Summary
Abbiamo dimostrato che l'espressione dei recettori più fattore di crescita epidermico (EGFR) aumenta la motilità delle cellule staminali neurali (NSC) utilizzando un nuovo gel dispositivo basato microfluidica. Questa tecnologia può essere facilmente adattabile ad altri sistemi cellulari di mammifero, dove le fonti di cellule sono scarse, come le cellule staminali neurali, e il girarsi tempo è critico.
Abstract
Mentre la tecnologia microfluidica sta raggiungendo un nuovo livello di maturità per le analisi macromolecolare, saggi cellulari sono ancora ad uno stadio infantile 1. Ciò è dovuto alla difficoltà con cui si può creare un microambiente cellulare compatibile e costante con tecniche convenzionali di microfabbricazione e materiali. Abbiamo risolto questo problema tramite l'introduzione di un materiale di microfabbricazione romanzo, gel, come materiale di base per il dispositivo a microfluidi. Gel è altamente malleabile, e permeabile ai gas e sostanze nutritive necessarie per la sopravvivenza delle cellule e, quindi, un materiale ideale per saggi cellulari. Abbiamo dimostrato in precedenza che i dispositivi di agarosio gel a base hanno avuto successo nello studio della migrazione delle cellule batteriche e dei neutrofili 2. In questo rapporto, tre canali paralleli microfluidica sono modellati in una membrana di gel di circa spessore 1mm. Flussi costanti con i media / tampone sono mantenute nei due canali laterali utilizzando una pompa peristaltica. Le cellule sono mantenute nel canale centrale per l'osservazione. Dal momento che le sostanze nutrienti e sostanze chimiche nei canali laterali sono costantemente diffondendo dal lato al centro del canale, l'ambiente chimico del canale centrale è facilmente controllato attraverso il flusso lungo i canali laterali. Utilizzando questo dispositivo, dimostriamo che il movimento delle cellule staminali neurali possono essere monitorati otticamente con facilità in condizioni chimiche diverse, ed i risultati sperimentali mostrano che l'espressione dei recettori più fattore di crescita epidermico (EGFR) aumenta la motilità delle cellule staminali neurali. Motilità delle cellule staminali neurali è un biomarker importante per valutare l'aggressività delle cellule, così fattore oncogeno 3. Decifrare il meccanismo alla base della motilità NSC produrrà comprensione entrambi i disturbi dello sviluppo neurale e in invasione di cellule di cancro al cervello staminali.
Protocol
Procedura
Diapositive rivestimento con fibronectina
Prima del montaggio del dispositivo a microfluidi, sterilizzare vetrini con fibronectina. Cappotto le diapositive in una biohood per mantenere la sterilità. Allineare un distanziatore sterile PDMS lungo i bordi della diapositiva e contrassegnare il lato che è rivolto verso l'alto con un pennarello indelebile. Pipettare 1 ml di mg / 5 ml soluzione di fibronectina (Sigma) all'interno del distanziatore PDMS sulla totalità del vetrino. Lasciare le diapositive indisturbato per un'ora, poi asciugare completamente con un N 2 pistola. Le slide possono essere conservati a 4 ° C per esperimenti successivi.
Montaggio del dispositivo
L'intero protocollo di montaggio dispositivo è fatto in un biohood in condizioni sterili, utilizzando le seguenti procedure:
- Pulire il maestro di silicio con i microcanali modellata su di essa con l'annientamento verso il basso con il 70% di etanolo e asciugare con la pistola 2 N. Inserire un distanziatore sterile PDMS di 1 mm di altezza con pinze attorno agli oggetti rilievo del maestro.
- Preparare il gel utilizzato nel dispositivo pesa 0,3 g di polvere di agarosio (Fisher Scientific) e 10 ml di CO 2-media indipendenti (Invitrogen) in un bicchiere da 50 ml. Mescolate il composto con una spatola e calore in un forno a microonde per 20 secondi in alto. Se granuli non disciolti sono presenti, scaldare la miscela per altri 10 secondi e agitare la miscela calda di sbarazzarsi dei granuli ultime. Ripetere il processo con un tempo di riscaldamento di 8 secondi, e poi 5 secondi.
- Versare rapidamente la soluzione di agarosio sul maestro silicio circondato da distanziatore PDMS coprire immediatamente la miscela di agarosio con un vetrino sterile. Applicare una costante, leggera pressione alla diapositiva per circa 2 minuti per assicurarsi che il gel di agarosio sarà allo stesso costante 1 mm di altezza come il distanziatore PDMS.
- Dopo il gel di agarosio, rimuovere la fantasia gel con il distanziatore PDMS dal master silicio e il trasferimento a una diapositiva fibronectina vetro rivestito con la microcanali nel gel di agarosio fronte della diapositiva. Utilizzare una siringa calibro 16 per perforare fori nelle regioni serbatoio della microcanali per ingresso e uscita accessi. Aggiungere 500 ml di CO 2-media indipendenti al gel di agarosio modellata sulla diapositiva per prevenire l'essiccamento dei microcanali.
- Lavare il collettore acrilico usato nel dispositivo con il 70% di etanolo e sciacquare con acqua deionizzata. Allineare i fori nel collettore con i fori nel gel di agarosio con i microcanali. Poi, allineare il collettore con il gel, distanziatore PDMS, e la diapositiva fibronectina con la struttura metallica del dispositivo. Mettere le viti nel dispositivo e serrare al punto di resistenza con un cacciavite. Questo viene fatto per garantire che il dispositivo non è troppo stretto al punto da deformare la microcanali in agarosio. Serrare le viti in senso orario per assicurare che il gel all'interno del dispositivo non si sposta. Prova il dispositivo per perdite e blocchi nel microcanali con una siringa da 1 ml. La siringa è dotata di tubi Tygon con un gel-loading puntale alla fine del tubo di iniettare CO 2-media indipendenti in microcanali. Un microcanali è considerato con successo forma quando i media si osserva per uscire solo dalla presa di microcanali quando il supporto viene iniettato nella presa corrispondente. Ora, il dispositivo è pronto all'uso.
Preparazione e semina delle cellule nel dispositivo
Quando le cellule raggiungono il 70% (densità delle cellule circa 100.000 cellule / ml) confluenza, sono pronti per essere seminati nel dispositivo.
Oggetto delle cellule a due DPBS (Invitrogen) lavaggi. Aggiungere 200 ml di tripsina-EDTA (Invitrogen) per staccare le cellule. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml per centrifuga contenente 5 ml di media M2 contenente siero per inattivare la tripsina. Centrifugati i mezzi di crescita con le cellule a 1000 giri per 5 minuti. Aspirato il sopranatante e risospendere il pellet di cellule 5 ml di DPBS. Centrifugare le cellule DPBS ancora una volta alle stesse condizioni. Aspirato il sopranatante di nuovo, e risospendere il pellet di cellule in 500 ml di CO 2-media indipendenti.
Seme della sospensione risultante di cellule al centro microcanali del dispositivo tramite gravità-driven flusso. Aggiungere l'ingresso el'uscita del centro microcanali con 60 ml di sospensione cellulare e 20 ml di CO 2-indipendente di media, rispettivamente. Osservare il centro microcanali sotto un microscopio brightfield per cercare l'adesione cellulare. Le cellule aderiscono solitamente dopo 10 minuti. Dopo che le cellule aderiscono al fondo del canale ad una giusta densità, pipeted la sospensione cellulare residua in entrata e in media in presa. Mettere 60 ml di CO 2-media indipendenti in entrambe ingresso e uscita del canale centrale. Luogo PDMS copre oltre ªe di ingresso e di uscita centrale per ridurre al minimo l'evaporazione del supporto dal canale centrale.
Imaging delle cellule nel dispositivo
Prima del montaggio del dispositivo, infilare il tubo sterile peristaltica attraverso la stazione meteo del microscopio (Olympus X81) e collegare con la pompa peristaltica (Watson-Marlow 205U/CA). Flush PBS attraverso il tubo ad una velocità di 4 giri. Dopo il montaggio del dispositivo, preparare concentrazioni adeguate di fattore di crescita epidermico (EGF) (Sigma) soluzioni nel 2-media indipendenti CO in un tubo da 15 ml per centrifuga. Vortex le soluzioni FEG per 5 secondi e connettersi con il tubo. Collegare i tubi contrassegnati con concentrazioni di EGF corrispondente al dispositivo. Ci vuole circa un'ora per il FEG per diffondere in tutto il crinale dei canali e stabilire una pendenza chimico.
Un software di imaging, Slidebook, viene utilizzato per prendere una serie di immagini a ogni 10 minuti per circa 5 ore in una corsa sperimentale. La fase xy automatico è programmato in modo tale che due sub-aree (ciascuna con una superficie di x400μm 400μm) del canale stesso centro, e un totale di tre canali di centro sono esposte in un punto dato momento. Le cellule in diversi canali di centro (in genere 3 in una volta sola) hanno concentrazioni FEG diversi, come indicato sul tubo.
Materiali e attrezzature
Linee cellulari: le cellule sono C17.2 NSCs derivate dallo strato esterno germinale di topo cervelletto postnatale 6, 7. Usando questa linea cellulare, abbiamo sviluppato altre due linee di cellule staminali murine utilizzando il metodo di trasfezione retrovirus. Queste due linee cellulari stabilmente trasfettate sono (1) wtEGFR - che l'eccesso di esprime l'EGFR umana wild-type, e (2) ΔEGFR - che è un mutante costitutivamente attivo EGFR. Per facilità di rilevazione, i retrovirus portare una dorsale con il gene di interesse seguita da un sito interno per il legame ribosomiale (IRES) e la proteina verde fluorescente (GFP).
Coltura cellulare: il C17.2 NSCs mouse e le loro varianti sono state coltivate in un 6-pozzetti in M2 media (DMEM (Invitrogen) con 10% siero fetale bovino (FBS) (Invitrogen), il 5% siero di cavallo (SA) (Invitrogen ), e 1% di penicillina / streptomicina (Invitrogen).) Le cellule sono state mantenute a 37 ° C in 80% di aria e il 5% di CO 2.
Microfluidic dispositivo: un collettore di plastica, un distanziatore PDMS, e una cornice in acciaio per tenere il dispositivo in posizione.
Imaging
Un microscopio invertito a fluorescenza (Olympus IX-81) viene utilizzata, in connessione con un CCD intensificato fotocamera (Orca, Hamamatsu). Il dispositivo a microfluidi è montato su un palcoscenico automatizzato xyz, e la scena è racchiusa da una camera climatica che mantiene una temperatura di 37 ° C. Di solito ci sono dispositivi 3-4 sullo stesso chip, che sarà girato nel punto stesso tempo utilizzando il palcoscenico automatizzati xyz.
Flusso mantenendo
Una pompa peristaltica con 8 linee parallele (Watson-Marlow 205U/CA) automatica viene utilizzato per mantenere i flussi in tutte le lavello e canali sorgente.
Fig. 1 motilità di tre ceppi NSC (genitori, wtEGFR, e D EGFR) in concentrazioni diverse FEG Tutte le traiettorie sono tratte da un film di monitoraggio di 5 ore (ad eccezione di wtEGF 100ng/ml, 4 ore), e l'origine di tutti i brani sono stati riposizionato a (0,0) per scopi di confronto.
Fig. 2 Correlazione tra livello di espressione di EGFR e motilità (a) due immagini di NSCs wtEGF sulla superficie di un canale microfluidica con 100ng/ml FEG. L'immagine a sinistra è un'immagine fluorescente, e il diritto è una immagine trasmessa campo chiaro. La barra di scala è 100μm, e il Larghezza del canale è di 400 micron. Le celle sono separati in due popolazioni con la luminosità della GFP espresso. Cellule nei cerchi blu sono dimmer, hanno quindi il livello di espressione di EGFR meno, e le cellule con cerchi rossi sono brigher, hanno così alto livello di espressione di EGFR. (B) Traiettorie di cellule con livello di EGFR a bassa ed alta espressione. Queste traiettorie sono tratti da quattro film della durata di un'ora.
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Discussion
Fig. 1 mostra le traiettorie dei tre ceppi NSC, le cellule dei genitori, la wtEGFR e ΔEGFR (controllo). Ogni set di traiettorie sono stati ottenuti da un film di 5 ore. Per le cellule dei genitori, la motilità cellulare ha raggiunto un picco quando la concentrazione di FEG è stato ~ 10ng/ml; per le cellule wtEGFR, la motilità delle cellule picco spostato a 100ng/ml o superiore, per le cellule ΔEGFR, la motilità cellulare è indipendente dalla concentrazione di EGF come previsto.
Le cellule wtEGF con 100ng/ml sono le cellule più mobili, si sono trasferiti circa 1,5 volte più veloce rispetto alle cellule parentali con 10ng/ml. Questo indica che (1) oltre l'espressione di EGFR aumenta la motilità delle cellule, (2) il numero di ligando-recettore EGF eventi aspettando ha un impatto diretto sulla motilità cellulare. Linea cellulare ΔEGFR EGFR è un mutante costitutivamente attivo. Questo mutante appare in ~ 60% del glioblastoma umano. Ha un dominio extracellulare troncato che diventa costitutiva attivo ligando-indipendente chinasi. L'intensità del autofosforilazione è piccola (circa 10%) rispetto al ligando attivati wild-type EGFR (wtEGFR) 4. Questo sottolinea l'osservazione che le cellule hanno ΔEGF motilità leggermente superiore a quella dei genitori e wtEGFR (in assenza di EGF), ma la motilità è mantenuta una costante in concentrazioni FEG diversi.
Dal momento che le cellule wtEGFR effettuato stesse copie di GFP (green fluorescent protein) e EGFR, l'intensità fluorescente delle cellule wtEGFR rivelano i livelli di espressione di EGFR. Questo ci permette di correlare direttamente la proteina EGFR livello di espressione (verde fluorescente di intensità) con la motilità cellulare. Fig. 2 mostra le traiettorie di due popolazioni di cellule, le cellule nel cerchio rosso sono più luminosi, quindi ha un livello di espressione di EGFR, e le cellule del cerchio blu sono a cena, ha così basso livello di espressione di EGFR. I risultati dimostrano ancora una volta che maggiore è il livello di espressione di EGFR, più mobili queste cellule sono.
Tradizionalmente, la motilità del NSC è stata determinata usando un test camera di Boyden, dove viene valutata la percentuale di cellule che migrano attraverso una membrana 5. Questo è un test basato sulla popolazione, in cui il comportamento delle cellule non possono essere valutati singolarmente. Il dispositivo a microfluidi mostrato qui presenta l'opportunità di studiare il movimento delle cellule a livello di singola cellula, e in un ambiente chimico ben controllato. Essa permette, per la prima volta, di correlare direttamente la proteina EGFR livello di espressione con il fenotipo motilità NSCs nelle cellule viventi. Le piccole dimensioni del dispositivo è particolarmente utile per gli esperimenti in cui le fonti cellule sono limitate, come ad esempio le cellule staminali umane.
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Acknowledgments
Questo lavoro è supportato dal New York State Ufficio di Scienza, Tecnologia e ricerca accademica (NYSTAR) (sotto forma di un Centro per l'avanzata tecnologia di sovvenzione), e da sovvenzioni provenienti dal Centro Nanobiotecnologie (NBTC), un programma STC del National Science Foundation sotto Accordo No. ECS-9876771, e l'American Brain Tumor Association e la New York Academy of Medicine (JAB).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Reagent | Invitrogen | 11971-025 | |
| CO2-independent media | Reagent | Invitrogen | 18045-088 | A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine |
| Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | 25200-072 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14190-144 | Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium |
| Pen/Strep | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline |
| FBS | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | Fetal Bovine Serum, Qualified |
| Horse Serum | Reagent | Invitrogen | 16050-130 | Horse Serum, EIA tested (negative) serum |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin |
| EGF | Reagent | Sigma-Aldrich | E4127 | Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized |
| Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1356-500 |
References
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- Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility. Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).
- Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer. Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).
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