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Neuroscience

हार्मोनल, चयापचय और विद्युत विनियमन के अध्ययन के लिए लक्षित हाइपोथैलेमिक न्यूरॉन्स का अलगाव

Published: August 4, 2023 doi: 10.3791/65674
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Neuroscience and Cell Biology, Robert Wood Johnson Medical School, Rutgers University

Summary

यहां हम संस्कृति में विशिष्ट हाइपोथैलेमिक सेल उपप्रकारों को विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। अद्वितीय झिल्ली मार्करों के आधार पर कोशिकाओं का चयन किया जा सकता है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और जैव रासायनिक परख सहित कई अनुप्रयोगों में उपयोग किया जा सकता है।

Abstract

हाइपोथैलेमस भोजन के सेवन, शरीर के तापमान और हार्मोन रिलीज के रूप में विविध कार्यों को नियंत्रित करके मौलिक चयापचय प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है। चूंकि हाइपोथैलेमस के कार्यों को न्यूरोनल आबादी के विशिष्ट उपसमुच्चय द्वारा नियंत्रित किया जाता है, इसलिए उन्हें अलग करने की क्षमता चयापचय तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक प्रमुख उपकरण प्रदान करती है। इस संबंध में, हाइपोथैलेमस की न्यूरोनल जटिलता असाधारण चुनौतियां पैदा करती है।

इन कारणों से, चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) जैसी नई तकनीकों का पता लगाया गया है। यह पेपर प्रसवपूर्व चूहों के दिमाग से लक्षित न्यूरोनल आबादी को अलग करने के लिए माइक्रोबीड तकनीक का उपयोग करके चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) के एक नए अनुप्रयोग का वर्णन करता है। तकनीक सरल है और उच्च प्रजनन क्षमता के साथ एक अत्यधिक शुद्ध और व्यवहार्य प्राथमिक हाइपोथैलेमिक न्यूरॉन संस्कृति की गारंटी देती है। हाइपोथैलेमस को धीरे से अलग किया जाता है, न्यूरॉन्स को चुनिंदा रूप से अलग किया जाता है और ग्लियल कोशिकाओं से अलग किया जाता है, और अंत में, सेल सतह मार्कर के लिए एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके, रुचि की आबादी का चयन किया जाता है।

एक बार अलग होने के बाद, लक्षित न्यूरॉन्स का उपयोग उनकी रूपात्मक, विद्युत और अंतःस्रावी विशेषताओं और सामान्य या रोग स्थितियों में उनकी प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, भोजन, चयापचय, तनाव, नींद और प्रेरणा को विनियमित करने में हाइपोथैलेमस की विविध भूमिकाओं को देखते हुए, लक्षित और क्षेत्र-विशिष्ट न्यूरॉन्स पर करीब से नज़र डालने से इस जटिल वातावरण में उनके कार्यों में अंतर्दृष्टि मिल सकती है।

Introduction

हाइपोथैलेमस मस्तिष्क का एक बहुआयामी क्षेत्र है जो अंतःस्रावी, स्वायत्त, आंत और व्यवहार संबंधी कार्यों की मध्यस्थता करता है, जिसमें भोजन, चयापचय, नींद, शरीर का तापमान, सामाजिक व्यवहार और सेक्स ड्राइव 1,2,3,4,5 शामिल हैं। कार्यात्मक विषमता जैव रासायनिक और विद्युत तंत्र के एक सहक्रियात्मक संयोजन द्वारा प्राप्त की जाती है: हाइपोथैलेमिक न्यूरॉन्स फायर एक्शन पोटेंशिअल और मस्तिष्क क्षेत्रों और शरीर के अंगों को संशोधित करने के लिए हार्मोन और न्यूरोपैप्टाइड्स का स्राव और रिलीज करते हैं। अंत में, हाइपोथैलेमिक न्यूरॉन्स शरीर से होमियोस्टैटिक संदेशों का अनुवाद करते हैं, दीर्घकालिक और अल्पकालिक प्रतिक्रिया और फीडफॉरवर्ड नियमों6 के साथ प्रतिक्रिया करते हैं।

हाइपोथैलेमस के जटिल न्यूरोनल वातावरण में मैग्नोसेलुलर एंडोक्राइन न्यूरॉन्स शामिल हैं, जो ऑक्सीटोसिन और वैसोप्रेसिन जारी करते हैं; पार्वोसेलुलर न्यूरॉन्स, मुख्य रूप से प्रणालीगत हार्मोनल विनियमन में शामिल हैं, उदाहरण के लिए, थायरोट्रोपिन-रिलीज़ हार्मोन (टीआरएच), और कॉर्टिकोट्रोपिन-रिलीज़ हार्मोन (सीआरएच) पिट्यूटरी ग्रंथि को जारी करते हैं; बड़े पेप्टाइडर्जिक प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स, ओरेक्सिन और मेलेनिन-केंद्रित हार्मोन (एमसीएच) जारी करना; और आर्क्यूट न्यूक्लियस (एआरसी) के पार्वोसेलुलर पेप्टाइडर्जिक न्यूरॉन्स क्रमशः पीओएमसी (प्रोपियोमेलानोकोर्टिन) और एजीआरपी (एगोटी-संबंधित प्रोटीन) जारी करते हैं, जिन्हें क्रमशः एआरसीपीओएमसी और एआरसीएजीआरपी नाम दिया जाता है। स्रावी कोशिकाओं के साथ, डोपामिनर्जिक, ग्लूटामिनर्जिक और जीबीएर्जिक न्यूरॉन्स 7 सहित अन्य उत्तेजक और निरोधात्मक न्यूरॉन्स, इंट्राहाइपोथैलेमिक और एक्स्ट्राहाइपोथैलेमिक सर्किट बनाने में शामिल होते हैं, जिससे काफी सेलुलर विषमता के बड़े पैमाने पर समन्वित नेटवर्क बनतेहैं।

हाइपोथैलेमिक विविधता एक चुनौती रही है जिसे शोधकर्ता पिछले 50 वर्षों से दूर करने की कोशिश कर रहे हैं। विकासशील, परिपक्व और उम्र बढ़ने वाले हाइपोथालेमी में इस विषमता का अध्ययन करने के लिए, जांचकर्ता, एक तरफ, न्यूरोनल संगठन, साथ ही आणविक और ट्रांसक्रिप्टोमिक हस्ताक्षर का पता लगाने के लिए एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण को नियोजित कर रहे हैं। इस प्रयास ने हाइपोथैलेमिक न्यूरॉन्स की विविध भूमिकाओं में एक व्यावहारिक दृष्टि प्रदान की है और सेलुलर पहचान और शारीरिक प्रणाली 8,9,10 में इसकी संभावित भूमिका के बीच संबंधों को संबोधित किया है। दूसरी ओर, न्यूरोनल कार्यों की जांच ऑप्टोजेनेटिक जोड़तोड़ और फाइबर फोटोमेट्री व्यवहार दृष्टिकोण द्वारा की गई है, जो सर्किटरी संरचना पर करीब से नज़र डालती है। पिछले दो दशकों में, क्रे-रिकोम्बिनेस तकनीक ने शोधकर्ताओं को व्यवहार और शरीरकी प्रतिक्रियाओं में परिवर्तन को देखते हुए न्यूरॉन्स के लक्षित समूह को आनुवंशिक रूप से उत्तेजित या बाधित करने की अनुमति दी है।

हालांकि, ये दृष्टिकोण विशिष्ट सेलुलर तंत्र या जटिल हाइपोथैलेमिक वातावरण के भीतर उनकी भूमिका के लिए जैविक आधार में गहराई से गोता लगाए बिना एक सामान्य परिप्रेक्ष्य से हाइपोथैलेमिक कार्यों की जांच करते हैं। इसे संबोधित करने के लिए, बहुत कम अध्ययनों ने विषम प्राथमिक हाइपोथैलेमिक संस्कृतियों का उपयोग करके आणविक, जैव रासायनिक और विद्युत गुणों की जांच पर ध्यान केंद्रित किया है। इन अध्ययनों ने एक जटिल वातावरण में विशिष्ट न्यूरोनल प्रक्रियाओं को विच्छेदित करने की मांग की और शारीरिक तंत्र13,14,15 के एकीकृत मॉडल उत्पन्न किए। बहरहाल, गैर-विशिष्ट संस्कृतियां महत्वपूर्ण चुनौतियां पेश करती हैं। उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स की शारीरिक कनेक्टिविटी और शारीरिक वितरण विभिन्न हाइपोथैलेमिक क्षेत्रों से न्यूरॉन्स को चढ़ाकर बाधित होते हैं जो आम तौर पर बातचीत नहीं करते हैं, जिससे भ्रामक प्रभाव पैदा होते हैं। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक क्षेत्र में अलग-अलग भूमिकाएं और विविध न्यूरोनल आबादी होती है, जिससे सरल जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करना मुश्किल हो जाता है।

इन चुनौतियों का सामना करने के लिए, पिछले दशक में, इम्यूनोपैनिंग, फ्लोरोसेंट-एक्टिवेटेड-सेल-सॉर्टिंग (एफएसीएस), और मैग्नेटिक-एक्टिवेटेड-सेल-सॉर्टिंग (एमएसीएस) जैसे रुचि के न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए नए दृष्टिकोण लागू किए गए हैं। इम्यूनोपैनिंग गैर-न्यूरोनल (नकारात्मक) और न्यूरोनल (सकारात्मक) चयनों की एक श्रृंखला के लिए एंटीबॉडी-लेपित व्यंजनों का उपयोग करके लक्षित कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए नियोजित एक रणनीति है। जबकि यह तकनीक, सिद्धांत रूप में, उच्च उपज वाले शुद्ध सेल कल्चर उत्पन्न कर सकती है, व्यवहार में, ज्यादातर एस्ट्रोसाइट्स और ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के लिए उपयोग किया जाता है क्योंकि ये कोशिकाएंहेरफेर के घंटों का विरोध कर सकती हैं। एफएसीएस तकनीक फ्लो साइटोमेट्री 18,19,20 का उपयोग करके फ्लोरोसेंट मार्करों और सेलुलर विशेषताओं के आधार पर कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, बहुत कम अध्ययनों ने सेल कल्चर के लिए कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस विधि का उपयोग किया। तकनीक महंगी है और उपयोग और रखरखाव के लिए अत्यधिक कुशल कर्मियों की आवश्यकता होती है; इसके अतिरिक्त, छंटाई प्रक्रिया21 के अंत में व्यवहार्य और बाँझ कोशिकाओं को बनाए रखना चुनौतीपूर्ण है। कुल मिलाकर, एमएसीएस हाइपोथैलेमिक प्राथमिक न्यूरॉन्स की अत्यधिक शुद्ध और व्यवहार्य संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए एक सरल, गैर-महंगी तकनीक प्रतीत होती है। विधि एक एंटीबॉडी के माध्यम से कोशिकाओं से जुड़े चुंबकीय मोतियों का उपयोग करती है। यह स्तंभ के चुंबकीय क्षेत्र का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देता है।

यहां हम एमएसीएस तकनीक पर आधारित एक विधि का वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग आमतौर पर कॉर्टिकल न्यूरॉन्स के साथ किया जाता है। यह प्रोटोकॉल सिद्धांत रूप में, व्यवहार्य और अत्यधिक शुद्ध हाइपोथैलेमिक न्यूरॉन्स को अलग करने की अनुमति देता है। इस अध्ययन में, हम लेप्टिन रिसेप्टर (एलईपीआर) को व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स की प्राथमिक संस्कृतियों को तैयार करते हैं, जैसे कि एआरसीपीओएमसी और एआरसीएजीआरपी न्यूरॉन्स, जो केवल आर्क्यूट न्यूक्लियस में मौजूद हैं। ये न्यूरॉन्स जैव रासायनिक और विद्युत तरीकों से वसा ऊतक द्वारा स्रावित एक एनोरेक्सिक हार्मोन लेप्टिन का जवाब देते हैं। इसलिए, संस्कृति में न्यूरॉन्स के इस समूह का अलगाव विट्रो में उनके हार्मोनल, चयापचय और विद्युत गुणों के अध्ययन की अनुमति देता है।

Protocol

नोट: प्रयोगात्मक प्रक्रिया का एक सामान्य दृश्य चित्र 1 ए में ग्राफिक रूप से चित्रित किया गया है। इस अध्ययन में किए गए चूहों के साथ सभी प्रयोगों को हमारी संस्था की पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। हमने 3 महीने के सी 57बीएल 6 / जे चूहों का उपयोग किया, जिन्हें पशु चिकित्सक की देखभाल के तहत एसोसिएशन फॉर असेसमेंट एंड एक्रेडिटेशन ऑफ लेबोरेटरी एनिमल केयर इंटरनेशनल (एएएएलएसी) -अनुमोदित विवेरियम में रखा गया था। चूहे बड़े पिंजरों में रहते थे, जिसमें 12 घंटे का प्रकाश-अंधेरा चक्र होता था, और उन्हें एड लिबिटम खिलाया जाता था।

1. गर्भाधान और गर्भावस्था सत्यापन

  1. प्रजनन के लिए रुचि के किसी भी पृष्ठभूमि और जीनोटाइप के चूहों को रखें। गर्भाधान से पहले महिला की तारीख और वजन रिकॉर्ड करें।
  2. 6 घंटे के बाद, एक जांच के साथ एक पट्टिका के लिए महिला का निरीक्षण करें। यदि पट्टिका मौजूद है, तो मादा को पुरुष से अलग करें। यदि पट्टिका मौजूद नहीं है, तो मादा को अगले दिन तक पिंजरे में रखें, फिर चूहों को अलग करें।
  3. गर्भाधान के बाद 7, 10 और 14 दिनों में, गर्भावस्था की पुष्टि करने के लिए महिला का वजन करें।

2. मीडिया, 24-वेल प्लेट, और सामग्री की तैयारी

  1. सेल अलगाव के दिन, स्थान, उपयोग के लिए तैयार, पॉली-डी-लाइसिन-लेपित ग्लास कवरलिप्स (सामग्री की तालिका देखें) 24-वेल प्लेट में निम्नानुसार हैं:
    1. एक जैविक हुड के तहत, 70% इथेनॉल के साथ 15 कवरलिप्स युक्त एक एकल पैकेज को स्टरलाइज़ करें और सूखने दें। पैकेज खोलें और कवरलिप्स को 60 मिमी प्लेट में रखें। कवरलिप्स को अलग करने के लिए प्लेट को क्षैतिज रूप से हिलाएं। फिर, 24-वेल प्लेट के कुओं में रखने के लिए एकल कवरलिप्स लेने के लिए प्लेट को उल्टा करें।
  2. 5 मिनट के लिए बाँझ हैंक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के 1.0 मिलीलीटर के साथ कवरलिप्स को एक बार धोएं।
  3. इस बीच, 20.0 एमएल प्लेटिंग मीडिया निम्नानुसार तैयार करें: 18.31 एमएल बीएमई (बेसल मीडियम ईगल, + अर्ल के लवण) के साथ, 1.0 एमएल गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक, 200 μL सोडियम पाइरूवेट (100x स्टॉक से), 200 μL ग्लूटामाइन (200 एनएम स्टॉक से), और 100 μL पेनिसिलिन /
  4. कुओं में एचबीएसएस को 1.0 एमएल प्लेटिंग मीडिया के साथ बदलें और प्लेट को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  5. बन्सन बर्नर का उपयोग करके, व्यास को कम करने में तीन पाश्चर पिपेट को फायर-पॉलिश करें। एक हाथ से पाइप को पकड़कर, टिप को आंच में डालें और जल्दी से हटा दें। प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि नोक चिकनी न हो जाए और व्यास वांछित व्यास (आंख द्वारा मूल्यांकन) तक कम न हो जाए।

3. तंत्रिका पृथक्करण किट के निर्देशों का पालन करते हुए तंत्रिका ऊतक पृथक्करण के लिए अभिकर्मक तैयारी

  1. कमरे के तापमान पर पाचन बफर 1 को गर्म करने के बाद, एंजाइम 1 के 50 μL को 1.91 मिलीलीटर बफर 1 और एंजाइम मिक्स 2 के 15 μL को 30 μL पाचन बफर 2 के साथ मिलाकर एंजाइम मिक्स 1 तैयार करें। मिश्रण सभी भ्रूण के मस्तिष्क के ऊतकों के लिए उपयोग किए जाने के लिए पर्याप्त हैं।
  2. एचबीएसएस में 0.5% बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) तैयार करें, उदाहरण के लिए, एचबीएसएस के 50.0 एमएल में 0.25 ग्राम।

4. भ्रूण निष्कर्षण

  1. आटोक्लेव दो सीधे महीन बल, एक घुमावदार बिंदु बल, और एक जोड़ी ठीक सर्जिकल कैंची और उपयोग से पहले उन्हें 70% इथेनॉल के साथ निष्फल करें। फिर, एचबीएसएस के साथ पेट्री व्यंजन भरें।
  2. सीओ2 कक्ष में एक ई 14-ई 16 गर्भवती बांध को इच्छामृत्यु दें और ग्रीवा अव्यवस्था करें।
    नोट: बाँझ परिस्थितियों में हुड के नीचे निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन किया जाना चाहिए:
  3. 70% इथेनॉल के साथ पेट को स्टरलाइज़ करें। सर्जिकल कैंची और बल के साथ प्यूबिक सिम्फिसिस से पेट की गुहा को पसली पिंजरे की ज़िफॉइड प्रक्रिया तक खोलें।
  4. गर्भाशय के सींग को निकालें और इसे बर्फ-ठंडे एचबीएसएस से भरी 100 मिमी प्लेट में रखें और अच्छी तरह से धो लें।
  5. गर्भाशय से सभी भ्रूणों को बारीक बल के साथ निकालें और अलग करें। भ्रूण को जल्दी से ठीक सर्जिकल कैंची और / या बल के साथ हटा दें। सिर को एचबीएसएस से भरे 60 मिमी पेट्री डिश में रखें।

5. हाइपोथैलेमस निष्कर्षण, संग्रह और ऊतक पृथक्करण

  1. मस्तिष्क को पकड़ने के लिए आंख गुहा में एक महीन बल रखें। अन्य बारीक बल का उपयोग करके, त्वचा और खोपड़ी को छीलकर हटा दें जब तक कि मस्तिष्क दिखाई न दे। मस्तिष्क को उसकी सफेद उपस्थिति के आधार पर अन्य ऊतकों से अलग करें। त्वचा और खोपड़ी गुलाबी और वाहिका में समृद्ध हैं।
  2. घुमावदार बिंदु बल का उपयोग करके खोपड़ी से मस्तिष्क को निकालें और घ्राण बल्बों से मस्तिष्क को बाहर निकालें, इसे उल्टा घुमाएं।
  3. अब कॉर्टेक्स उदर है, और हाइपोथैलेमस बेहतर सतह पर पृष्ठीय रूप से दिखाई देता है (चित्रा 1 बी)। घुमावदार बल के साथ, मेनिंगेस और रक्त वाहिकाओं की परत को हटा दें जब तक कि मस्तिष्क सफेद और स्पष्ट न दिखाई दे।
  4. घुमावदार बल के साथ, हाइपोथैलेमिक क्षेत्र को मस्तिष्क के बाकी हिस्सों से अलग करें।
  5. हाइपोथैलेमस को 3-4 छोटे टुकड़ों में काटें और एक पाइप के साथ, टुकड़ों को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. अन्य भ्रूणों के लिए चरणों को दोहराएं जबकि ट्यूब बर्फ पर है।
  7. ट्यूब को 6.0 एमएल एचबीएसएस से भरें और ऊतक को व्यवस्थित होने दें, सतह पर तैरने वाला को हटा दें, और एंजाइम मिक्स 1 जोड़ें। ऊतक को रोकने के लिए ट्यूब को धीरे से मिलाएं और उत्तेजित करें।
  8. ट्यूब को 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें और ऊतक को फिर से निलंबित करने के लिए हर 5 मिनट में ऊतक को उत्तेजित करें।
  9. 15 मिनट के बाद, एंजाइम मिश्रण 2 के 30 μL जोड़ें। सबसे बड़े व्यास (<1 मिमी) के साथ पिपेट पाश्चर का उपयोग करके मस्तिष्क के ऊतकों को अलग करें। बुलबुले बनाने के बिना 10 x ऊपर और नीचे पाइप करें।
  10. पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। हर 5 मिनट में ऊतक को फिर से निलंबित करने के लिए ट्यूब को धीरे से हिलाएं।
  11. 10 मिनट के बाद, शेष 15 μL एंजाइम मिश्रण 2 जोड़ें। ऊतक को 10x को घटते व्यास के अन्य दो अग्नि-पॉलिश किए गए पिपेट के साथ अलग करें, बुलबुले बनाने के बिना ऊपर और नीचे।
  12. अलग ऊतक के साथ ट्यूब में, तुरंत 10.0 एमएल एचबीएसएस -0.5% बीएसए और सेंट्रीफ्यूज को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर जोड़ें।
  13. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और एचबीएस -0.5% बीएसए के 1.0 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।

6. सेल गिनती

  1. एचबीएसएस-0.5% बीएसए का उपयोग करके सेल निलंबन 1: 5 को पतला करें।
  2. न्यूबॉयर काउंटिंग चैंबर में पतला सेल सस्पेंशन के 10 μL रखें।
  3. एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के तहत, केवल उन कोशिकाओं की गणना करें जो चार कक्ष के कोने वर्गों में हैं। औसत की गणना करें और 5 × 104 से गुणा करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि सेल अलगाव के लिए आगे बढ़ने के लिए >10 6 कोशिकाएं हैं; इष्टतम सेल संख्या 107 है।

7. नकारात्मक चयन

नोट: नकारात्मक चयन उपयोगकर्ताओं को न्यूरोनल और गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं को अलग करके एक शुद्ध प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति प्राप्त करने में सक्षम बनाता है। प्रीकूल्ड समाधानों का उपयोग करें।

  1. सेल निलंबन को 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें (सेंट्रीफ्यूजेशन को 10 मिनट तक बढ़ाया जा सकता है)। धीरे से सतह पर तैरने वाले को अलग करें और गोली को एचबीएसएस -0.5% बीएसए के 80 μL में 107 कोशिकाओं की एकाग्रता तक पुन: निलंबित करें।
  2. गैर-न्यूरोनल सेल बायोटिन-एंटीबॉडी कॉकटेल के 20 μL जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. 2.0 एमएल एचबीएसएस-0.5% बीएसए के साथ मुक्त एंटीबॉडी को हटाने के लिए कोशिकाओं को धोएं और 3मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. धीरे से सतह पर तैरने वाले को अलग करें और एचबीएसएस -0.5% बीएसए के 80 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। एंटी-बायोटिन माइक्रोबीड्स के 20 μL जोड़ें, अच्छी तरह मिलाएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. 107 कोशिकाओं के लिए एचबीएसएस -0.5% बीएसए के 0.5 एमएल जोड़ें और चुंबकीय स्तंभ तैयार होने तक प्रतीक्षा करें।

8. चुंबकीय पृथक्करण, नकारात्मक चयन

नोट: चुंबकीय पृथक्करण एक महत्वपूर्ण कदम है जो न्यूरोनल कोशिकाओं से गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देता है। न्यूरोनल और गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं वाले नमूने को चुंबकीय क्षेत्र के माध्यम से पारित किया जाता है और गैर-न्यूरोनल कोशिकाएं, जो बायोटिन-एंटीबॉडी-चुंबकीय मोती कॉम्प्लेक्स से बंधी होती हैं, कॉलम (चित्रा 1 सी) में फंस जाती हैं। मुक्त न्यूरोनल कोशिकाओं को कॉलम के माध्यम से संश्लेषित किया जाता है और 15 एमएल ट्यूब में एकत्र किया जाता है।

  1. विभाजक और एमएस कॉलम के साथ स्टैंड (किट में शामिल) तैयार करें जैसा कि चित्रा 1 सी में दिखाया गया है।
  2. स्तंभ खोलें और स्टैंड को केवल तभी सेट करें जब कोशिकाएं अलग होने के लिए तैयार हों।
  3. एचबीएसएस -0.5% बीएसए के 0.5 एमएल के साथ कॉलम को धोएं। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि घोल टपकना बंद न हो जाए।
  4. न्यूरोनल कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए, कॉलम के नीचे एक 15 एमएल ट्यूब रखें और कॉलम के माध्यम से सेल निलंबन के 0.5 एमएल को पास करें। ट्यूब में एलुएट को इकट्ठा करें जब तक कि यह टपकना बंद न हो जाए। अवशिष्ट न्यूरोनल कोशिकाओं को पकड़ने के लिए, HBSS-0.5% BSA के कॉलम 3 x 0.5 mL को धोएं।
  5. गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए, चुंबक से कॉलम को हटा दें और इसे एक नई 15 मिलीलीटर ट्यूब के अंदर रखें। कॉलम में एचबीएसएस के 1.0 एमएल - 0.5% बीएसए जोड़ें और चुंबकीय रूप से लेबल किए गए गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए प्लंजर का उपयोग करें।
  6. 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर न्यूरोनल और गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। धीरे से सतह पर तैरनेवाला को अलग करें और एचबीएसएस -0.5% बीएसए के 1.0 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। अनुभाग 6 में पहले वर्णित कक्षों की गणना करें।
  7. यदि आवश्यक हो, तो गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं को 24-वेल प्लेट में प्लेट करें; अन्यथा उन्हें छोड़ दें।

9. सकारात्मक चयन

नोट: एक बार एक शुद्ध न्यूरोनल सेल निलंबन प्राप्त होने के बाद, लक्षित कोशिकाओं को अलग करने के लिए सकारात्मक चयन किया जाता है। सतह एंटीजन के लिए एक विशिष्ट बायोटिन-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग किया जा सकता है। एंटीबॉडी को एंटी-बायोटिन चुंबकीय मोतियों द्वारा पहचाना जाता है। स्तंभ के माध्यम से सेल निलंबन को प्रवाहित करने से, केवल रुचि की कोशिकाएं चुंबकीय क्षेत्र में फंस जाती हैं।

  1. 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर शुद्ध न्यूरोनल सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। धीरे से सतह पर तैरने वाले को अलग करें और एचबीएसएस -0.5% बीएसए के 80 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए विशिष्ट एंटीबॉडी जोड़ें और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: यदि एलईपीआर को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की मांग की जाती है, तो हम 0.50 μg / 106 कोशिकाओं की एकाग्रता पर माउस लेप्टिन आर बायोटिनीलेटेड एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका देखें) का सुझाव देते हैं।
  2. अतिरिक्त एंटीबॉडी को एचबीएसएस-0.5% बीएसए के 2.0 एमएल और सेंट्रीफ्यूज को 3मिनट के लिए 300 × ग्राम पर धो लें।
  3. सतह पर तैरने वाले को हटा दें, एचबीएसएस -0.5% बीएसए के 80 μL में गोली को फिर से निलंबित करें, और एंटी-बायोटिन माइक्रोबीड्स के 20 μL जोड़ें। 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. प्रत्येक 107 कोशिकाओं के लिए, एचबीएसएस -0.5% बीएसए के 0.5 एमएल जोड़ें और चुंबकीय स्तंभ तैयार होने तक प्रतीक्षा करें।

10. चुंबकीय पृथक्करण, सकारात्मक चयन

  1. विभाजक और एमएस कॉलम के साथ स्टैंड तैयार करें। एमएस कॉलम को एचबीएसएस-0.5% बीएसए के 0.5 एमएल के साथ कुल्ला करें। टपकना बंद होने तक प्रतीक्षा करें।
  2. कॉलम के नीचे एक 15 एमएल ट्यूब रखें, कॉलम के माध्यम से सेल सस्पेंशन के 0.5 एमएल पास करें, और गैर-विशिष्ट न्यूरोनल कोशिकाओं से युक्त एलुएट एकत्र करें। अवशिष्ट गैर-विशिष्ट न्यूरोनल कोशिकाओं के स्तंभ को साफ करने के लिए, एचबीएसएस-0.5% बीएसए के 3 x 0.5 एमएल से धोएं।
  3. चुंबक से कॉलम निकालें, इसे एक नई 15 एमएल ट्यूब में रखें, और एचबीएसएस -0.5% बीएसए के 1.0 एमएल जोड़ें। लक्षित कोशिकाओं को बाहर निकालने के लिए प्लंजर का उपयोग करें।
  4. 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर दोनों ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। धीरे से सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और इसे 0.5 एमएल प्लेटिंग माध्यम में फिर से निलंबित करें।
  5. अनुभाग 6 में पहले वर्णित कक्षों की गणना करें।
  6. प्लेट दोनों ने सकारात्मक नियंत्रण के रूप में लक्षित कोशिकाओं और गैर-विशिष्ट कोशिकाओं को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 24-वेल प्लेट में 120,000-200,000 कोशिकाओं / मिमी3 घनत्व के रूप में पहले से तैयार किया था जैसा कि खंड 2 में वर्णित है और 12 घंटे के लिए 5% सीओ 2, 9% ओ2 और 95% आर्द्रता में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

11. सेल संस्कृति रखरखाव

  1. 19.2 एमएल न्यूरोनल कल्चर मीडियम, 400 μL B27 पूरक (50x स्टॉक से), 200 μL ग्लूटामाइन (200 μM स्टॉक से), और 100 μL पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (200x स्टॉक से) के साथ 20 मिलीलीटर कल्चर माध्यम तैयार करें।
  2. न्यूरोनल या गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं वाले 24 वेल-प्लेट से प्लेटिंग मीडिया को बदलें।
  3. HBSS के 2 x 1.0 मिलीलीटर के साथ धो लें।
  4. संस्कृति मीडिया के 1.0 एमएल जोड़ें।
  5. 0.5 एमएल पुराने मीडिया को 0.5 एमएल ताजा मीडिया के साथ बदलकर हर 2/3 दिनों में मीडिया को ताज़ा करें।
    नोट: कोशिकाओं को संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है और विट्रो ( DIV21) में 21 दिनों तक उपयोग किया जा सकता है।

12. न्यूरॉन इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. धुंधला होने से बारह घंटे पहले, 50/50 मेथनॉल और एसीटोन से युक्त एक घोल तैयार करें और इसे रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करें।
  2. 24-वेल प्लेट में न्यूरॉन्स को 5 मिनट के लिए 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 2 x 1.0 मिलीलीटर के साथ धोएं।
  3. पीबीएस घोल को 50/50 समाधान के 1.0 एमएल के साथ बदलें और 20 मिनट के लिए बर्फ में इनक्यूबेट करें।
  4. 3 x 5 मिनट के लिए 1x PBS के साथ धो लें।
  5. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 1x PBS में 3% बीएसए के साथ न्यूरॉन्स को अवरुद्ध करें।
  6. निर्माता के निर्देशों में उल्लिखित एंटीबॉडी एकाग्रता का उपयोग करके, 1x पीबीएस में 3% बीएसए में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। उपयोग किए गए एंटीबॉडी और सांद्रता सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं।
  7. ब्लॉकिंग समाधान को प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ बदलें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  8. 1x PBS के साथ 3 x 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को धो लें।
  9. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एंटीबॉडी की सांद्रता का उपयोग करते हुए, 1x पीबीएस में 3% बीएसए के साथ द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। उपयोग किए गए द्वितीयक एंटीबॉडी सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं।
  10. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  11. 1x PBS के साथ 3 x 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को धो लें।
  12. माउंटिंग प्रक्रिया के दौरान न्यूरॉन्स को 1x पीबीएस में छोड़ दें। माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंटिंग माध्यम (परमाणु पहचान के लिए 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिडोल के साथ या बिना) की एक छोटी बूंद रखें। एक ग्लास कवरस्लिप निकालें जिसमें न्यूरॉन्स शामिल हों और अतिरिक्त पीबीएस को सुखाने के लिए पेपर ऊतक पर कवरस्लिप के किनारे टैप करें। बढ़ते माध्यम पर कवरस्लिप को फ्लिप करें, यह सुनिश्चित करें कि न्यूरॉन्स माइक्रोस्कोप स्लाइड का सामना कर रहे हैं; टिशू पेपर के साथ अतिरिक्त माउंटिंग मीडिया को धीरे से दबाएं और हटा दें।
  13. माइक्रोस्कोप स्लाइड एक उज्ज्वल क्षेत्र या एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ विश्लेषण करने के लिए तैयार हैं।

Representative Results

यह पेपर हाइपोथैलेमस के लक्षित न्यूरॉन्स के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है (चित्रा 1)। विधि का दायरा एक नियंत्रित और पृथक संदर्भ में विशिष्ट न्यूरोनल विशेषताओं का अध्ययन करना है। इस प्रकार, ई 14-ई 16 पर गर्भवती बांधों से माउस भ्रूण निकाले गए थे। मेनिंगेस को हटा दिया गया था, और हाइपोथैलेमस को मस्तिष्क के बाकी हिस्सों से अलग कर दिया गया था। ऊतक को संदर्भित पृथक्करण किट का उपयोग करके ताजा तैयार किए गए एंजाइमों के दो मिश्रणों के साथ धीरे से अलग किया गया था। सबसे पहले, गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं को न्यूरोनल कोशिकाओं-ग्लिया, माइक्रोग्लिया से अलग किया गया था, और न्यूरॉन्स को एक ही एकल-कोशिका निलंबन में एकत्र किया गया था। इसके लिए, गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं को गैर-न्यूरोनल सतह एपिटोप्स को पहचानने वाले एंटीबॉडी के कॉकटेल का उपयोग करके लेबल किया गया था। इनक्यूबेशन के बाद, एंटीबॉडी-सेल कॉम्प्लेक्स को चुंबकीय माइक्रोबीड्स के साथ संयुग्मित किया गया था और बाद में गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं को फंसाने के लिए एक चुंबकीय स्तंभ से गुजरना पड़ा।

इस चरण से दो सेल निलंबन प्राप्त हुए, एक में गैर-न्यूरोनल और दूसरे में न्यूरोनल कोशिकाएं थीं। दोनों निलंबन तुरंत लगाए जा सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, न्यूरोनल सेल निलंबन को एक ही रणनीति का उपयोग करके एक न्यूरोनल उप-जनसंख्या (लक्षित निलंबन) को बाकी हिस्सों से अलग करने के लिए आगे हेरफेर किया जा सकता है। रुचि के प्रयोग के आधार पर, न्यूरोनल कोशिकाओं को 125,000 से 200,000 कोशिकाओं / मिमी 3 से चढ़ाया जा सकताहै। कम-घने संस्कृतियों का उपयोग एकल-कोशिका संकल्प पर न्यूरॉन्स का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है: अक्षीय विकास, सिनैप्टिक गठन और संचरण से इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तक। सघन संस्कृतियों का उपयोग जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, जिसमें डीएनए और आरएनए निष्कर्षण, पश्चिमी धब्बा, दक्षिणी धब्बा, उत्तरी धब्बा, वास्तविक समय पीसीआर और आरएनए अनुक्रमण शामिल हैं।

इस अध्ययन में, एलईपीआर को मेलानोकोर्टिन प्रणाली में शामिल न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए लक्षित किया गया था, जैसे कि एआरसीपीओएमसी और एआरसीएजीआरपी न्यूरॉन्स। कोशिकाओं को एलईपीआर + न्यूरॉन्स के लिए 120,000 कोशिकाओं / मिमी 3 से लेकर जेनेरिक न्यूरोनल आबादी के लिए 200,000 कोशिकाओं / मिमी3 तक घनत्व पर चढ़ाया गया था। 48 घंटे के बाद, एलईपीआर + न्यूरॉन्स ने न्यूरॉइट्स बनाना शुरू कर दिया (चित्रा 2)। DIV4 में, अक्षीय विस्तार ने प्रगति दिखाई, जबकि डेंड्राइटिक प्रक्रियाएं दिखाई देने लगीं। DIV6 में, न्यूरॉन्स पर्याप्त रूप से विकसित हुए थे और इसलिए विश्लेषण करने के लिए तैयार थे। एलईपीआर + न्यूरॉन्स पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों ने एलईपीआर (हरा, चित्रा 3 ए) की 99% अभिव्यक्ति दिखाई। प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृति की शुद्धता की पुष्टि करते हुए कोई ग्लियल कोशिकाएं या अन्य गैर-न्यूरोनल कोशिकाएं नहीं देखी गईं। कोशिकाओं की न्यूरोनल प्रकृति की पुष्टि सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन 2 (एमएपी 2) धुंधला होने से की गई थी, जिसमें अक्षतंतु और डेंड्राइटिक प्रोट्रूशियंस (चित्रा 3 बी) की पहचान की गई थी। DIV10 में, 30% LEPR + कोशिकाओं ने POMC (लाल) व्यक्त किया। यह अपेक्षित है क्योंकि अधिकांश एलईपीआर + कोशिकाएं पीओएमसी या एजीआरपी व्यक्त करती हैं। चित्रा 3 सी, डी पीओएमसी और एलईपीआर संकेतों के बीच सह-स्थानीयकरण को दर्शाता है। ध्यान दें कि सह-स्थानीयकरण नाभिक पर और उसके आसपास प्रमुख था, जैसा कि अपेक्षित था।

विषम हाइपोथैलेमिक न्यूरोनल आबादी वाले सामान्य संस्कृतियों का उपयोग नियंत्रण के लिए किया गया था। इम्यूनोफ्लोरेसेंस ने सिनैप्टिक कनेक्टिविटी और कार्यक्षमता का प्रदर्शन किया, जैसा कि सिनैप्सिन -1 (हरा) और पीएसडी 95 (लाल) सह-धुंधला (चित्रा 4 ए, बी) द्वारा मूल्यांकन किया गया है। सामान्य संस्कृति में मौजूद एलईपीआर + न्यूरॉन्स की संख्या ~ 5% थी, जो इस धारणा के अनुरूप थी कि चुंबकीय पृथक्करण प्रक्रिया के दौरान एलईपीआर-व्यक्त न्यूरॉन्स के बहुमत का चयन किया गया था (प्रतिनिधि एलईपीआर + कोशिकाओं को चित्रा 4 सी, डी में चित्रित किया गया है)। इस अध्ययन के दौरान उत्पन्न या विश्लेषण किए गए सभी डेटा https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c पर उपलब्ध हैं।

Figure 1
चित्र 1: प्रायोगिक प्रवाह चार्ट और सेटअप । (ए) प्रयोगात्मक प्रक्रिया का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व। गो-नो-गो: सेल अलगाव के लिए आगे बढ़ने के लिए ≥106 कोशिकाएं आवश्यक हैं; इष्टतम सेल संख्या 107 है। (बी) ई 16 भ्रूण मस्तिष्क की प्रतिनिधि छवि। हाइपोथैलेमस और मेनिंगेस का संकेत दिया जाता है। (सी) एमएसीएस सेटअप लक्षित कोशिकाओं के पृथक्करण और अलगाव के लिए उपयोग किया जाता है। चुंबकीय स्टैंड, चुंबकीय विभाजक और स्तंभ इंगित किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: DIV2 और DIV6 के बीच न्यूरोनल संस्कृति । (ए) सकारात्मक चयन से प्राप्त एलईपीआर + कोशिकाएं कम सेल घनत्व और कनेक्टिविटी दिखाती हैं, लेकिन न्यूरॉइट्स (लाल तीर), अक्षतंतु (नीले तीर), और डेंड्राइट (हरे तीर) का सामान्य विकास। कोशिकाओं को 120,000 कोशिकाओं / मिमी3 के घनत्व पर चढ़ाया गया था। स्केल बार = 100 μm। (बी) जेनेरिक हाइपोथैलेमिक न्यूरॉन्स, 200,000 कोशिकाओं / मिमी3 के घनत्व पर चढ़ाया जाता है, सामान्य विकास और विकास विशेषताओं और कनेक्टिविटी (काले तीर) को प्रदर्शित करता है। स्केल बार = 100 μm। संक्षेप: डीआईवी = विट्रो में दिन; एलईपीआर = लेप्टिन रिसेप्टर। इस आंकड़े को बनाने के लिए उत्पन्न या विश्लेषण किए गए सभी डेटा https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c पर उपलब्ध हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: विवो न्यूरॉन्स में सुसंस्कृत एलईपीआर + न्यूरॉन्स द्वारा पुन: उत्पन्न किया जाता है। (ए) एलईपीआर (हरा) व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स की संस्कृति की प्रतिनिधि छवियां; DAPI नीला है)। नब्बे प्रतिशत कोशिकाओं ने एलईपीआर को व्यक्त किया। न्यूरॉन्स को 120,000 कोशिकाओं / मिमी3 घनत्व पर चढ़ाया गया था। डीआईवी 7 में, न्यूरॉन्स ने लम्बी अक्षतंतु, डेंड्राइटिक परिपक्वता और न्यूरोनल कनेक्टिविटी (तीर) प्रस्तुत किए। स्केल बार = 40 μm। (बी) कोशिकाओं की न्यूरोनल प्रकृति की पुष्टि करने के लिए एंटी-एमएपी 2 के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग किया गया था। न्यूरोनल-विशिष्ट आकृति विज्ञान जैसे अक्षतंतु, डेंड्राइट और प्रोट्रूशियंस का प्रदर्शन किया जाता है (तीर)। स्केल बार = 40 μm। (सी) एलईपीआर + कोशिकाओं का आवर्धन। हरे रंग में एलईपीआर और नीले रंग में डीएपीआई। स्केल बार = 10 μm। (डी) एलईपीआर (हरा) और पीओएमसी (लाल) के साथ सह-धुंधलापन। लगभग 30% एलईपीआर + न्यूरॉन्स पीओएमसी के लिए सह-इम्यूनोरिएक्टिव थे, जो नाभिक (लाल तीर) के स्तर पर पाया गया था। स्केल बार = 10 μm। संक्षेप: DAPI = 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिडोल; एमएपी 2 = सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन 2; पीओएमसी = प्रोओपियोमेलानोकोर्टिन; एलईपीआर = लेप्टिन रिसेप्टर। इस आंकड़े को बनाने के लिए उत्पन्न या विश्लेषण किए गए सभी डेटा https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c पर उपलब्ध हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: विवो कोशिकाओं में सुसंस्कृत जेनेरिक हाइपोथैलेमिक न्यूरॉन्स द्वारा पुन: उत्पन्न किया जाता है। (ए) सिनैप्सिन 1 (हरा), पीएसडी 95 (लाल), और डीएपीआई (नीला) के साथ सना हुआ जेनेरिक हाइपोथैलेमिक न्यूरोनल संस्कृति की प्रतिनिधि छवियां। न्यूरॉन्स ने अच्छी तरह से विकसित कनेक्टिविटी और सिनैप्टिक कार्यक्षमता (तीर) का प्रदर्शन किया। स्केल बार = 40 μm। (बी) (ए) में बॉक्स का आवर्धन, सिनैप्सिन 1 (हरा) और पीएसडी 95 (लाल, तीर) के सह-स्थानीयकरण को दर्शाता है। स्केल बार = 20 μm। (C, D) एक सामान्य संस्कृति में एलईपीआर + कोशिकाओं को दिखाने वाली प्रतिनिधि छवियां। एलईपीआर + कोशिकाएं (हरा) कुल का ~ 5% के लिए जिम्मेदार है। प्रतिनिधि एलईपीआर + कोशिकाओं को तीर द्वारा इंगित किया जाता है। स्केल बार = 40 μm। (E, F) (सी, डी) में बक्से के आवर्धन जो सोमा में स्थानीयकृत हरे पंक्टा लेप्टिन रिसेप्टर्स दिखाते हैं। स्केल बार = 20 μm। इस आंकड़े को बनाने के लिए उत्पन्न या विश्लेषण किए गए सभी डेटा https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c पर उपलब्ध हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

हाइपोथैलेमिक न्यूरॉन्स के जैव रासायनिक और विद्युत गुणों की जांच चयापचय, थर्मोरेग्यूलेशन, मूड प्रबंधन, भोजन व्यवहार और अधिक के आणविक आधार को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, हाइपोथैलेमस की न्यूरोनल विषमता इस प्रयास को चुनौतीपूर्ण बनाती है, और विशिष्ट हाइपोथैलेमिक उप-आबादी को अलग करने और अध्ययन करने के तरीकों की आवश्यकता होती है।

विवो तकनीकों में सीआरई-रिकॉम्बिनेस, ऑप्टोजेनेटिक, फाइबर फोटोमेट्री और कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग किया जाता है। ये दृष्टिकोण मुख्य रूप से हाइपोथैलेमिक न्यूरॉन्स के विद्युत गुणों के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं, और वर्तमान में उनकी गैर-विद्युत विशेषताओं की जांच के लिए बहुत कम तरीके उपलब्ध हैं। इस अध्ययन में विकसित एमएसीएस तकनीक विट्रो में विशिष्ट हाइपोथैलेमिक न्यूरोनल उप-आबादी को अलग करने के लिए एक तकनीक प्रदान कर सकती है, जिससे लक्षित उपचार और विश्लेषण हो सकते हैं। विभिन्न न्यूरोनल आबादी की सह-संस्कृतियों की तुलना में न्यूरोनल संस्कृतियों का प्रबंधन करना आसान है। इसके अतिरिक्त, शुद्ध संस्कृतियां ग्लिया और माइक्रोग्लिया की उपस्थिति से उत्पन्न होने वाले भ्रामक प्रभावों से बचती हैं। इस प्रकार, एक ही हाइपोथैलेमिक क्षेत्र और प्रकार के न्यूरॉन्स का अध्ययन विशिष्ट चयापचय और हार्मोनल इनपुट के जवाब में किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में, हमने एलईपीआर को व्यक्त करने वाले हाइपोथैलेमिक न्यूरॉन्स का चयन किया। पृथक एलईपीआर + कोशिकाओं को उनकी सेलुलर, रूपात्मक और आणविक विशेषताओं की जांच करने के लिए सुसंस्कृत किया गया था जो विवो में अध्ययन करना मुश्किल है।संस्कृतियों की शुद्धता 99% थी, जो विधि की सटीकता का समर्थन करती थी। इसके अलावा, LEPR + कोशिकाएं DIV21 तक DIV7 पर स्वस्थ और व्यवहार्य थीं।

हालांकि, इस तकनीक की कुछ सीमाएं हैं। ई 18 या पुराने शुद्ध न्यूरॉन संस्कृतियों को बनाए रखना चुनौतीपूर्ण है। इसलिए, निष्कर्षण की खिड़की E14-E16 तक सीमित है। इसका मतलब है कि ई 16 के बाद होने वाले सेलुलर परिवर्तन छूट जाते हैं। उदाहरण के लिए, एआरसी न्यूरॉन्स में लेप्टिन रिसेप्टर की अभिव्यक्ति प्रारंभिक प्रसवोत्तर अवधि22 के दौरान बढ़ जाती है। सेलुलर तनाव और मृत्यु को कम करने और उपज में सुधार करने के लिए अलगाव की प्रक्रिया जितनी जल्दी हो सके की जानी चाहिए। प्रक्रिया में 5 घंटे तक का समय लग सकता है; इसलिए, बाँझ स्थितियों को बनाए रखना और न्यूनतम आवश्यक हेरफेर को कम करना आवश्यक है। सकारात्मक चयन उपलब्ध ऊतक की कम मात्रा के कारण कम उपज का कारण बन सकता है, जो प्रयोगों की संख्या को सीमित करता है जो एक ही तैयारी के साथ किया जा सकता है। ऊंचा न्यूरोनल मृत्यु देखी गई, शायद कम सेल घनत्व और कम न्यूरोनल कनेक्टिविटी और इंट्रान्यूरोनल समर्थन के कारण।

इसके अलावा, रुचि के एंटीजन को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी को सही पृथक्करण की गारंटी देने के लिए सेल की सतह से बांधना चाहिए; आमतौर पर, फ्लो साइटोमेट्री के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी एमएसीएस तकनीक के लिए उपयुक्त होते हैं। यदि सेल पृथक्करण विधियों में एंटीबॉडी का उपयोग पहले नहीं किया गया है, तो आदर्श उपयोग और एकाग्रता निर्धारित करने के लिए सत्यापन और अनुमापन प्रयोगों की आवश्यकता होती है। लक्षित कोशिकाओं के निष्कर्षण के लिए एक सेल सतह मार्कर की आवश्यकता होती है। यहां हमने एक बायोटिनीलेटेड एंटीबॉडी का उपयोग किया, लेकिन सिद्धांत रूप में, अन्य अणुओं के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी, जैसे एफआईटीसी (फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट) और पीई (शुद्ध एंटी-फाइकोएरिथ्रिन) का भी उपयोग किया जा सकता है। एमएसीएस तकनीक को फ्लोरोफोरे व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स पर भी लागू किया जा सकता है, जैसे कि जीएफपी या अन्य टैग प्रोटीन, संभावित रूप से विशिष्टता और उपज में वृद्धि। यदि एक फ्लोरोफोरे नियोजित नहीं है, तो विकल्प लाइव सेल प्रयोगों को करने से पहले इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा रुचि के अणु की अभिव्यक्ति की पुष्टि करना होगा। भविष्य के अध्ययन इन विकल्पों की वैधता का परीक्षण करेंगे।

एक महत्वपूर्ण पहलू जो इस अध्ययन ने उप-न्यूरोनल आबादी की "निष्ठा" को संबोधित नहीं किया। हमने पता लगाया कि सुसंस्कृत एलईपीआर + न्यूरॉन्स ने पीओएमसी व्यक्त किया, जो देशी एआरसीपीओएमसी न्यूरॉन्स का हस्ताक्षर है। हालांकि, यह निष्कर्ष निकालने के लिए अधिक परीक्षण आवश्यक होंगे कि एलईपीआर + न्यूरोनल संस्कृतियां विवो समकक्षों में अपने मूल को पुन: उत्पन्न करती हैं। कुल मिलाकर, यहां प्रस्तुत एमएसीएस न्यूरोनल अलगाव प्रोटोकॉल इन विट्रो हाइपोथैलेमिक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक वैध और प्रभावी तरीका प्रदान कर सकता है जो अन्यथा विवो में जांच करना मुश्किल होगा।

Disclosures

लेखक ों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

BioRender.com के साथ ग्राफिकल आंकड़े बनाए गए थे। इस काम को एफएस को एनआईए अनुदान (R01AG060919) और एनएसएफ अनुदान (2030348) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Embryo extraction
1 curved point forceps Fine Science Tools 11270-20 Dumont
1 fine surgical scissor Fine Science Tools 14058-11 Dumont
100 mm Petri dish Corning 430167
2 straight fine forceps Fine Science Tools 11254-20 Dumont
60 mm Petri dish Corning 430196
70% ethanol Decon Laboratories, INC. 2801 Ethanol 190 Proof
Anti-Biotin MicroBeads 1mL Miltenyi Biotec 130-115-390
Anti-MAP2 antibody Abcam ab5392 1 : 800
Bench pads
Bovine Serum Albumin  Sigma-Aldrich A9418-50G
Buffer Y Miltenyi Biotec 130-094-802
Buffer Z Miltenyi Biotec 130-094-802
Cell Culture
Anti-Biotin MicroBeads 1mL Miltenyi Biotec 130-115-390
Bovine Serum Albumin  Sigma-Aldrich A9418-50G
Buffer Y Miltenyi Biotec 130-094-802
Buffer Z Miltenyi Biotec 130-094-802
Enzyme A Miltenyi Biotec 130-094-802
Enzyme P Miltenyi Biotec 130-094-802
GG-12-1.5, 12 mm dia.#1.5 thick 100 pc cell culture tested German coverglasses Neuvitro Corporation GG-12-15
Gibco B-27 Supplement 10 mL ThermoFisher  17504-044
Gibco Basal Medium Eagle (BME) 500 mL  ThermoFisher 21010046 (+) Earle's Salts, (-) L-Glutamine 
Gibco HBBS (1x) Hanks' Balanced Salt Solution  500 mL ThermoFisher 14025092 Calcium, Magnesium, No phenol red
Gibco HI FBS 100 mL ThermoFisher 16140-063
Gibco L-Glutamine 200 mM (100x) ThermoFisher 25030-081
Gibco Penicilline/Streptomicine  ThermoFisher 15140-122 10,000 U/mL
Gibco Sodium Pyruvate (100 mM) 100 mL ThermoFisher 11360070
MiniMACS Separator and Starting Kit Miltenyi Biotec 130-042-102
Mouse Leptin R Biotinylated Antibody R&D Systems  ABAF497 0.25 μg/106 cells
MS Column Miltenyi Biotec 130-042-201
Neaubeaur-Improved Brightline 100 µm Chamber Hausser Scientific  3120
Neural Tissue Dissociation Kit - Postnatal Neurons Miltenyi Biotec 130-094-802
Neuronal Culture Medium 500 mL  ThermoFisher 88283
Non-Neuronal Cell Biotin-Antibody Cocktail mouse 1 mL Miltenyi Biotec 130-115-389
Olympus SZ61 Zoom Stereomicroscope  Olympus Life Science SZ61/SZ51 
Pierce Primary Neuron Isolation Kit ThermoFisher 88280Y
Staining
Anti-MAP2 antibody Abcam ab5392 1 : 800
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 ThermoFisher A32766 1 : 500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 ThermoFisher A32790 1 : 500
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)  Sigma Aldrich  MFCD00131855
Goat anti-Chicken IgY (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647 ThemoFisher A32933 1 : 500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher A11037 1 : 200
Invitrogen Leptin Receptor Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (JA73-01) ThermoFisher MA5-32685 1 : 500
Mouse Leptin R Biotinylated Antibody R&D Systems  ABAF497 1 : 500
POMC Rabbit mAb  Cell Signaling Technology D3R1U 1 : 500
PSD95 (D74D3) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology D74D3#3409 1 : 500
Streptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher S11227 1 : 500
Synapsin 1 Monoclonal Antibody (7H10G6) ThermoFisher MA5-31919 1 : 500
Vectashield Plus Antifade Mountina Medium with DAPI 10 mL Vector Laboratories  H-2000

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 198 लेप्टिन लेप्टिन रिसेप्टर हाइपोथैलेमस प्राथमिक न्यूरॉन्स मेलानोकोर्टिन पीओएमसी आर्क्यूट न्यूक्लियस ऑगुटी-संबंधित प्रोटीन
हार्मोनल, चयापचय और विद्युत विनियमन के अध्ययन के लिए लक्षित हाइपोथैलेमिक न्यूरॉन्स का अलगाव
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Elena, K. I. F., Roser, C., Gaur,… More

Elena, K. I. F., Roser, C., Gaur, A., Sesti, F. Isolation of Targeted Hypothalamic Neurons for Studies of Hormonal, Metabolic, and Electrical Regulation. J. Vis. Exp. (198), e65674, doi:10.3791/65674 (2023).

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