Summary
在低代码 AI 平台上使用简单的步骤自动筛选全球医用血液寄生虫。通过在混合深度学习模型中使用目标检测和分类方法，改善了血膜的前瞻性诊断。主动监测和训练有素的模型的协作有助于识别锥虫传播的热点。
Abstract
锥虫病是包括南亚和东南亚在内的世界多个地区的重大公共卫生问题。确定主动监测的热点地区是控制疾病传播的基本程序。显微镜检查是一种常用的诊断方法。然而，它主要依靠熟练和有经验的人员。为了解决这个问题，引入了一个人工智能 （AI） 程序，该程序在内部低代码 AI 平台 （CiRA CORE） 上利用对象识别和对象分类神经网络主干的混合深度学习技术。该程序可以从油浸显微图像中识别和分类原生动物锥虫物种，即 克氏锥虫、 布氏锥虫和 埃文西锥虫。人工智能程序利用模式识别来观察和分析单个血液样本中的多个原生动物，并使用注意力图突出显示每个寄生虫的细胞核和动质体作为特定特征。
为了评估 AI 程序的性能，创建了两个独特的模块，提供各种统计度量，例如准确性、召回率、特异性、精确度、F1 分数、误分类率、受试者工作特征 （ROC） 曲线以及精确率与召回率 （PR） 曲线。评估结果表明，人工智能算法在识别和分类寄生虫方面是有效的。通过提供快速、自动化和准确的筛查工具，该技术有可能改变疾病监测和控制。它还可以帮助地方官员就疾病传播阻断战略做出更明智的决定。
Introduction
锥虫病是全球健康问题面临的重大挑战，因为多种人畜共患物种引起人类疾病，其地理分布范围很广，分布在非洲和美洲大陆以外的地区，如南亚和东南亚1,2,3。非洲人类锥虫病 （HAT） 或昏睡病是由布氏冈比亚锥虫和罗得西亚锥虫引起的，它们分别产生慢性和急性形式，代表了非洲的主要传播。由于采采蝇的受感染唾液传播，致病寄生虫属于唾液组4.鉴于由克氏锥虫引起的众所周知的美国锥虫病（恰加斯病）一直是非流行国家的公共卫生问题;包括加拿大、美国、欧洲、澳大利亚和日本，因为个体经常从流行地区迁移5.锥虫感染属于 Stercoraria 组，因为它是由 reduviid 虫子的受感染粪便传播的。由埃文西锥虫感染引起的锥虫病和锥虫病（苏拉病）在非洲、南美洲、西亚和东亚以及南亚和东南亚国家流行 3,6。尽管已有由锥虫引起的人类锥虫病的报道 3,4,7,8,9,10,11,12，但寄生虫感染的传播途径存在争议：机械或受感染的血液通过食血昆虫（如采采蝇和塔巴尼德或马蝇）6,7， 8,9,10,12,13,14.泰国尚未发现病例报告，但已公布东部地区15 犬、赛马和水牛的 T. evansi 感染率很高16，这表明家畜之间会发生获得性传播。报道了几种由动物锥虫引起的非典型人类感染（间日锥虫、布氏锥虫、刚果锥虫、刘易斯锥虫和埃文西锥虫），这些感染不是人类锥虫的经典形式17。对非典型人类感染的认识可能被低估了，这突出表明需要改进诊断测试和实地调查，以发现和确认这些非典型病例，并允许适当控制和治疗影响全球牲畜、粮食安全和人类保健的动物致病性疾病18。这导致开发了一种与现有通用方法（显微镜检查）相结合的潜在策略，以便在主动监测期间快速筛查偏远地区的血液样本，从而能够确定限制和控制疾病的热点区域。
在多种家畜（如单峰骆驼、牛、马和狗）中偶发 Surra 病，可引起 euryxenous T. evansi 对人类的影响 1,4,13,14。人类感染似乎是不可能的，因为人血清中由sra样基因表达的锥虫溶解因子能够预防人布氏锥虫和刚果锥虫12,19。此外，正如印度的第一份病例报告所表明的那样，该疾病与免疫功能低下的艾滋病毒患者无关4。如上所述，可能的人类感染可能与锥虫溶解因子功能异常的高密度脂蛋白缺乏有关，这是一种罕见的常染色体隐性遗传病，即丹吉尔病4。2016 年，一名越南患者被发现具有两个野生型 APOL1 等位基因，血清 APOL1 浓度在正常范围内。然而，APOL-1 缺陷的理论不再被认为是有效的12.因此，锥虫感染的一种可能机制是在职业动物养殖过程中伤口与受感染的动物血液直接接触 4,12。显微镜检查显示，锥鞭毛体的形态是锥鞭毛体的单态形式，包括一种主要的细长、鞭毛和分裂锥虫，其与它们的相对种种布氏锥虫相似1,12,13。细胞核位于中心位置，后部位置有一个可见的小动质体。之前的一项研究表明，寄生虫可以以两种可比较的形式存在，称为经典形式和截断形式。然而，仍然有必要确认它们各自对宿主的致病作用20。症状过程各不相同，包括与发冷和出汗相关的间歇性发热。幸运的是，Suramin是早期人类非洲锥虫病的成功一线疗法，没有侵犯中枢神经系统（CNS），治愈了印度和越南的患者4,12,21。
除临床体征检查外，还存在几种针对 T. evansi 寄生虫的诊断方法，包括寄生虫学显微镜观察 4,9,12、血清学 4、8、9、10、12 和分子生物学试验 4,12.用 Giemsa 染色的薄血膜通常用于观察显微镜检查下存在的寄生虫，这是常规和常用的22。然而，该程序似乎是可行的;尽管如此，它既费时又费力，评估者之间的评估差异很大，仅对急性期敏感，并且需要个人实习生23。分子生物学和血清学检测也需要高技能的人员来执行样品制备的多个过程，包括提取和纯化样品，然后用昂贵的仪器进行测试，这很难标准化，有被寄生外物质污染的风险，以及结果的差异24.基于上述基本原理，需要快速和早期筛查技术来支持现场监测研究，并确保及时报告调查结果，以确定进一步控制疾病传播的热点地区1,8。基于计算机的设备 （CAD） 已被提议作为医学领域的创新技术，包括组织病理学和细胞病理学任务25。上面提到的CAD是高速执行的，并使用模式识别（即人工智能（AI））进行计算。人工智能方法是使用卷积神经网络算法完成的，该算法可用于处理大量数据集样本，特别是监督学习方法，该方法在数据消耗时训练训练有素的模型。
一般来说，人工智能是计算机解决需要专家智能的任务的能力，例如数据标记。机器学习 （ML） 是 AI 的一个子领域，它表示为一个计算机系统，具有两个不同的过程，包括特征提取和模式识别。深度学习 （DL） 或高级 ML 算法是指开发计算机化程序和设备，将类似人类的性能与更高和等于人类专业人员完成的精度水平进行比较26.目前，DL在医学和兽医领域的作用正在有希望地扩大和彻底改变传染病预防，目的是最近的预防并将其指导给个别卫生人员22,27。潜在的深度学习应用是无限的，具有质量标签和大量增强数据集，使专家能够腾出时间来管理项目任务。具体而言，数字图像的进步以及计算机辅助分析改善了报告的五类病理学的自动诊断和筛查;包括静态、动态、机器人、全玻片成像和混合方法28.有必要考虑到，深度学习算法方法和数字图像数据的整合可以鼓励当地工作人员在日常实践中利用该技术。
此前，使用混合模型的预测准确性的提高已被证明27.为了识别显微图像中的锥虫寄生虫，本研究提出了两种混合模型，结合了YOLOv4-tiny（目标检测）和Densenet201（目标分类）算法。在几种检测模型中，具有 CSPDarknet53 骨干的 YOLOv4-tiny 在定位和分类方面表现出高性能作为预测结果29。由于实时检测器修改了输入网络分辨率、卷积层数量、总参数和层输出数量之间的最佳平衡，因此与以前的版本相比，它改进了快速运行速度的优先级并针对并行计算进行了优化。密集卷积网络 （DenseNet） 是另一种流行的模型，可在竞争数据集中实现最先进的结果。DenseNet201 产生了与 ResNet101 类似的验证错误;但是，DenseNet201 的参数少于 2000 万个，少于 ResNet101 的 4000 多万个参数30。因此，DenseNet模型可以通过增加参数数量来提高预测精度，而不会出现过拟合的迹象。在这里，人工智能 （AI） 程序利用混合深度学习算法，在内部 CiRA CORE 平台上具有深度检测和分类神经网络主干。开发的程序可以从油浸显微图像中识别和分类原生动物锥虫物种，即 克氏锥虫、 布氏锥虫和 埃文西锥虫。该技术有可能通过提供快速、自动化和准确的筛查方法彻底改变疾病监测和控制。它可以帮助当地工作人员就寄生原生动物疾病的传播阻断策略做出更明智的决定。
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Protocol
存档的血液胶片和项目设计得到了朱拉隆功大学兽医学院机构生物安全委员会、机构动物护理和使用委员会（IBC 第 2031033 号和 IACUC 第 1931027 号）和叻克拉邦国王理工学院人类研究伦理委员会 （EC-KMITL_66_014） 的批准。
1. 原始图像的准备
- 影像数据集准备
- 获得至少 13 张血液寄生虫感染的阳性载玻片，包括布 氏锥虫、 克氏锥虫 和埃 文西锥虫，经寄生虫学家专家确认。将 13 张幻灯片分开，用于培训（10 张幻灯片）和测试（3 张幻灯片）。
- 在带有数码相机的光学显微镜的油浸场下获取上述Giemsa染色的薄血膜的图像。在显微镜检查下获得包含所有三种寄生虫物种的锥鞭毛体的多个物体的图像;寻找细长的形状、长长的尾巴、起伏的膜和前端的动质体。
注意：创建厚涂片和薄涂片将增强急性期锥虫病的检测 31。WHO32 建议通过手指刺血来采血。然而，薄膜在识别 克氏锥 虫和其他物种方面更有效，因为这些生物体在厚膜中往往会变形33。有鉴于此，我们利用薄血膜图像来保持寄生虫的适当形态，以进行本研究。 - 将所有图像存储在具有以下规格的寄生虫特定文件夹中：1,600 x 1,200 像素、24 位深度和 JPG 文件格式。以 ~6：1 的比例将图像拆分为训练集和测试集。
注：见 https://gitlab.com/parasite3/superior-auto-identification-of-medically-important-trypanosome-parasites-by-using-a-hybrid-deep-learning-model/-/blob/main/JOVEimage.zip;将 650 张图像拆分为训练（560 张图像）和测试（90 张图像）模型。 - 将感兴趣区域定义为两类的矩形标签：锥虫和非锥虫。使用自动裁剪模块，使用训练有素的对象检测模型裁剪所有检测到的图像。自动裁剪模块是在内部CiRA CORE程序中开发的模块（参见 材料表）。为每个图像收集一个对象，用于训练对象分类。
注：对于本文，1,017 张图像被拆分为训练（892 张图像）和测试（126 张图像）。模型训练使用四个标记类别进行，包括白细胞、 布氏锥虫、 克氏锥虫 和 埃文西锥虫。
2. 使用内部CiRA CORE平台的培训过程
- 开始一个新项目
- 从计算机桌面打开CiRA CORE应用程序（请参阅 材料表），然后双击程序 的图标创建一个新项目。
- 选择左侧垂直工具栏上的 操作图标 以选择所需的工具。
- 目标检测模型训练
- 使用拖拽方式选择用于数据标注和训练的 training-DL 模型函数。转到“常规”工具栏 |CiRA 人工智能 |拖拽 DeepTrain |将 DeepTrain 拖放到屏幕上（右侧）。
注意：对于其他选项，请右键单击所选工具并执行相应的功能： 复制、剪切 或 删除。 - 使用 DeepTrain 工具的设置导入图像。单击“加载图像”按钮并导航到图像目录。通过按住左键单击并命名所选对象来标记对象。通过单击“显示设置”按钮调整矩形线条粗细和字体大小，并将 GT 另存为同一目录中的 .gt 文件。
注意： 根据需要保存以避免任何不希望的情况，例如电源短缺、程序自动关闭和在标签过程中挂起。 - 在模型训练之前，使用四种增强技术扩展数据以收集足够的信息： 旋转、对比度、噪声 和 模糊。单击 “Gen Setting ”按钮以访问此功能。
- 通过单击 DeepTrain 工具中的训练按钮启动模型训练。训练部分有两个子功能：生成训练文件和训练。在“生成训练文件”功能下，选择所需的模型、批量大小和细分。单击“生成”按钮以生成数据并将其保存在目录中。在训练函数中，选择以下选项：i） 将另一个生成的训练位置用于条件和备份，ii） 使用预构建的权重进行继续训练，或 iii） 覆盖当前训练设计的参数。这将设计模型配置和训练条件。
注意：生成过程时间取决于图像文件大小、增强使用情况和可用内存空间。 - 完成所有必要的配置后，单击 “训练 ”按钮开始模型训练。允许程序连续执行，在训练过程中评估训练损失并调整数据集的权重。如果模型达到最佳损失，则通过单击 “导出 ”按钮将训练的权重文件保存在指定目录中。
- 使用拖拽方式选择用于数据标注和训练的 training-DL 模型函数。转到“常规”工具栏 |CiRA 人工智能 |拖拽 DeepTrain |将 DeepTrain 拖放到屏幕上（右侧）。
3. 目标检测模型评估
- 选择 目标检测模型评估 功能，使用 拖拽 方式进行模型评估。转到 插件 工具栏 |评估 |拖动 EvalDetect |将 EvalDetect 拖放 到屏幕上（右侧）。
- 单击 “设置 ”并等待三个功能： 检测、评估 和 绘图。通过单击 Load Config 从目录导入训练的权重文件（步骤 2.2.5）来启动模型评估。
- 在 检测 功能下，选择 非最大抑制 （NMS） 值 ，通过消除冗余误报 （FP） 检测来提高准确性。NMS 删除了重复的模型生成的检测，以提高可靠性。
- 在 “评估 ”功能下继续执行以下步骤：
- 通过单击 “浏览”从映像文件目录导入测试映像。通过单击加载 GT，从步骤 2.2.2 中保存 GT 文件的目录导入 GT 文件。
- 选择 Intersection over Union （IoU） 值 以评估特定影像测试数据集的准确性。
- 单击 “评估 ”按钮，评估指定目录下的检测模型。评估完成后，结果将自动保存为同一目录中的CSV文件，并按类名排序。此 CSV 文件将提供基本参数，例如每个类别的 真阳性 （TP）、假阳性 （FP）、假阴性 （FN）、召回率和 精度 。
- 要绘制 精确召回率 （PR） 曲线，请在 Plot 函数下执行以下步骤： 通过单击浏览从上一部分（步骤 3.4）目录导入 CSV 文件。从列表中选择类，然后单击 “绘图 ”按钮以显示可编辑的 PR 曲线图像。
- 最后，要将具有 PR 曲线 AUC 值的图像以所需的图像格式保存在指定目录中，请单击图像的“ 保存 ”按钮。
4. 每张图片的单个对象的图像裁剪
- 在裁剪图像之前，请完成以下步骤：
- 通过访问 图像幻灯片工具的设置，从图像文件目录导入图像。
- 通过访问 深度检测 工具的设置，导入经过训练的权重文件（保存在步骤 2.2.8 中）。单击 “配置 ” 按钮|“+ ”按钮，选择 后端 （CUDA 或 CPU），提供 名称，单击 “确定”，选择权重文件目录，然后单击 “选择”。在 深度检测 工具中，选择检测参数（阈值 和非 最大值抑制 （nms））; 图纸 参数; 跟踪 参数;和 感兴趣区域 （ROI） 参数。
- 通过访问深度裁剪工具的设置，选择将保存裁剪图像的目录。单击浏览 | 选择保存裁剪图像的目录 | 单击选择 | 选择图像格式（jpg 或 png）|启用“自动保存”选项。
- 裁剪图像以获取每个图像的单个对象，以便进行图像分类和分割。要执行此过程，请使用四个工具并在它们之间建立连接：转到 “常规”工具栏 |一般 |按钮运行。接下来，导航到 “常规”工具栏 |CiRA 人工智能 |深度检测;然后，转到 “常规”工具栏 |CiRA 人工智能 |DeepCrop 的。最后，转到 图像工具栏 |收购 |图片幻灯片。
- 完成所有必要的设置后，单击 按钮运行 工具启动图像裁剪过程。
- 获取由大小为 608 x 608 的单对象图像组成的新图像训练数据集。
5. 图像分类作为模型训练
- 使用 拖拽 选择 图像分类模型训练 功能进行数据训练。转到 “图像”工具栏 |DeepClassif 的 |拖拽 ClassifTrain |将 ClassifTrain 拖放 到屏幕上。
- 使用 ClassifTrain 工具的设置导入用于模型训练的图像。单击 “打开文件夹 ”按钮并导航到所需的图像目录。在训练之前，通过单击 “增强 ”按钮来展开数据，以获取更多信息，使用 旋转、 对比度、 翻转 （水平和/或垂直）、 噪点和 模糊等技术。
- 要开始模型训练，请单击 ClassifTrain 工具的 GenTrain 按钮。在 GenTrain 函数下，选择模型、批量大小和细分。分配一个目录来保存生成的文件。单击“生成”按钮以继续处理数据进行训练。在训练功能中，勾选相应的选项：使用默认体重或自定义体重继续训练。
注意：生成过程可能需要一些时间，具体取决于图像文件大小、增强使用情况、类平衡和可用内存空间等因素。 - 完成所有准备工作后，单击 “开始 ”按钮启动模型训练。允许程序连续执行，在训练过程中评估训练损失并调整数据集的权重。如果模型达到所需的损失水平，则通过单击“ 导出 ”按钮将训练的权重文件保存到指定目录。
6. 分类模型评估
- 选择 图像分类模型评估 功能，使用 拖拽 方式进行模型评估。转到 插件工具栏 |评估 |拖动 EvaluateClassif |将 EvaluateClassif 拖放 到屏幕上（右侧）。
- 单击 “设置 ”以访问 EvaluateClassif 工具中的其他函数，即 Evaluate 和 PlotROC。
- 要启动模型评估，请单击 EvaluateClassif 工具中的评估按钮。在“评估”功能下执行以下步骤。
- 通过单击“ 加载文件夹”图像，从图像文件目录导入测试图像。通过单击 Load Config 从目录（保存在步骤 5.4 中）导入训练的权重文件。单击 “开始 ”按钮以评估分类模型。
- 评估完成后，单击“ 导出到 CSV ”按钮，将评估的文件另存为指定目录中的 CSV。要评估每个阈值的数据，请单击“ 开始所有阈值”，将具有类名的 CSV 文件保存在指定目录中。保存的 CSV 文件包括每个类的 Recall （真阳性率）、 假阳性率和 精度 等参数。
- 要绘制接收机工作特性 （ROC） 曲线，请单击 EvaluateClassif 工具中的 PlotROC 按钮。按照 PlotROC 函数下的以下步骤操作。
- 通过单击“ 浏览”从之前获取的目录导入 CSV 文件。检查导入的类列表，并选择每个类标签以绘制 ROC 曲线。
- 单击 “绘图 ”按钮将 ROC 曲线可视化为图像。进行所需的编辑以调整图像属性，包括字体大小、字体颜色、小数点舍入、线条样式和线条颜色。
- 最后，通过单击“ 保存 ”按钮，将具有所需图像格式的 AUC 值的 ROC 曲线图像保存在指定目录中。
7. 使用 CiRA CORE 应用程序测试流程
- 将目标检测作为模型测试
- 要执行模型测试，请使用四个工具并在它们之间建立连接。转到 “常规”工具栏 |一般 |按钮运行。然后， 常规工具栏 |一般 |调试。之后，单击 “常规”工具栏 |CiRA 人工智能 |DeepDetect，最后是 图像工具栏 |收购 |图片幻灯片。
- 在测试映像之前，请按照下列步骤操作：
- 通过单击图像幻灯片工具中的“设置”选项，从图像文件目录导入测试图像。
- 通过单击 DeepDetect 工具中的“设置”选项，从步骤 2.2.8 导入保存的训练砝码文件。单击“配置”按钮，然后单击“+”按钮，选择后端（CUDA或CPU），提供名称，单击“确定”，选择权重文件目录，然后单击“选择”。在 DeepDetect 工具下，选择检测参数（阈值和 nms）、绘图参数、跟踪参数和 ROI 参数。
- 通过单击调试工具中的图像功能来查看测试图像结果。
- 最后，通过单击“按钮运行”工具上的“运行”按钮来检查每个图像的预测结果。
- 图像分类作为模型测试
- 要执行模型测试，请使用四个工具并在它们之间建立连接。转到 “常规”工具栏 |一般 |按钮运行;然后， 常规工具栏 |调试。之后，导航到 图像工具栏 |收购 |ImageSlide，最后是 图像工具栏 |DeepClassif 的 |DeepClassif。
- 在测试映像之前，请按照下列步骤操作：
- 通过单击图像幻灯片工具中的“设置”选项，从图像文件目录导入测试图像。
- 通过单击 DeepClassif 工具中的设置选项，从第 5.5 节导入保存的训练权重文件。单击 Config 按钮 | + 按钮 |选择后端（CUDA 或 CPU） |提供名称 |单击“确定”|”选择权重文件目录 |单击“选择”。在 DeepClassif 工具下，选择分类参数（阈值和顶级预测数）、指南图参数（阈值、alpha、beta 和颜色图）以及颜色图中的各种参数。
- 通过单击调试工具中的图像功能来查看测试图像结果。
- 最后，通过单击“按钮运行”工具上的“运行”按钮来检查每个图像的预测结果。
8. 混合（检测和分类）作为模型测试
- 要执行此模型测试，请使用四个工具并在它们之间建立连接。转到 “常规”工具栏 |一般 |按钮运行。然后， 常规工具栏 |一般 |调试。之后， 图像工具栏 |收购 |ImageSlide，最后是 图像工具栏 |DeepComposite （深层复合材料） |DeepD->C。
- 在测试图像之前，请按照下列步骤操作： 通过单击图像幻灯片工具中的“设置”选项，从图像文件目录导入测试图像。通过单击 DeepD->C 工具中的“设置”选项，从第 2.1.5 节和第 4.4 节导入两个保存的训练砝码文件：
- 对于检测功能，单击配置按钮|+按钮，选择后端（CUDA或CPU）|提供名称 |单击确定 | 选择权重文件目录 | 单击“选择”。在检测功能下，选择检测参数（阈值和nms）、绘图参数、跟踪参数和ROI参数。
- 对于 Classif 函数，单击 Config 按钮 |+ 按钮，选择后端（CUDA 或 CPU）|提供名称 |单击“确定”|“选择权重文件目录”|“选择”。在 Classif 函数下，选择分类参数（阈值和顶级预测数）和指南图参数（阈值、alpha、beta 和颜色图）。
- 通过单击调试工具中的图像功能来查看测试图像结果。最后，通过单击“按钮运行”工具上的“运行”按钮来检查每个图像的预测结果。
9. 五重交叉验证
注意：为了更有效地验证所提出模型的性能，使用了 K 折叠交叉验证。
- 将数据集分为五个部分，对应于交叉验证的五个倍数。在模型训练和测试的每次迭代中，使用一个部分作为测试的验证集，其余四个部分用于训练。重复此过程五次，每次折叠用作验证集一次。
- 对于折叠 1 到 5：
- 重复第 5 节，使用来自四个折叠的训练数据训练模型。
- 重复第 7.2 节，使用剩余的折叠作为测试集来测试模型。
10. 模型评估
- 混淆矩阵
- 根据测试结果，将发生以下四个条件：
- 真阳性 （TP）：当输入图像为 true，并且预测也为 true 时。
- 误报 （FP）：当输入图像为假，但预测为真时。
- 假阴性 （FN）：当输入图像为真，但预测为假时。
- 真负 （TN）：当输入图像为假，并且预测也是假时。
- 使用这四个条件，使用混淆矩阵评估性能。
- 根据测试结果，将发生以下四个条件：
- 绩效评估
- 最常用的分类性能指标是 准确度、 精密度、 召回率、 特异性和 F1 分数值。计算等式 （1-6） 中的所有评估指标，用于根据混淆矩阵中的值评估模型性能。
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- 最常用的分类性能指标是 准确度、 精密度、 召回率、 特异性和 F1 分数值。计算等式 （1-6） 中的所有评估指标，用于根据混淆矩阵中的值评估模型性能。
- ROC曲线
注意： ROC 曲线 是具有不同阈值设置的分类问题的性能度量。ROC 曲线下面积 （AUC） 表示可分离性的程度或度量，而 ROC 是概率曲线。- ROC 曲线是一个二维图形，其真阳性率 （TPR） 和假阳性率 （FPR） 值分别绘制在 Y 轴和 X 轴上。使用从混淆矩阵获得的 TPR 和 TFR 值构建 ROC 曲线。TPR值与灵敏度相同;使用公式 （7） 计算 FPR 值。
(7) - 获取 TPR 和 FPR 值后，在 Python 环境中使用 Jupyter Notebook 开源 Web 工具绘制 ROC 曲线。AUC是评估所提模型在ROC曲线分析中性能的有效方法。
- ROC 曲线是一个二维图形，其真阳性率 （TPR） 和假阳性率 （FPR） 值分别绘制在 Y 轴和 X 轴上。使用从混淆矩阵获得的 TPR 和 TFR 值构建 ROC 曲线。TPR值与灵敏度相同;使用公式 （7） 计算 FPR 值。
- PR曲线
- 使用 PR 曲线通过测量 PR 曲线下的面积来评估模型。通过使用模型的置信度阈值函数绘制模型的精度和召回率来构建 PR 曲线。由于 PR 曲线也是二维图形，因此在 x 轴上绘制 Recall，在 y 轴上绘制 Precision。
- 在 Python 环境中使用开源 Jupyter Notebook Web 工具绘制 PR 曲线，就像 ROC 曲线一样。准确率-召回率曲线 （AUC） 分数下的区域也有助于多标签分类。
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Representative Results
在这项研究中，提出了混合深度学习算法来帮助自动预测锥虫寄生虫感染的血液样本的阳性性。使用基于暗网骨干神经网络的物体检测算法，对存档的 Giemsa 染色血片进行分类，以定位和分类寄生与非寄生。在前人模型得到的任意矩形框预测结果中，开发了最佳选择的分类模型，对布 氏锥虫、 克氏锥虫 和 埃文西锥虫等3种具有医学和兽医意义的锥虫进行分类。所使用的混合模型的最终输出揭示了所提出的模型对可能影响预测结果的 100 倍显微图像变化的稳健性，包括寄生虫的血液阶段形态。此外，环境因素可能会通过存储时间、显微镜光源的强度和血膜制备技能来干扰染色变色的图像质量。尽管如此，选择最好的型号可以以高性能实现目标。
多类标签的本地化和分类
由于在油浸显微镜下检测Giemsa染色血膜的寄生原生动物很繁琐，并且会延长周转时间，这会导致容易出现误差偏差。训练有素的 AI 方法需要大量图像数据，可重新缩放 416 x 416 像素和 3 RGB 颜色通道的不同特征特征，以提高对定位和分类的正确预测。训练和优化模型期间的参数数量设置为学习率为 0.002，老化为 1,000，范围步长在 400,000 到 450,000 之间。在动量为0.9、色调为0.1、衰减为0.0005时，训练损失低、训练精度高被认为是最佳水平或饱和度。在使用看不见的数据的测试阶段，使用交集并集 （IOU） 和概率百分比的概念进行正确的定位和分类。检验解释结果在阈值为50%，非最大抑制（NMS）为0.4时进行，给出的正确答案为%概率。
与所研究的所有寄生血片一样，通过使用检测神经网络模型对非锥虫进行锥虫与非锥虫的区分，该模型可用于定位和分类 （图1）22。所提出的检测任务的预测结果显示，平均精度为93.10% （表1）。尽管经过训练的检测模型可用于识别非锥虫类别比用于识别锥虫寄生虫的模型更多，但它为我们带来了两个类别标签的精度都高于 91%。此外，精确率与召回率曲线显示高平均AUC值为0.969，寄生虫和非寄生虫的AUC值分别为0.976和0.961 （图2）。这促使我们向自己保证，经过训练的模型是值得信赖的。使用内部CiRA CORE程序下的图像捕获模块裁剪了第一个检测结果的矩形框。上面提到的裁剪图像被分类到三个特定于锥虫物种的文件夹中。准备此过程是为了为训练分类模型输入数据，这将在下一小节中说明。
分类：按模型分类
为了找到一个经过适当训练的模型来对已知的寄生虫物种进行分类，将 布氏锥虫、 克氏锥虫 和 埃文斯锥虫 保存在分配了其相对类名的文件夹中。在AI训练过程中，将重新缩放的256 x 256像素图像输入三个RGB通道，学习率为0.1，老化率为1000，动量为0.9，色调为0.1，衰减为0.0005。利用训练损失和训练精度找到最优训练模型。使用像素级确定和阈值为 50% 的概率概念对分类预测进行分析。
研究了三种流行的分类神经网络算法的比较，以找到最佳的分类神经网络算法27,30。这三种神经网络已广泛用于医学和兽医领域的多类标签分类27,34,35。经过训练的模型的推理结果，概率为 0 到 1 的百分比，在 50% 的阈值以上是合理的。此外，通过注意力图突出显示了每种寄生虫的不同模式识别，并特异于T. evansi中部的细胞核。与其他两个物种相比，克氏锥虫前部最大的动质体细胞器也被突出显示。核酸酶和动质体都通过布氏锥虫的注意力图谱得到强调（图3）。
使用几个统计指标来衡量所提出的三个模型，包括准确性、误分类率、召回率（真阳性率）、特异性（真阴性率）、假阳性率、假阴性率、精确度和 F1 分数。因此，几乎所有使用 Densenet201 神经网络的评估指标都显示出优于其他指标的值。平均而言，准确率、召回率、特异性、精密度和 F1 分数的指标值显着更高，等于 98%。然而，模型性能重要性显示小于等于 1.5% 的错误分类、假阳性和假阴性率（表 2）。考虑到类别比较，Densenet201 模型似乎正确地识别 了 T. evansi ，而使用看不见的测试数据这样做，这表明潜在的训练模型用于区分寄生虫种类。
在图4A-C中，ROC曲线下的AUC给出了最大程度的平均精度，为0.931，从最佳分类模型（图4C）获得，这代表了对所研究的最佳选择模型的确认。伊万西锥虫的AUC为0.817，低于其他指标（布氏锥虫为0.980-1.00，克氏锥虫为0.955-0.977），与上述统计指标形成鲜明对比。这可能是因为这两个值是由不同的公式计算的。AUC 是从所有阈值中获得的，但统计指标仅从 50% 的阈值获得，这表明这两个值无法比较。因此，从所有三个模型中获得的类别名称的一致AUC值分别表明布氏锥虫>克氏锥虫>埃文西锥虫的总体准确性。
K-fold 交叉验证
为了评估在估计真实预测误差和调整模型参数方面研究的最佳选择分类模型的鲁棒性，如上所述36，使用了五重交叉验证技术。将数据随机拆分为五个文件夹。在使用所选分类算法进行训练之前，准备了由四个文件夹分配的训练数据和其余文件夹的测试数据。
因此，平均统计指标;准确率、召回率（真阳性率）、特异性（真阴性率）、精确率和 F1 评分提供了所研究的统计指标的相似值，显示大于 98%（表 3）。考虑到所研究的每个指标，发现准确性排名为 0.992-1.000。提供了 0.994 至 1.000 的高特异性值。召回率和 F1 分数的范围都在 0.988 到 1.000 之间，同样，通过精确度研究了 0.989-1.000。有趣的是，误分类、假阴性和假阳性率低于 1.2%。这种质量性能支持具有不同数据折叠的出色训练模型，并代表了鲁棒性。
与所提出的指标一起，获得的ROC曲线下的平均AUC显示闭合值范围为0.937至0.944，在数据的五个折数中给出了相似的一般精度值（图5）。按类别比较，埃 文西锥虫的AUC变化为0.831， 克氏锥虫 的AUC为0.982-1.000， 布氏锥虫的AUC为1.000。尽管 T. evansi 的 AUC 值低于其他值，但这些值可能暴露于属于 1% 至 97% 阈值的高度假阳性率 （~33%），这导致与其他两类相比，AUC 值较小（图 6）。
混合深度学习：实用筛选
在本节中，混合深度学习方法在目标检测和分类技术之间的贡献如 图 7 所示。使用第一个检测模型区分了寄生虫和非寄生虫特征，并在粉红色边界框内识别了它们的相对类别。接下来，使用训练有素的分类模型诊断出不同颜色的寄生虫的特定种类。绿色标签为 T. evansi，粉红色标签为 布氏锥虫，橙色标签为 克氏锥虫。如果第一个检测模型失败，则不会显示第二个分类标签，这表明在内部 CIRA CORE 平台的 D-C 模块中，这两个不同的神经网络主干之间连接良好的功能。
图 1：混合模型的体系结构。 锥虫的所有三种寄生虫（包括 埃文西锥虫、 布氏锥虫 和 克氏锥虫）均被用作输入。使用检测模型检测100倍显微图像中的多目标。然后，使用最佳分类模型根据其相对物种对先前模型中的单个裁剪对象进行分类。与最佳分类模型集成的注意图突出显示了每个类标签的特定区域。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：PR 曲线。 在这项研究中，PR 曲线下面积或 AUC 值用于衡量区分非锥虫和锥虫类别的能力。所有样品都可以在两个类别标签上检测到。AUC 为 1 是完美预测，而 AUC 为 0.5 是随机预测。该曲线用于测量所提出的检测模型的性能。该模型可以以比非锥虫类（AUC = 0.961）更高的速率（AUC = 0.976）检测锥虫类。平均AUC值为0.969，来自非锥虫和锥虫两个类标签的二元结果。缩写：PR = 精确度与召回率;AUC = 曲线下面积。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：分类模型的预测结果。 所有三种锥虫物种都用于测试最佳训练模型。显示了基于物种分类的概率图和注意力图的输出图像。具体来说，注意力图突出了看不见的物体中指导寄生虫物种辨别的重要区域。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：基于模型比较的 ROC 曲线。 ROC 曲线下的 AUC 是基于其不同区分阈值的分类系统性能的图形图。与 AUC-PR 曲线类似，AUC-ROC 为 1 是完美预测，而 AUC 为 0.5 是随机预测，在每个图中用虚线表示。比较了三种分类模型，包括（A）平均AUC为0.925的第一分类模型 ，（B）平均AUC为0.924的第二分类模型 ，以及（C）平均AUC为0.931的最佳分类。因此，AUC越高，性能越好。缩写：ROC = 接收机工作特性;AUC = 曲线下面积。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：五重交叉验证。 比较了所有基于最佳分类神经网络模型的实验。五倍数据的类似AUC值包括（A）0.944，（B）0.944，（C）0.937，（D）0.941和（E）0.938，这表明所提出的训练模型针对生物学数据变异的稳健性。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：每个类名的真阳性率和假阳性率。 X 轴表示从 1% 到 97% 的阈值。Y 轴代表统计指标的度数。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 7：混合动力模型的最终输出。 混合模型贡献的最后一步可以将输入数据作为 20 μm 的原始显微图像应用。预测结果可以从目标检测和分类模型中获得。第一个预测结果提供了看不见的测试图像是否包含带有矩形（粉红色标签）的锥虫寄生虫。然后，在获得特定于寄生虫物种的分类结果之后，将首先使用多色标签进行检测;绿色代表 T. evansi，粉红色代表 T. brucei， 橙色代表 T. cruzi。 请点击这里查看此图的较大版本.
表 1：检测模型的类别平均精度和平均精度 （mAP）。请按此下载此表格。
表 2：分类模型比较。 使用8个评估指标来衡量模型的性能，包括准确率、误分类率、召回率（真阳性率）、特异性（真阴性率）、假阳性率、假阴性率、精确度和F1分数。粗体值表示每个类标签的最大值。斜体值表示每个评估指标的平均值。 请按此下载此表格。
表 3：五重交叉验证。 粗体值表示每个评估指标的平均值。 请按此下载此表格。
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Discussion
锥虫原生动物感染的显微镜观察是早期和常用的，特别是在偏远地区的监测期间，那里缺乏熟练的技术人员和劳动密集型和耗时的过程，这些都是及时报告卫生组织的障碍。尽管免疫学和聚合酶链反应（PCR）等分子生物学技术已被批准为高灵敏度方法，以支持实验室发现的有效性，但需要昂贵的化学品、仪器和专业人员来处理它们，这些技术大多位于大型医疗中心的中央实验室。共有的形态、混合和未成熟感染以及三种锥虫物种的特征容易引起用户偏向和误认，从而降低了药物反应和控制措施37。在拟议的人工智能程序中，在两个不同的深度学习模型之间使用修改后的混合算法可以克服许多挑战，使标准分类的新时代自动和实现。先前的出版物已经证实了混合模型在识别疟疾血期方面的潜力27,38。以下是对所提出的 AI 模型的训练、测试和评估协议的解释，以识别三种著名的锥虫物种的成熟阶段，并简化流程，以分析在微观场下对寄生原生动物进行实际识别和进一步定量。
所提出的模型超越了使用随机森林算法的机器学习模型，该算法已应用于从血涂片样本中识别克氏锥虫的感染。机器学习模型的精度为87.6%，灵敏度为90.5%，受试者工作特征曲线下面积为0.94239。2015 年，进行了两种称为 AdaBoost 学习和 SVM 学习的方法，以区分血涂片中的克氏锥虫和疟疾感染。尽管报告了高度的敏感性和特异性，但研究了 120 张低维 256 × 256 像素彩色图像的有限数据集，这可能不能代表整个人群40。在这项研究中，使用所提出的杂交模型分离了三种著名的人畜共患锥虫物种（例如，克氏锥虫、布氏锥虫和埃文西锥虫），该模型优于上述先前的研究。这代表了深度学习模型的成本效益。然而，一些大型数据集可能需要验证所提出模型的性能以确认其泛化41。T. lewisi有可能机会感染人类，它被认为是一种由老鼠传播的新兴人畜共患疾病，通常与贫困条件有关。一些国家已记录病例，例如泰国和中国20,42。此外，T. evansi 和 T. lewisi 的形态具有惊人的相似之处17。为了增强数据集和所提出的模型，包含更多的 T. lewisi 实例可能有利于未来深度学习模型的开发。为了扩大用于诊断其他动物锥虫病的潜在深度学习技术的范围，建议收集其他物种的数据集，例如间日锥虫、锥虫和甲虫。需要解决的一个重大挑战是诊断涉及各种锥虫物种的混合感染，因为抗体检测方法可能由于交叉反应而表现出特异性降低43。必须加强和加强诊断技术，以推进人工智能应用并保护牲畜、人类和环境的健康。
在训练拟议的人工智能程序以识别寄生虫原生动物的 2D 图像之前，完成它所需的重要标准，例如大样本量、类别平衡、数据增强和专家的质量标记。作为关键步骤，专业人员可以解开训练阶段的错误信号，以重现暗网和Densenet算法的真值标签。所提出的人工智能程序的一个主要优点是它通过简单的拖放步骤对非编码用户友好使用。另一个重要功能是与分类模型集成的检测版本和注意力图的组合模块，这有助于尽快测试看不见的数据，而无需担心原始图像文件格式。这是因为可以使用更广泛的图像格式，包括 .jpeg、.jpg、.png、.tif、.tiff、.pdf 和 .bmp。将AI程序与显微镜的C接口组件一起应用，可以在偏远地区进行实时检测。
该方法的局限性可能会影响预训练阶段提出的方案。在开始训练 AI 模型之前，应该做好一些要求的准备，特别是数据集质量和专家标签。在数据集中，样本量小和类不平衡导致模型达到全局最小值，难以达到最优阶段。使用大样本量和平衡数据有助于在训练过程中以高精度和低损失优化模型。图像的变化，例如原生动物生命周期的发育阶段和 Giemsa 染色27,44、环境和图像尺度的变化颜色，希望在输入到两个深度学习模型的训练之前进行归一化。为了解决上述提出的问题，可以使用各种增强函数，例如旋转角度、亮度和对比度、垂直和水平翻转、高斯噪声和高斯模糊，来处理预训练阶段45。
所提出的混合AI模型的重要应用是将来自显微镜的原始数据、冻结图像和视频剪辑中实时识别寄生原生动物。它允许我们使用嵌入式边缘设备46、基于云的移动应用程序47、浏览器用户界面 （BUI）48 和基于 Web 的模型部署49 来部署经过训练的模型。因此，人工智能模型有可能将混合深度学习应用于主动监测，并及时提供结果，因为它能够在几毫秒内支持当地工作人员的决策，这表明辅助流行病学的自动筛查技术。
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Disclosures
所有作者均无财务披露，也无利益冲突。
Acknowledgments
这项工作（新学者研究资助，资助编号。RGNS 65 - 212）得到了高等教育、科学、研究和创新部常务秘书办公室（OPS MHESI）、泰国科学研究与创新部（TSRI）和King Mongkut's Institute of Technology Ladkrabang的财政支持。我们感谢泰国国家研究委员会（NRCT）[NRCT5-RSA63001-10]资助该研究项目。M.K.由泰国朱拉隆功大学科学研究与创新基金资助。我们还要感谢先进制造创新学院，King Mongkut's Institute of Technology，Ladkrabang，他们提供了深度学习平台和软件来支持该研究项目。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Darknet19, Darknet53 and Densenet201 | Gao Huang, Z. L., Laurens van der Maaten. Densely Connected Convolutional Networks. arXiv:1608.06993 [cs.CV]. (2016) | https://github.com/liuzhuang13/DenseNet | Deep convolutional neural network model that can function to classification Generic name: YOLO model/ detection model? |
| Olympus CX31 Model CX31RRBSFA | Olympus, Tokyo, Japan | SN 4G42178 | A light microscope |
| Olympus DP21-SAL U-TV0.5XC-3 | Olympus, Tokyo, Japan | SN 3D03838 | A digital camera Generic name: Classification models/ densely CNNs |
| Window 10 | Microsoft | Window 10 | Operation system in computers |
| YOLO v4-tiny | Naing, K. M. et al. Automatic recognition of parasitic products in stool examination using object detection approach. PeerJ Comput Sci. 8 e1065, (2022). | https://git.cira-lab.com/users/sign_in | Deep convolutional neural network model that can function to both localization and also classification |
| https://git.cira-lab.com/users/sign_in |
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