Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

التألق المناعي المزدوج ل γH2AX و 53BP1 في الخلايا الليمفاوية المحيطية البشرية

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65472
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Unità di Genetica, Dipartimento di Biologia, University of Pisa, 2Department of Women-Child-Newborn Obstetrics and Gynaecology, Foundation IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة لتقييم تكوين وإصلاح فواصل الحمض النووي المزدوجة من خلال الكشف المتزامن عن بؤر γH2AX و 53BP1 في نوى الطور البيني للخلايا الليمفاوية الطرفية البشرية المعالجة بالبليوميسين.

Abstract

تعد فواصل الخيوط المزدوجة (DSBs) واحدة من أشد الآفات التي يمكن أن تحدث في نوى الخلية ، وإذا لم يتم إصلاحها ، فقد تؤدي إلى نتائج خطيرة ، بما في ذلك السرطان. لذلك ، يتم تزويد الخلية بآليات معقدة لإصلاح DSBs ، وتتضمن هذه المسارات هيستون H2AX في شكله المفسفر في Ser-139 (أي γH2AX) وبروتين ربط p53 1 (53BP1). نظرا لأن كلا البروتينين يمكن أن يشكلان بؤرا في مواقع DSBs ، فإن تحديد هذه العلامات يعتبر طريقة مناسبة لدراسة كل من DSBs وحركية إصلاحها. وفقا للعمليات الجزيئية التي تؤدي إلى تكوين بؤر γH2AX و 53BP1 ، قد يكون من المفيد أكثر التحقيق في توطينها المشترك بالقرب من DSBs من أجل إعداد نهج بديل يسمح بقياس DSBs عن طريق الكشف المتزامن عن علامتين لتلف الحمض النووي. وبالتالي ، يهدف هذا البروتوكول إلى تقييم الضرر الجينومي الناجم في الخلايا الليمفاوية البشرية بواسطة عامل المحاكاة الإشعاعية بليوميسين من خلال وجود بؤر γH2AX و 53BP1 في تألق مناعي مزدوج. باستخدام هذه المنهجية ، حددنا أيضا التباين في عدد بؤر γH2AX و 53BP1 بمرور الوقت ، كمحاولة أولية لدراسة حركية الإصلاح ل DSBs التي يسببها بليوميسين.

Introduction

يحدث تلف الحمض النووي باستمرار بواسطة عوامل يمكن أن تكون داخلية المنشأ ، مثل أنواع الأكسجين التفاعلية الناتجة عن التمثيل الغذائي التأكسدي الخلوي ، أو الخارجية ، سواء المواد الكيميائية أو الفيزيائية1. من بين الآفات الأكثر ضررا ، تلعب فواصل الخيوط المزدوجة (DSBs) دورا أساسيا في المساهمة في عدم الاستقرار الجيني ، لأنها تسبب انحرافات الكروموسومات التي بدورها يمكن أن تبدأ عملية التسرطن. وبالتالي ، يتم تزويد الخلايا بآليات معقدة وفعالة لإصلاح DSBs2.

عندما يحدث DSB ، تقوم الخلية بتشغيل استجابة تلف الحمض النووي (DDR) حيث ، جنبا إلى جنب مع مركب MRE11 / RAD50 / NBS1 ، يتم تجنيد كينازات ATM أو ATR لتنشيط البروتينات الأخرى التي تبطئ أو توقف دورة الخلية3. الهدف الأساسي لهذه الكينازات هو هيستون H2AX ، الذي يتم فسفرته على Ser-139 ضمن عدد قليل من القواعد الضخمة من DSBs (أي γH2AX) ، مما يسمح بتوظيف العديد من عوامل الإصلاح مثل ، من بين أمور أخرى ، BRCA1 و p53 بروتين الربط 1 (53BP1) 3. في وقت لاحق ، يتم تشغيل مسار واحد بين إعادة التركيب المتماثل (HR) ، أو الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) ، أو التلدين أحادي الشريط (SSA) لإصلاح DSBs 4,5. لذلك ، تشارك 53BP1 في إملاء الاختيار بين HR أو NHEJ ، مما يعزز بشكل أساسي تنشيط NHEJ بدلا من HR6. علاوة على ذلك ، يمكن أن يشكل كل من الشكل المفسفر لهستون H2AX و 53BP1 بؤرا في مواقع DSBs. مع استمرار هذه البؤر حتى يتم استعادة سلامة الشريط المزدوج ، يعتبر تقييم مظهر / اختفاء بؤر γH2AX أو 53BP1 خلال فترة زمنية طريقة مفيدة لتقييم حدوث وإصلاح DSBs في نظام الخلية 6,7. ومع ذلك ، وفقا للعمليات الجزيئية الموصوفة أعلاه ، نظرا لأنه من المتوقع أن تتركز بؤر γH2AX و 53BP1 بالقرب من DSBs خلال DDR 8,9 ، فقد يكون من المفيد الكشف بشكل متزامن عن وجود هذه العلامات في تألق مناعي مزدوج.

وبالتالي ، كان الهدف من هذه المخطوطة هو تقييم مدى ملاءمة القياس الكمي المتزامن لبؤر γH2AX و 53BP1 لتقييم الضرر الجيني الناجم في الخلايا الليمفاوية المحيطية البشرية بواسطة عامل المحاكاة الإشعاعية بليوميسين. باستخدام نفس المنهجية ، حاولنا أيضا تحديد حركية الإصلاح ل DSBs التي يسببها بليوميسين وفقا لإجراء تجريبي تم إعداده مسبقا10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على الدراسة من قبل اللجنة الأخلاقية بجامعة بيزا ، وتم الحصول على موافقة مستنيرة وموقعة من كل متبرع.

1. تشكيل بؤر γH2AX و 53BP1

  1. تحضير العينات وعلاج الطفرات
    1. جمع عينات الدم الكامل عن طريق بزل الوريد من الأفراد البالغين الأصحاء في أنابيب جمع الدم (على سبيل المثال ، Vacutainer) التي تحتوي على الهيبارين الليثيوم كمضاد للتخثر.
    2. من أجل ضمان الحفاظ على عينة الدم بشكل صحيح ، ابدأ الإجراء في غضون 24 ساعة من أخذ العينات.
    3. أضف 300 ميكرولتر من العينة إلى أنبوب يحتوي على 4.7 مل من الوسط الكامل (0.5٪ بنسلين-ستربتومايسين ، 0.75٪ فيتوهيماغلوتينين ، 10٪ FBS معطل سابقا ، 88.75٪ RPMI 1640).
    4. ثم أضف كبريتات بليوميسين إلى تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل.
      تنبيه: كبريتات بليوميسين هي مطفرة. تجنب ملامسة الجلد والاستنشاق. تحضير الحل وإضافة العينة تحت غطاء محرك السيارة.
    5. لكل عينة ، قم بإعداد عنصر تحكم سلبي (عدم وجود مطفر).
    6. ضع الأنبوب في ترموستات عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  2. تثبيت
    1. عينات الطرد المركزي عند 540 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. نضح طاف وإعادة تعليق بيليه مع دوامة.
    3. أضف 5 مل من محلول منخفض التوتر (2.87 جم من KCl المذاب في 500 مل من الماء منزوع الأيونات) و 400 ميكرولتر من محلول ما قبل التثبيت (5: 3 حمض الخليك: الميثانول) لإحداث انحلال الدم في خلايا الدم الحمراء.
    4. عينات الطرد المركزي عند 540 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. نضح المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 5 مل من الميثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل لإصلاح الخلايا.
    6. بدلا من ذلك ، قم بتخزين الخلايا في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. إعداد الشرائح
    1. عينات الطرد المركزي عند 540 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. نضح المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 5 مل من الميثانول 3: 1: محلول حمض الخليك. كرر هذه الخطوات مرة أخرى.
    3. في النهاية ، قم بطرد المحلول مرة أخرى عند 540 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. نضح المادة الطافية مرة أخرى مع ترك محلول كاف (0.5 مل) لإعادة تعليق الحبيبات ، والماصة بقوة ، وإسقاط حبيبات الخلية المعاد تعليقها على الشرائح ، وتجفيفها في الهواء. قم بتخزين الشرائح على حرارة 4 درجات مئوية.
  4. التألق المناعي
    ملاحظة: التألق المناعي هو طريقة مناعية لتحديد أهداف خلية معينة باستخدام جسم مضاد أولي يربط الهدف نفسه وجسم مضاد ثانوي فلوري يربط الأساسي الذي يسمح بتحديد موقع الهدف11. في هذه الحالة ، يتم استخدام فأر أحادي النسيلة مضاد 53BP1 (1:50) وأرنب متعدد النسيلة مضاد γH2AX (1:50) كأجسام مضادة أولية ، بينما يتم استخدام AlexaFluor568 المضاد للفأر (1: 400) و DyLight488 المضاد للأرانب (1: 200) كأجسام مضادة ثانوية ، على التوالي.
    1. اغسل الشرائح مرتين في 50 مل من 1x PBS لمدة 5 دقائق في جرة couplin (16 شريحة متتالية).
    2. ثم احتفظ بها لمدة 30 دقيقة في محلول مانع (10 مل من FBS ، 10 مل من 10x PBS ، 80 مل من الماء منزوع الأيونات ، 300 ميكرولتر من Triton-X).
    3. أضف إلى كل شريحة 10 ميكرولتر من كل من المحلولين اللذين يحتويان على الأجسام المضادة الأولية الذائبة في محلول الحظر. غطي الشرائح بشريط البارافين واحتضانها على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
    4. بعد الحضانة ، قم بإجراء ثلاث غسلات في 1x PBS لمدة 5 دقائق.
    5. أضف إلى كل شريحة 10 ميكرولتر من كل من المحلولين اللذين يحتويان على الأجسام المضادة الثانوية الذائبة في محلول الحظر. تغطية الشرائح مع شريط البارافين واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
    6. أداء ثلاث غسلات في 1x PBS لمدة 5 دقائق.
    7. أضف 2.5 ميكرولتر من محلول مضاد للتلاشي مع DAPI على أغطية الغطاء قبل التجميع لمقاومة النوى.
      ملاحظة: من أجل تقييم حركية البؤر ، فإن الإجراء هو نفسه كما هو موضح من 1.1 إلى 1.4 ، مع ملاحظة أن حصاد الخلايا والتألق المناعي المزدوج يتم إجراؤه عند 0 ساعة ، بعد 2 ساعة بعد العلاج بالبليوميسين وبعد ذلك ، بعد إزالة المطفرات ، في 4 ساعات و 6 ساعات و 24 ساعة بعد العلاج.

2. التحليل من خلال المجهر الفلوري

ملاحظة: يشير "المجهر الفلوري" إلى أي مجهر يستخدم التألق لتوليد صورة. تضيء العينة بضوء ذي طول موجي محدد (أو أطوال موجية) تمتصه الفلوروفورات ، مما يجعلها تنبعث منها ضوء بأطوال موجية أطول12. يمتص AlexaFluor568 و DyLight 488 الضوء من حوالي 568 و 488 نانومتر وينبعث منهما ضوء 603 و 520 نانومتر على التوالي. وبالتالي ، فهي مرئية على شكل مضان أحمر أو أخضر باستخدام مرشح TRITC أو FITC ، على التوالي.

  1. سجل وجود بؤر في كل شريحة تحت هدف غمر 100x (الشكل 1).
  2. سجل 200 نواة لكل شريحة واحسب عدد بؤر γH2AX / 53BP1 في كل نواة.
  3. النتائج السريعة من حيث متوسط عدد البؤر لكل إجمالي النوى المسجلة. وتشمل هذه النوى كلا من γH2AX / 53BP1 الموجبة (تظهر إشارة مضان واحدة على الأقل) والنواة السلبية (لا تظهر أي إشارة مضان).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تسمح لنا البيانات التي تم الحصول عليها بواسطة تحليل المجهر الفلوري للخلايا الليمفاوية المحيطية بتقييم ثلاثة جوانب رئيسية: فعالية علاج بليوميسين في زيادة عدد بؤر γH2AX و 53BP1 (وبالتالي DSBs) بسبب تأثيره المطفر ، وإلى أي مدى تركزت كل من البؤر في موقع DSBs ، والمسار الزمني لبؤر γH2AX و 53BP1 لتحديد حركية الإصلاح ل DSBs التي يسببها بليوميسين. كما هو متوقع ، لوحظ تردد أعلى بكثير لكل من بؤر γH2AX و 53BP1 بين الخلايا غير المعالجة والمعالجة ، مما يؤكد أن بليوميسين يحفز تكوين DSBs في الخلايا الليمفاوية المحيطية (الشكل 2).

لوحظ اختلاف كبير في عدد بؤر العلامتين. على وجه الخصوص ، كانت بؤر γH2AX أكثر عددا من بؤر 53BP1 ، مما يشير إلى أن التوطين المشترك لا يحدث دائما ويمكن أن يعتمد على عوامل متعددة (الشكل 3).

فيما يتعلق بحركية إصلاح DSBs ، أولا وقبل كل شيء ، من المهم التأكيد على كيف يمكن أن يبدأ الإصلاح الفعلي للبؤر قبل أول نقطة زمنية محددة ، وهي 2 ساعة ، وأنه في نقاط زمنية مختلفة ، يمكننا ملاحظة البؤر المشكلة حديثا وكذلك البؤر التي تم تشكيلها سابقا والتي لم يتم إصلاحها بعد.

مع الأخذ في الاعتبار ما قيل سابقا ، أظهر المسار الزمني لبؤر γH2AX و 53BP1 بمرور الوقت سلوكا مختلفا على الرغم من أنهما يساهمان في نفس الوظيفة. زادت بؤر γH2AX بعد ساعتين بعد العلاج ، ثم بدأوا في الانخفاض التدريجي ، دون الوصول إلى قيمة التحكم عند 24 ساعة بعد العلاج. على النقيض من ذلك ، زاد تواتر بؤر 53BP1 حتى 4 ساعات بعد العلاج ، ثم انخفض في 6 ساعات وعاد إلى أعلى قيمة بعد 24 ساعة من العلاج (الشكل 4).

Figure 1
الشكل 1: التألق المناعي المزدوج في الخلايا الليمفاوية المحيطية البشرية ل γH2AX و 53BP1: (أ) نوى بدون بؤر γH2AX و 53BP1 قبل معالجة بليوميسين ، (ب) و (ج) نوى بكميات مختلفة من بؤر γH2AX و 53BP1 بسبب العلاج بالبليوميسين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مقارنة بين الخلايا الليمفاوية غير المعالجة والمعالجة بليوميسين (5 ميكروغرام / مل) لعلامتي DSBs. تمثل أشرطة الخطأ التسويق عبر محرك البحث. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مقارنة بين الكمية الإجمالية (التلقائية والمستحثة بالطفرات) لبؤر γH2AX و 53BP1. تمثل أشرطة الخطأ التسويق عبر محرك البحث. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: حركية بؤر γH2AX و 53BP1 . 0 h و 2 h و 4h و 6 h و 24 h تمثل الأوقات المختلفة التي تم فيها حصاد الخلايا الليمفاوية. تمثل أشرطة الخطأ التسويق عبر محرك البحث. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد تحليل التألق المناعي لبؤر γH2AX و 53BP1 طريقة مناسبة لتقييم الضرر الجيني في نوى الطور البيني لنظام الخلية. يحتوي هذا الإجراء على العديد من النقاط الحرجة التي يمكن أن تؤثر على نتائج التجارب ، بشكل أساسي ، العوامل المستخدمة في التثبيت والنفاذية ، ونوع الأجسام المضادة وعوامل تخفيفها ، وتركيز المطفر.

يعد الحفاظ على سلامة البروتين أمرا أساسيا لأن طريقة التألق المناعي تتوقع تحديد المستضدات التي هي في الأساس بروتينات. في هذا البروتوكول ، يستخدم الميثانول لإصلاح الخلايا الليمفاوية. هذه الخطوة مهمة بشكل خاص لأن الكحول يعمل عن طريق إزاحة الماء والتسبب في ترسيب البروتينات القابلة للذوبان ، في حين يمكن إزالة المكونات الخلوية الأخرى غير الثابتة عن طريق الغسيل في محلول ملحي عازل ، مثل PBS13.

ممر رئيسي آخر هو النفاذية التي يتم إجراؤها من خلال حل مانع ، والذي يسمح في هذه الحالة بكل من النفاذية والحجب. يتم إجراء الحجب عن طريق إضافة FBS إلى المحلول: فهو يربط البروتينات في العينة ويمنع الأجسام المضادة من ربط الهدف الخطأ لأن الرابطة بين FBS والهدف المحدد للجسم المضاد يمكن كسرها لاحقا بسبب التقارب العالي بين الجسم المضاد والهدف نفسه. يمكن إجراء النفاذية باستخدام العديد من المذيبات ، وفي هذه الحالة ، يتم استخدام المنظف غير الأيوني Triton X-100: فهو يقحم في طبقة ثنائية فوسفوليبيد ، مما يؤدي إلى إذابة غشاء البلازما ثم تعطيله14.

نظرا لأن اختيار الأجسام المضادة الفعالة γH2AX و 53BP1 أمر بالغ الأهمية لنجاح التألق المناعي ، يوصى بشدة باستخدام الأجسام المضادة ذات الموثوقية المثبتة. يقترح أيضا تجربة العديد من التخفيفات للأجسام المضادة لتحديد التركيز الأفضل أداء.

كتجارب أولية ، درسنا عناصر تحكم مختلفة من أجل تقييم ضوضاء الخلفية المحتملة أو التألق الذاتي. والجدير بالذكر أننا استخدمنا ، في تجارب مختلفة ، الأجسام المضادة الأولية فقط ، والأجسام المضادة الثانوية فقط ، كل بقعة على حدة ، ولا تلطيخ. كما هو متوقع ، في وجود الأجسام المضادة الأولية / الثانوية فقط ، لم نلاحظ أي تركيز ، بينما لاحظنا بقع فلورية خضراء أو حمراء (تشير إلى وجود بؤر γH2AX أو 53BP1) عندما أجرينا البروتوكول مع كل بقعة على حدة. فيما يتعلق بعدم وجود ضوابط تلطيخ ، لاحظنا ضوضاء الخلفية / التألق الذاتي ، والتي تتجلى في تلطيخ منتشر. بدلا من ذلك ، بعد إجراء بروتوكول التألق المناعي ، تكون بؤر γH2AX أو 53BP1 مرئية بوضوح في النوى البنية الداكنة كإشارات خضراء أو حمراء تحت المرشح المناسب للفلوروكرومات المستخدمة (FITC أو TRITC). وبالتالي ، لا تؤثر ضوضاء الخلفية / التألق الذاتي بطريقة كبيرة على تحديد البؤر ، أيضا لأننا استخدمنا معايير محددة من أجل تقييم ما إذا كانت بقعة فلورية واحدة هي التركيز المناسب (على سبيل المثال ، أثناء تركيز المجهر ، لا ينبغي أن تكون بؤر γ-H2AX و 53BP1 على نفس المستوى البؤري لبقع الفلورسنت الأخرى التي يحتمل أن تكون موجودة خارج نواة الخلية). تم اختيار هذه المعايير لأنها تسمح لنا بتقليل الذاتية وجعل تأثير ضوضاء الخلفية / التألق الذاتي ضئيلا.

Bleomycin هو مطفرة جذرية تحفز DSBs عن طريق هجوم الجذور الحرة المحدد للغاية على deoxyribose ، بطريقة مشابهة جدا لكيفية عمل الإشعاع المؤين المنخفض LET (IR). وبالتالي ، يتم تعريف بليوميسين على أنه عامل محاكاة إشعاعية15. نظرا لأن كمية كبيرة من DSBs التي يسببها بليوميسين يمكن أن تؤثر بشدة على تكاثر الخلايا الليمفاوية التي تؤدي ، في أسوأ السيناريوهات ، إلى تنشيط موت الخلايا المبرمج ، يقترح اختبار عدة تركيزات من المطفر لتحديد الجرعة التي يمكن أن تؤدي إلى تكوين DSBs دون أن تؤدي إلى السمية الخلوية.

تظهر العديد من الدراسات أن المسار الرئيسي لإصلاح DSBs الناجم عن الأشعة تحت الحمراء هو NHEJ ، والذي يتم الترويج له من خلال وجود 53BP1 بالقرب من الآفة16,17. ومع ذلك ، على الرغم من أنه من المتوقع حدوث كمية أكبر من بؤر 53BP1 بعد العلاج بالبليوميسين ، والذي يعمل بشكل مشابه للأشعة تحت الحمراء ، في دراستنا ، لاحظنا تواترا أعلى ل γH2AX من بؤر 53BP1. تعتمد الميزة الرئيسية لتحليل بؤر γH2AX و 53BP1 في القدرة على تقييم الاستجابة الخلوية في سياق التعرض أو السياقات المرضية. في الواقع ، من المعروف جيدا أن بؤر γH2AX و 53BP1 هي علامات موثوقة وثابتة لتأثيرات الأشعة تحت الحمراء18 ، بالإضافة إلى وجود بؤر γH2AX تمثل عاملا مهما في النذير في عدة أشكال من السرطان19 ، أو بشكل عام ، يوافقون على تحديد قدرة العوامل أو المواد الكيميائية على زيادة حدوث DSBs. علاوة على ذلك ، يمكن تقييم بؤر γH2AX و 53BP1 لإنشاء علاقة محتملة بين زيادة DSBs ومرض معين20,21 ، للتحقق من العلاج من حيث الاستجابة للعلاج 22,23 ، أو لتقدير الحساسية الإشعاعية للورم 24.

تستخدم مقايسات بؤر γH2AX و 53BP1 على نطاق واسع من أجل تحديد DSBs ، ومع ذلك ، يجب على المؤلفين التأكيد على أن كلتا الطريقتين لهما قيود: يتمثل الشاغل الرئيسي في حقيقة أنهم لا يكتشفون DSBs بأنفسهم ، ولكن عاملين محددين متورطين في عمليات الإصلاح. وبالتالي ، بالنظر إلى أن حركية الإصلاح متغيرة للغاية25 ، فقد يكون تفسير النتائج غامضا.

ومع ذلك ، تشير الدراسة الحالية إلى أن استخدام التألق المناعي المزدوج لتحديد بؤر γH2AX و 53BP1 في وقت واحد يمكن أن يؤدي إلى العديد من المشكلات في تفسير النتائج. ويرجع ذلك أساسا إلى كل من الوجود الأعلى ل γH2AX من 53BP1 في مواقع DSBs والمستويات المنخفضة من إشارات التألق الموضعية المشتركة للعلامتين اللتين لاحظناهما بعد علاج بليوميسين. من ناحية أخرى ، يظل هيستون H2AX مفسفرا على Ser-139 من وقت ظهور DSB حتى يتم إصلاحه ، في حين أن 53BP1 هو بروتين يتم تجنيده في ظل ظروف أكثر تحديدا ، على سبيل المثال عندما يمكن تنشيط NHEJ فقط ، أيضا ، 53BP1 هو المهيمن بقوة خلال المرحلة G1 من دورة الخلية25. علاوة على ذلك ، ربما تم بالفعل تجنيد 53BP1 حيث حدث DSB مع γH2AX ، لكنه استمر لفترة أقصر ، وبالتالي فإن التألق المناعي المزدوج غير قادر على توطينه و γH2AX في وقت واحد. ومع ذلك ، إذا رأى الباحث أنه من الأنسب إجراء تألق مناعي مزدوج ، والذي قدمنا له بروتوكولا مفصلا وموثوقا به ، فمن المهم مراعاة أن هذه الطريقة يمكن أن تؤدي بطبيعتها إلى التقليل من التردد الحقيقي للحدث ، كما هو موضح أعلاه. في الوقت نفسه ، من أجل عدم المبالغة في تقدير الحدث ، يجب تجنب حساب بؤر γH2AX و 53BP1 المترجمة المشتركة كبؤرتين مختلفتين لأنها تشير بالفعل إلى وجود DSB واحد فقط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ونحن ممتنون للمتبرعين بالدم بالكامل ولجميع العاملين الصحيين الذين أخذوا عينات الدم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) Invitrogen A21124 53BP1 secondary antibody
Bleoprim Sanofi bleomycin sulfate (mutagen)
Penicillin-streptomycin solution 100X Euroclone ECB3001D antibiotics for culture medium
PBS 10X Termofisher 14200075 Phosphate-buffered saline
FBS Euroclone EC20180L Fetal Bovine Serum for immunofluorescence
Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated Termofisher #35552 γH2AX secondary antibody
Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody Merck MAB 3802 53BP1 primary antibody
Labophot 2 Nikon Fluorescence microscope
P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody Cell Signaling #2577 γH2AX primary antibody
Phytohemoagglutinin Termofisher R30852801 component of culture medium
Prolong gold antifade reagent with DAPI Cell Signaling #8961 Antifade solution with DAPI for counterstaining
RPMI 1640 Euroclone ECB9006L Culture medium
Triton-X100 Sigma T9284 Nonionic detergent for permeabilization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
  2. Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853 (2020).
  3. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  4. Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
  5. Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
  6. Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
  7. Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
  8. Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).
  9. Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
  10. Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
  11. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  12. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of the cell membrane. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  15. Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
  16. Fei, P., El-Deiry, W. S. P53 and radiation responses. Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).
  17. Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
  18. Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).
  19. Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
  20. Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
  21. Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).
  22. Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
  23. Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).
  24. Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
  25. Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 197 ،
التألق المناعي المزدوج ل γH2AX و 53BP1 في الخلايا الليمفاوية المحيطية البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Falaschi, A., Chiaramonte, A.,… More

Falaschi, A., Chiaramonte, A., Testi, S., Scarpato, R. Dual Immunofluorescence of γH2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes. J. Vis. Exp. (197), e65472, doi:10.3791/65472 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter