjengelig for analyse av redokssensorer49.
Kritiske skritt
Med enhver biosensor er det avgjørende å demonstrere at biosensoren selv ikke påvirker prosessen som måles. Derfor er det viktig å sammenligne veksten og mitokondriell morfologi av stammer under hver eksperimentell tilstand. Her vurderes mitokondriell morfologi ved hjelp av MitoTracker Red, som flekker mitokondrier på en membranpotensialavhengig måte. Imidlertid kan sammenligning av mitokondriene i utransformerte og biosensortransformerte celler oppnås ved farging med tetrametylrhodaminmetylester (TMRM), et alternativt membranpotensialfølende mitokondrielt vitalt fargestoff, eller MitoTracker Green, som flekker mitokondrier uavhengig av membranpotensial. Hvis det er mistanke om skadelige effekter, kan det hjelpe å redusere uttrykksnivået eller endre integreringsnettstedet.
Validering av sondens dose-respons-oppførsel og signal-støy-forholdet mellom avbildningsteknikken er også avgjørende for å samle robuste resultater. Hvis variabiliteten innen en gruppe overstiger variabiliteten mellom grupper, blir forskjellene vanskelige å oppdage. Variabilitet i gruppen kan skyldes reell populasjonsvariasjon eller støy i deteksjonsprosessen. De viktigste trinnene for å øke signalet: støyforholdet er bildeopptak (pikselverdiområde og støy), bakgrunnssubtraksjon og terskelverdi.
Støyeffekter kan også reduseres under beregningstrinnene. Den enkleste tilnærmingen er å beregne den vektede gjennomsnittlige intensiteten fra forholdsbildemålingene (resultater.csv), der hver piksel representerer det lokale forholdet mellom eksitasjonseffektiviteten. Dette gir et “pikselvis” forhold. Men hvis bildesignalet:støyforholdet er lavt, kan mer robuste resultater oppnås ved å beregne den vektede middelintensiteten for en avkastning i både telleren og nevnerkanalen, og deretter beregne forholdet mellom disse to vektede gjennomsnittene (“regionvis” forhold).
For å velge en terskelmetode, Fiji-kommandoen Bilde | Justere | Autoterskel kan brukes til å prøve alle innebygde Fiji-metoder automatisk. For å evaluere segmentering (terskelverdi) konverteres en lagret maske til et utvalg ved å klikke på Rediger | Utvalg | Opprett markering, lagt til i ROI-behandling (ved å trykke T) og deretter aktivert i RAW-bildefilen. Hvis mitokondrier ikke oppdages tilstrekkelig, bør en annen segmenteringsmetode forsøkes.
Når du sammenligner bilder, er det viktig å skaffe alle bildene med identiske bildeforhold, samt å vise alle bildene med identisk kontrastforbedring.
Mitokondriell bevegelse må vurderes ved optimalisering av bildeforhold. Hvis mitokondriene beveger seg betydelig mellom eksitasjon ved 405 og 488 nm, vil forholdsbildet ikke være nøyaktig. Det anbefales å beholde eksponeringstiden <500 ms og endre eksitasjonen med den raskeste tilgjengelige metoden (f.eks. en utløserpuls eller et akustooptisk justerbart filter). Når du fanger en Z-stabel, bør begge eksitasjonene utføres for hvert Z-trinn før du går videre til neste Z-trinn.
For visning av resultatene er endringer i fargetone (farge) tydeligere for det menneskelige øyet enn endringer i intensitet. Derfor konverteres forholdsverdien til en fargeskala for enklere visuell tolkning. Fargelagte bilder kan unmoduleres, der alle mitokondriepikslene vises med samme lysstyrke, eller intensitetsmodulert, der pikselintensiteten i originalbildet brukes til å angi intensiteter i det fargelagte bildet.
Endring og feilsøking
Som et alternativ til å bekrefte mitokondriell funksjon ved utfordring med paraquat, kan celler replikeres eller inokuleres i gjærbare og ikke-gjærbare karbonkilder.
For subtraksjon i bakgrunnen, rulleballsubtraksjon (ved å navigere til Prosess | Trekk fra bakgrunnen …) kan også brukes til å fjerne belysning ujevnhet. Det bør sikres at tilstedeværelsen av celler ikke endrer bakgrunnen som trekkes fra (ved å sjekke alternativet Opprett bakgrunn og undersøke resultatet).
Oppsummert gir mtHyPer7-sonden en konsistent, minimalt invasiv metode for å relatere den morfologiske og funksjonelle statusen til gjærmitokondrier i levende celler, og tillater studier av et viktig cellulært stressor- og signalmolekyl i et genetisk håndterbart, lett tilgjengelig modellsystem.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Katherine Filpo Lopez for ekspert teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (NIH) (GM122589 og AG051047) til LP.
Disse studiene brukte Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource fra Herbert Irving Comprehensive Cancer Center ved Columbia University, delvis finansiert gjennom NIH / NCI Cancer Center Support Grant P30CA013696.
100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens | Nikon | MRD01905 | |
Adenine sulfate | Sigma-Aldrich | #A9126 | |
Bacto Agar | BD Difco | #DF0145170 | |
Bacto Peptone | BD Difco | #DF0118170 | |
Bacto Tryptone | BD Difco | #DF211705 | |
Bacto Yeast Extract | BD Difco | #DF0127179 | |
BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
BglII | New England Biolabs | R0144S | |
Carbenicilin | Sigma-Aldrich | C1389 | |
Carl Zeiss Immersol Immersion Oil | Carl Zeiss | 444960 | |
Dextrose (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | #G8270 | |
E. cloni 10G chemical competent cell | Bioserch Technologies | 60108 | |
FIJI | NIH | Schindelin et al 2012 | |
G418 (Geneticin) | Sigma-Aldrich | A1720 | |
GFP emission filter | Chroma | 525/50 | |
Gibson assembly | New England Biolabs | E2611 | |
Graphpad Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
H2O2 (stable) | Sigma-Aldrich | H1009 | |
HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO | Pon Lab | JYE057/EP41 | Liao et al 20201 |
Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | E24 | |
KAPA HiFi PCR kit | Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK1006 | |
L-arginine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #A8094 | |
laser | Agilent | 405 and 488 nm | |
L-histidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #H5659 | |
L-leucine | Sigma-Aldrich | #L8912 | |
L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #L8662 | |
L-methionine | Sigma-Aldrich | #M9625 | |
L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | #P5482 | |
L-tryptophan | Sigma-Aldrich | #T8941 | |
L-tyrosine | Sigma-Aldrich | #T8566 | |
mHyPer7 plasmid | This study | JYE116 | |
Microscope coverslips | ThermoScientific | 3406 | #1.5 (170 µm thickness) |
Microscope slides | ThermoScientific | 3050 | |
MitoTracker Red CM-H2Xros | ThermoFisherScientific | M7513 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
NEBuilder HiFi Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621 | |
Nikon Elements | Nikon | Microscope acquisition software | |
Nikon Ti Eclipse inverted microscope | Nikon | ||
Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate) | Sigma-Aldrich | Cat. #856177 | |
RStudio | Posit.co | Free desktop version | |
Spectrophotometer | Beckman | BU530 | |
Stagetop incubator | Tokai Hit | INU | |
Uracil | Sigma-Aldrich | #U1128 | |
Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids | BD Difco | #DF0919073 | |
YN2_1_LT58_X2site | Addgene | 177705 | Pianale et al 2021 |
Zyla 4.2 sCMOS camera | Andor |