Summary
אנו מראים כי ביטוי יתר של קולטני אפידרמיס גורם גדילה (EGFR) משפר את תנועתיות של בתאי גזע עצביים (NSCs) באמצעות מכשיר agarose רומן ג'ל microfluidic מבוסס. טכנולוגיה זו ניתן להתאמה בקלות מערכות אחרות תא יונקים שבו מקורות תא נדירים, כגון אדם בתאי גזע עצביים, ועל להסתובב הזמן הוא קריטי.
Abstract
בעוד הטכנולוגיה microfluidic הוא להגיע לרמה חדשה של בגרות עבור מבחני macromolecular, מבוססי תאים מבחני נמצאים עדיין בשלב תינוק 1. זהו בעיקר בשל הקושי שבה ניתן ליצור microenvironment תא תואם ויציב באמצעות טכניקות microfabrication קונבנציונאלי וחומרים. אנו לטפל בבעיה זו באמצעות הקדמה של חומר microfabrication רומן, agarose ג'ל, כחומר בסיס עבור המכשיר microfluidic. Agarose ג'ל הוא נזיל מאוד, החדיר את גז וחומרים מזינים הנחוצים להישרדות התא, ובכך חומר אידיאלי עבור מבוססי תאים מבחני. הראינו בעבר כי agarose מכשירים מבוססי ג'ל הצליחו ללמוד נדידת תאים חיידקיים נויטרופילים 2. בדו"ח זה, בשלושה ערוצים מקבילים microfluidic הם בדוגמת בקרום ג'ל agarose בעובי 1 מ"מ בערך. תזרים קבוע עם התקשורת / חיץ נשמרים בשני ערוצי הצד באמצעות משאבת peristaltic. תאים נשמרים בערוץ במרכז לצורך השגחה. מאז מזינים וכימיקלים בערוצים לוואי לשדר כל הזמן מהצד למרכז הערוץ, את הסביבה הכימית של הערוץ במרכז נשלטים בקלות באמצעות זרימת לאורך תעלות הצד. שימוש במכשיר זה, אנו מראים כי תנועת בתאי גזע עצביים ניתן לנטר אופטית בקלות בתנאים כימיים שונים, את תוצאות הניסוי הראו כי ביטוי יתר של קולטני אפידרמיס גורם גדילה (EGFR) משפר את תנועתיות של בתאי גזע עצביים. תנועתיות של בתאי גזע עצביים הוא סמן חשוב להערכת האגרסיביות תאים, ובכך גורם tumorigenic 3. פיענוח המנגנון הבסיסי תנועתיות NSC תניב תובנה הן הפרעות התפתחות סרטן עצביים אל המוח הפלישה בתאי גזע.
Protocol
נוהל
ציפוי שקופיות עם פיברונקטין
לפני ההרכבה של המכשיר microfluidic, לעקר שקופיות הזכוכית עם פיברונקטין. המעיל שקופיות biohood לשמור על סטריליות. יישר spacer סטרילי PDMS בשולי השקופית ולסמן את הצד שהוא פונה כלפי מעלה עם סמן קבע. פיפטה 1 מ"ל של פתרון מיקרוגרם / 5 מ"ל של פיברונקטין (Sigma) בתוך spacer PDMS על מכלול שקופיות הזכוכית. השאירו את השקופיות ללא הפרעה במשך שעה, ואז להתייבש לחלוטין באמצעות אקדח 2 N. השקופיות ניתן לאחסן 4 o C עבור ניסויים מאוחר יותר.
הרכבת מכשיר
פרוטוקול כולו הרכבה המכשיר נעשית biohood בתנאים סטריליים, באמצעות הפעולות הבאות:
- נקו את המאסטר סיליקון עם microchannels בדוגמת עליה על ידי מנגב אותו עם אתנול 70% וייבוש עם האקדח N 2. מניחים spacer סטרילי PDMS גובה 1 מ"מ באמצעות מלקחיים סביב התכונות הקלה של המאסטר.
- הכינו את הג'ל agarose השתמשו במכשיר על ידי במשקל 0.3 גרם של אבקת agarose (פישר סיינטיפיק) ו 10 מ"ל CO 2-מדיה עצמאית (Invitrogen) בכוס 50 מ"ל. מערבבים את התערובת עם מרית חום במיקרוגל למשך 20 שניות על HIGH. אם גרגרי שלא נמס נוכחים, חום את התערובת למשך 10 שניות מערבולת את התערובת החמה להיפטר הגרגרים האחרון שנותר. חזור על התהליך עם זמן חימום של 8 שניות, ולאחר מכן 5 שניות.
- במהירות לשפוך את הפתרון agarose על המאסטר סיליקון מוקף spacer PDMS ומיד לכסות את התערובת agarose עם שקופיות זכוכית סטרילית. החלת לחץ מתמיד, עדין לשקופית כ -2 דקות על מנת להבטיח כי agarose יהיה ג'ל כדי באותו גובה 1 מ"מ קבוע כשומר PDMS.
- לאחר ג'לים agarose, לקלף agarose בדוגמת ג'ל עם spacer PDMS מן האדון סיליקון להעביר שקופיות הזכוכית פיברונקטין מצופה microchannels בתוך הג'ל agarose מול שקופית. השתמש קצה המזרק 16 מד לנקב חורים לתוך האזורים מאגר של microchannels עבור כניסת כניסות ו לשקע. הוסף 500 μl של CO 2-מדיה עצמאית על agarose בדוגמת ג'ל בשקופית כדי למנוע התייבשות של microchannels.
- שטפו את סעפת אקריליק בשימוש במכשיר עם אתנול 70% ולשטוף עם מים די. יישר את החורים הרבים עם החורים אגרוף לתוך הג'ל agarose עם microchannels. ואז, ליישר את סעפת עם הג'ל, spacer PDMS, ואת החלק פיברונקטין עם מסגרת המתכת של המכשיר. המקום ברגים לתוך המכשיר והדק עד כדי התנגדות באמצעות מברג. הדבר נעשה על מנת להבטיח כי המכשיר אינו מעל התהדקו עד כדי לעוות את microchannels ב agarose. הדקו את הברגים כדי השעון כדי להבטיח את הג'ל בתוך המכשיר אינו משמרת. בדוק את המכשיר עבור דליפות חסימות microchannels שימוש במזרק 1ml. מזרק מצויד בצינור Tygon עם קצה ג'ל טעינת פיפטה בסוף בצינור להזריק 2-CO מדיה עצמאית ב microchannels. Microchannel נחשבת נוצר בהצלחה כאשר התקשורת היא נצפתה רק יציאה משקע של microchannel כאשר התקשורת מוזרק לתוך מפרצון המקביל. עכשיו, המכשיר מוכן לשימוש.
הכנה מתזמן את התאים למכשיר
כאשר התאים מגיעים 70% (צפיפות התאים סביב 100,000 תאים / מ"ל) confluency, הם מוכנים להיות seeded לתוך המכשיר.
נושא התאים לשני DPBS (Invitrogen) שוטף. הוסף 200 μl של טריפסין-EDTA (Invitrogen) לנתק את התאים. העברת התאים צינור המכיל 15 מ"ל צנטריפוגות 5 מ"ל של התקשורת M2 המכילה סרום להשבית טריפסין. Centrifuged התקשורת צמיחה עם התאים על 1000 סל"ד במשך 5 דקות. Aspirated את supernatant ו resuspend גלולה של תאים 5 מ"ל של DPBS. צנטריפוגה התאים DPBS שוב באותם תנאים. Aspirated את supernatant שוב, resuspend גלולה של תא 500 μl של CO 2-מדיה עצמאית.
זרעים ההשעיה וכתוצאה מכך התאים למרכז microchannel של המכשיר באמצעות זרימת הכבידה מונע. מוסיפים את כניסת ו לשקע של מרכז microchannel עם 60 μl של השעיה על התא 20 μl של המדיום 2-CO עצמאיים, בהתאמה. שים לב מרכז microchannel תחת מיקרוסקופ brightfield לחפש הידבקות התא. התאים בדרך כלל לדבוק אחרי 10 דקות. אחרי התאים להיצמד לתחתית הערוץ בצפיפות ראויה, pipeted את ההשעיה תא שנותרו כניסת ואת התקשורת לשקע. מקום 60 μl של CO2 עצמאית התקשורת וגם לשקע כניסת הערוץ למרכז. המקום משתרע על פני ה PDMSדואר כניסת מרכז לשקע כדי למזער את התאדות של התקשורת מערוץ מרכז.
הדמיה התאים למכשיר
לפני ההרכבה של המכשיר, החוט צינורות peristaltic סטרילית דרך תחנת מזג האוויר של המיקרוסקופ (אולימפוס X81) ולהתחבר עם המשאבה peristaltic (ווטסון, מרלו 205U/CA). פלאש PBS דרך צינורות בשיעור של 4 סל"ד. לאחר ההרכבה של המכשיר, להכין ריכוזים מתאימים של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) (Sigma) פתרונות של 2-CO מדיה עצמאית ב 15 מבחנות צנטריפוגה מ"ל. וורטקס EGF פתרונות עבור 5 שניות להתחבר עם צינור. חבר את tubings המסומנים ריכוזי EGF המתאים למכשיר. זה לוקח בערך שעה עבור EGF כדי מפוזר על פני הרכס ערוץ ולהקים שיפוע כימי יציב.
תוכנת הדמיה, Slidebook, הוא נהג לקחת סדרה של תמונות על כל 10 דקות במשך כ 5 שעות בטווח ניסיונית. השלב xy אוטומטי מתוכנת כך כי שני אזורי משנה (כל אחד עם שטח של x400μm 400μm) של הערוץ אותו מוקד, וכן סך של שלושת הערוצים הם צילמו במרכז בנקודת זמן נתונה. תאים ערוצי מרכז שונים (בדרך כלל 3 בטווח אחד) יש ריכוזים EGF שונים, המסומנים על הצינור.
חומרים וציוד
שורות תאים: תאים C17.2 NSCs נגזר השכבה החיצונית של המוח הקטן נבטי עכבר הלידה 6, 7. באמצעות קו זה התא, פיתחנו שני האחרים Murine בתאי גזע קווי transfection באמצעות שיטת רטרווירוס. שתי השורות הללו ביציבות התא transfected הם (1) wtEGFR - כי מעל מבטא את EGFR אדם סוג בר, (2) ΔEGFR - כלומר מוטציה EGFR פעיל constitutively. על מנת להקל על הזיהוי, רטרווירוסים לשאת השדרה עם הגן של אינטרסים ואחריו אתר פנימי מחייב ריבוזומלי (IRES) לבין חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP).
Cell תרבות: C17.2 העכבר NSCs וגירסאות שלהם גדלו צלחת 6-באר M2 מדיה (DMEM (Invitrogen) עם 10% בסרום שור העובר (FBS) (Invitrogen), סוס בסרום 5% (ש"מ) (Invitrogen ), ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (Invitrogen).) תאים נשמרו על 37 מעלות צלזיוס באוויר 80% ו 5% CO 2.
המכשיר microfluidic: סעפת פלסטיק, spacer PDMS, ואת מסגרת נירוסטה להחזקת המכשיר במקום.
הדמיה
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה (אולימפוס IX-81) משמש, בקשר עם CCD התעצמה המצלמה (אורקה, Hamamatsu). המכשיר microfluidic הוא רכוב על הבמה XYZ אוטומטיות, והשלב מוקפת קאמרית סביבתיים שומרת על טמפרטורה של 37 o C. בדרך כלל יש 3-4 מכשירים על אותו שבב זה יהיה מצולם בנקודת זמן זהה באמצעות הבמה אוטומטיות xyz.
שמירה על תזרים
המשאבה peristaltic עם 8 קווים מקבילים (ווטסון, מרלו 205U/CA) אוטומטי משמש כדי לשמור על תזרים בכל הכיור ערוצי מקור.
איור. 1 תנועתיות של שלושה זנים NSC (הורים, wtEGFR, ו-D-EGFR) בריכוזים שונים EGF כל מסלולי לקוחים מעקב סרט של 5 שעות (למעט wtEGF 100ng/ml, 4hour), וכן את המקור של כל המסלולים היו מיקומו בבית (0,0) לצורך השוואה.
איור. 2 מתאם של רמת ביטוי EGFR ו - תנועתיות (א) שתי תמונות של NSCs wtEGF על פני השטח של ערוץ microfluidic עם 100ng/ml EGF. התמונה השמאלית היא תמונה ניאון, והזכות היא תמונה משודרים שדה בהיר. סרגל מידה הוא 100μm, ואת רוחב הערוץ הוא 400 מיקרומטר. תאים מופרדים לשתי האוכלוסיות על ידי בהירות ה-GFP הביעו. תאים בחוגים כחול הם עמומים, ובכך יש רמת ביטוי EGFR פחות; ותאי בחוגים באדום brigher, ובכך יש ביטוי ברמה גבוהה EGFR. (ב) מסלולים של תאים עם רמה נמוכה וגבוהה ביטוי EGFR. מסלולים אלו לקוחים מתוך סרט באורך שעה ארבע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
איור. 1 מראה מסלולים של שלושה זנים NSC, התאים הורית, wtEGFR ואת ΔEGFR (שליטה). כל סט של מסלולי התקבלו בסרט 5 שעות ארוכות. עבור תאים הורית, תנועתיות התא הגיע לשיאו כאשר ריכוז EGF היה ~ 10ng/ml; עבור תאים wtEGFR, תנועתיות שיא התא עבר 100ng/ml או לעיל; עבור תאים ΔEGFR, תנועתיות התא היה עצמאי של ריכוז EGF כצפוי.
התאים wtEGF עם 100ng/ml היו תאים ניעתי ביותר, הם עברו על 1.5 פעמים מהר יותר מאשר תאים עם ההורים 10ng/ml. זה מצביע על כך (1) על הביטוי של EGFR משפר את תנועתיות התאים, (2) את מספר EGF ליגנד לקולטן אירועים ממתין יש השפעה ישירה על תנועתיות התא. קו ΔEGFR התא הוא EGFR מוטנטי פעיל constitutively. מוטציה זו מופיעה ב 60% ~ של גליובלסטומה האדם. יש לו תחום תאי מקוצץ זה הופך קינאז מכוננת פעיל ליגנד עצמאית. עוצמת autophosphorylation הוא קטן (כ 10%) לעומת ליגנד מופעל wild-type EGFR (wtEGFR) 4. זה ביסוד תצפית כי תאי ΔEGF יש תנועתיות גבוהה במקצת מזו של ההורים wtEGFR (בהעדר EGF), אך תנועתיות נשמר קבוע בריכוזים שונים EGF.
מאז תאים wtEGFR נשאו עותקים זהה של ה-GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) ו-EGFR, עוצמת ניאון של תאים wtEGFR לחשוף את הביטוי רמות EGFR. זה מאפשר לנו לקשר ישירות את החלבון EGFR ביטוי ברמה (עוצמת פלואורסצנטי ירוק) עם תנועתיות התא. איור. 2 מציג את מסלולי האוכלוסייה two התא, התאים עיגול אדום בהירים, ובכך יש ביטוי ברמה גבוהה EGFR, והתאים במעגל הכחול הם ארוחת הערב, ובכך יש ביטוי ברמה נמוכה EGFR. התוצאות שוב מוכיחים כי ככל שעולה רמת ביטוי EGFR, יותר ניעתי תאים אלה.
באופן מסורתי, תנועתיות של NSCs נקבע באמצעות assay קאמרית בוידן, שם אחוז תאים נודדים דרך קרום מוערך 5. זהו assay אוכלוסייה מבוססת, שבה התנהגות התא לא ניתן להעריך בנפרד. המכשיר microfluidic המוצג כאן מהווה הזדמנות ללמוד תנועה התא ברמת תא בודד, וגם בסביבה כימית מבוקרת היטב. זה מאפשר, לראשונה, כדי לתאם ישירות את החלבון EGFR ביטוי ברמה עם פנוטיפ תנועתיות NSCs בתאים חיים. גודלו הקטן של המכשיר הוא שימושי במיוחד עבור ניסויים שבהם תאים מקורות מוגבלים, כגון לתאי גזע אנושיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי משרד של מדינת ניו יורק למדע, טכנולוגיה ומחקר אקדמי (NYSTAR) (בצורה של מרכז עבור טכנולוגיה מתקדמת מענק), וכן על ידי מענקים ממרכז Nanobiotechnology (NBTC), תוכנית STC הלאומי קרן המדע על פי הסכם מס 'ECS-9876771, והמוח האמריקאי גידול עורכי הדין בניו יורק, האקדמיה לרפואה (ג'ב).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Reagent | Invitrogen | 11971-025 | |
| CO2-independent media | Reagent | Invitrogen | 18045-088 | A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine |
| Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | 25200-072 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14190-144 | Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium |
| Pen/Strep | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline |
| FBS | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | Fetal Bovine Serum, Qualified |
| Horse Serum | Reagent | Invitrogen | 16050-130 | Horse Serum, EIA tested (negative) serum |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin |
| EGF | Reagent | Sigma-Aldrich | E4127 | Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized |
| Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1356-500 |
References
- Blow, N. Microfluidics: in search of a killer application. Nature Methods. 4, 665-670 (2007).
- Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. ax, Archer, S. hivaun, Shuler, M. ichael L., Wu, M. ingming A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration. Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).
- Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility. Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).
- Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer. Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).
- Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis. J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).
- Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum. Cell. 68, 33-51 (1992).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).
