Summary
Vi visar att mer än uttryck för epidermal receptorer tillväxtfaktor (EGFR) förbättrar motiliteten av neurala stamceller (NSCs) med en roman agarosgel baserade mikroflödessystem enhet. Denna teknik kan lätt anpassas till andra däggdjur cellsystem där cell källorna är knappa, såsom mänskliga neurala stamceller, och vända tid är kritisk.
Abstract
Medan mikroflödessystem tekniken är att nå en ny nivå av mognad för makromolekylära analyser, cellbaserade analyser är fortfarande på ett spädbarn etapp 1. Detta beror till stor del på svårigheten med vilken man kan skapa en cell-kompatibel och stadig mikromiljö med konventionell mikrofabrikation tekniker och material. Vi tar upp detta problem genom att införa ett nytt mikrofabrikation material, agarosgel, som bas material för mikroflödessystem enhet. Agarosgel är mycket formbart och släpper igenom gas och näringsämnen som behövs för cellens överlevnad, och därmed ett idealiskt material för cell-baserade analyser. Vi har visat tidigare att agarosgel baserade enheter har varit framgångsrika i att studera bakterier och neutrofiler cell migration 2. I denna rapport finns tre parallella mikroflödessystem kanaler mönstrade i en agarosgel membran av ca 1 mm tjocklek. Konstant flöde med media / buffert bibehålls i två sidan kanalerna med en peristaltiska pumpar. Celler bibehålls i centerkanalen för observation. Eftersom näringsämnen och kemikalier i sidokanalerna ständigt spridande från sida till centerkanalen, den kemiska miljön i centerkanalen enkelt kontrolleras via flödet längs kanalerna. Med hjälp av denna enhet, visar vi att rörelsen av neurala stamceller kan övervakas optiskt med lätthet under olika kemiska förhållanden, och de experimentella resultaten visar att mer än uttryck för epidermal receptorer tillväxtfaktor (EGFR) förbättrar motiliteten av neurala stamceller. Motilitet av neurala stamceller är en viktig biomarkör för att bedöma celler aggressivitet, vilket tumörframkallande faktor 3. Dechiffrera mekanismen bakom NSC motilitet kommer att ge insikt i båda sjukdomarna av neurala utveckling och i hjärncancer stamceller invasion.
Protocol
Förfarande
Beläggning bilder med fibronektin
Innan monteringen av mikroflödessystem enhet, sterilisera glas bilder med fibronektin. Coat bilderna i en biohood att bibehålla sterilitet. Rikta en steril PDMS spacer längs kanterna av bilden och markera den sida som är vänd uppåt med en permanent märkpenna. Pipettera över 1 ml av en 5 mikrogram / ml lösning av fibronektin (Sigma) inuti PDMS spacer över hela den glasplatta. Låt bilderna ostört i en timme, sedan torka helt med hjälp av en N 2 pistol. Bilderna kan lagras vid 4 ° C för senare experiment.
Montering av enheten
Hela enheten församlingen protokollet är gjort i en biohood under sterila förhållanden, genom att göra följande:
- Rengör kisel befälhavaren de mikrokanaler mönstrade på den genom att torka ner det med 70% etanol och torkning med N 2 pistol. Placera en steril PDMS spacer på 1 mm höjd med hjälp av pincetten runt lättnad drag av befälhavaren.
- Förbered agarosgel används i produkten genom att väga 0,3 g agaros pulver (Fisher Scientific) och 10 ml av CO 2-oberoende medier (Invitrogen) i en 50 ml bägare. Rör blandningen med en spatel och värme i en mikrovågsugn i 20 sekunder på HÖG. Om oupplöst granulat finns, värm blandningen i ytterligare 10 sekunder och snurra den heta blandningen att bli av med de sista kvarvarande granulat. Upprepa processen med en uppvärmningstid på 8 sekunder och 5 sekunder.
- Snabbt häll agaroslösningen på kisel herre omgiven av PDMS spacer och omedelbart täcka agaros blandningen med en steril glasskiva. Applicera en konstant, lätt tryck till bilden i ca 2 minuter för att säkerställa att agarosen kommer gelen samma konstanta 1 mm höjd som PDMS spacer.
- Efter agarosgeler, dra av det mönstrade agarosgel med PDMS spacer från kisel mästare och överför till en fibronektin belagd glasskiva med mikrokanaler i agarosgel inför bilden. Använd en 16 gauge sprutspetsen att stansa hål i behållaren regioner i mikrokanaler för in-och accesser utlopp. Tillsätt 500 l av CO 2-oberoende medier i mönstrade agarosgel på bilden för att förhindra uttorkning av mikrokanaler.
- Tvätta akryl grenröret som används i enheten med 70% etanol och skölj med DI-vatten. Rikta in hålen i grenröret med hålen stansade i agarosgel med mikrokanaler. Sedan anpassa fördelaren med gel, PDMS spacer och fibronektin bilden med metallram på enheten. Placera skruvarna i apparaten och dra till den grad av motstånd med en skruvmejsel. Detta görs för att säkerställa att enheten inte är över-åtdragna till den grad att deformeras mikrokanaler i agaros. Dra åt skruvarna i en medurs för att säkerställa att gelen inuti enheten inte skift. Testa enheten för läckor och blockeringar i mikrokanaler med hjälp av en 1 ml spruta. Sprutan är försedd med Tygon slang med en gel-loading pipettspetsen i slutet av slangen att injicera CO 2-oberoende medier i mikrokanaler. En mikrokanalplatta anses framgångsrikt bildas när media observeras att endast lämna utlopp mikrokanalplatta när media sprutas in i motsvarande inlopp. Nu är enheten klar att användas.
Förbereda och såmaskiner cellerna i enheten
När cellerna når 70% confluency (celltäthet runt 100.000 celler / ml), är de beredda att seedas in i enheten.
Ämne cellerna att två DPBS (Invitrogen) tvättar. Tillsätt 200 l av trypsin-EDTA (Invitrogen) för att lossa cellerna. Överför cellerna till ett 15 ml centrifugrör som innehåller 5 ml M2 media som innehåller serum att inaktivera trypsin. Centrifugeras tillväxten media med cellerna vid 1000 rpm i 5 minuter. Aspireras bort supernatanten och suspendera pelleten av celler 5 ml DPBS. Centrifugera DPBS celler igen på samma villkor. Aspireras bort supernatanten igen och suspendera pelleten av cell i 500 l av CO 2-oberoende medier.
Frö den färdigblandade suspensionen av celler i mitten mikrokanalplatta av enheten genom självtryck driven flöde. Lägg till inlopp och utlopp i centrum mikrokanalplatta med 60 l av cellsuspensionen och 20 l av CO 2-oberoende medium, respektive. Observera centrum mikrokanalplatta under ett brightfield mikroskopi för att leta efter celladhesion. Cellerna följer vanligen efter 10 minuter. Efter att cellerna följa kanalen botten på en ordentlig täthet, pipeted de återstående cellsuspensionen i inloppet och media i uttaget. Placera 60 l av CO 2-oberoende medier i både inlopp och utlopp centerkanalen. Placera PDMS täcker över thE Center in-och utlopp för att minimera avdunstning av media från centerkanalen.
Imaging cellerna i enheten
Före montering av enheten, tråden den sterila peristaltiska slangen genom väderstation i mikroskop (Olympus X81) och ansluta med peristaltiska pumpen (Watson-Marlow 205U/CA). Skölj PBS genom slangen med en hastighet av 4 RPM. Efter montering av enheten, förbereda lämpliga koncentrationer av epidermal tillväxtfaktor (EGF) (Sigma) lösningarna i CO 2-oberoende medier i ett 15 rör ml centrifugen. Vortex fonden lösningar i 5 sekunder och få kontakt med slangen. Anslut slangar är märkta med motsvarande EGF koncentrationer till enheten. Det tar ungefär en timme för fonden att sprida över sundet åsen och etablera en stabil kemisk gradient.
Ett bildhanteringsprogram, Slidebook, används för att ta ett antal bilder på varje 10 minuter för ca 5 timmar i en experimentell springa. XY automatiserade steget är programmerat så att två delområden (vardera med en yta på 400μm x400μm) av samma centerhögtalaren, och totalt tre centrala kanaler är avbildad vid en viss tidpunkt. Celler i olika centrum kanaler (vanligtvis tre på en gång) har olika fonden koncentrationer, som finns på slangen.
Material och Utrustning
Cellinjer: C17.2 celler NSCs härrör från externa groddbladet av postnatal musen lillhjärnan 6, 7. Med hjälp av denna cellinje, har vi utvecklat två andra murina stamcellslinjer med metod retrovirus transfektion. Dessa två stabilt transfekterade cellinjer är (1) wtEGFR - att över-uttrycker mänskliga vildtyp EGFR, och (2) ΔEGFR - det är ett konstitutivt aktiv EGFR-mutation. För att underlätta upptäckt, retrovirus bär en ryggrad med genen intressen följt av en intern webbplats för ribosomalt bindande (IRES) och grönt fluorescerande protein (GFP).
Cellodling: Musen C17.2 NSCs och deras varianter odlades i en 6-brunnar i M2 medier (DMEM (Invitrogen) med 10% fetalt bovint serum (FBS) (Invitrogen), 5% hästserum (HS) (Invitrogen ), och 1% penicillin / streptomycin (Invitrogen).) Celler låg kvar på 37 ° C i 80% luft och 5% CO 2.
Mikroflödessystem enhet: En plast grenrör, ett PDMS spacer, och en rostfri ram för att hålla enheten på plats.
Imaging
Ett inverterat fluorescerande mikroskop (Olympus IX-81) används i samband med ett intensifierat CCD-kamera (Orca, Hamamatsu). Den mikroflödessystem enheten är monterad på en automatiserad xyz stadium, och scenen omges av en klimatkammare som håller en temperatur på 37 ° C. Det finns vanligtvis 3-4 enheter på samma chip som kommer att filmas vid samma tidpunkt med den automatiserade xyz scenen.
Flöde upprätthålla
En peristaltiska pump med 8 parallella linjer (Watson-Marlow 205U/CA) auto används till att upprätthålla flöden i hela diskhon och kanaler källa.
Fig.. 1 motilitet tre NSC stammar (föräldrapenning, wtEGFR och D EGFR) i olika fonden koncentrationer Alla banor är hämtade från att spåra en film på 5 timmar (med undantag för wtEGF 100ng/ml, 4hour) och ursprunget till alla spår var flyttas vid (0,0) för jämförelse syfte.
Fig.. 2 Korrelation av EGFR-uttryck nivå och motilitet (a) två bilder av wtEGF NSCs på ytan av en mikroflödessystem kanal med 100ng/ml fonden. Den vänstra bilden är en fluorescerande bild, och till höger är en överförd ljust fält bild. Skalan bar är 100μm och Kanal bredd är 400 ìm. Celler är uppdelat i två populationer av ljusstyrka uttryckte GFP. Celler i det blå cirklarna är dimmer, vilket har mindre EGFR-uttryck nivå, och celler i röda cirklar är brigher, därmed har högre EGFR-uttryck. (B) banor celler med låga och höga EGFR-uttryck nivå. Dessa banor är hämtade från en fyra timmar lång film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fig.. 1 visar banor av tre NSC stammar, för föräldrakontroll celler, wtEGFR och ΔEGFR (kontroll). Varje uppsättning banor erhölls från en fem timmar lång film. För föräldrarnas celler, kulminerade cell motilitet när fonden koncentrationen ~ 10ng/ml, för wtEGFR celler, skiftade cell motilitet topp till 100ng/ml eller högre, för ΔEGFR celler, var cellen motilitet oberoende av fonden koncentration som förväntat.
Den wtEGF celler med 100ng/ml var de rörliga cellerna, flyttade de ungefär 1,5 gånger snabbare än föräldrarnas celler med 10ng/ml. Detta tyder på att (1) över uttryck av EGFR ökar cellernas motilitet, (2) Antalet EGF ligand-receptor bidar händelser har en direkt inverkan på cellen motilitet. ΔEGFR cellinje är ett konstitutivt aktiv EGFR-mutation. Detta mutant visas i ~ 60% av människors glioblastom. Den har en stympad extracellulära domän som blir en konstitutiv aktiv ligand-oberoende kinas. Intensiteten i autophosphorylation är liten (cirka 10%) jämfört med ligand aktiveras vildtyp EGFR (wtEGFR) 4. Detta ligger till grund för observationen att ΔEGF celler har något högre motilitet än föräldrarnas och wtEGFR (i avsaknad av EGF), men motilitet hålls konstant i olika fonden koncentrationer.
Eftersom wtEGFR cellerna transporteras samma exemplar av GFP (grönt fluorescerande protein) och EGFR, fluorescerande intensitet wtEGFR cellerna avslöja nivåer EGFR-uttryck. Detta ger oss möjlighet att direkt korrelera EGFR-nivå proteinuttryck (grönt fluorescerande intensitet) med cellen motilitet. Fig.. 2 visar banor för två cellpopulationen, de celler i röda cirkeln är ljusare, och därmed har högre EGFR-uttryck, och de celler i blå cirkeln är middag, därför har lägre EGFR-uttryck. Resultaten visar återigen att ju högre EGFR-uttryck nivå, desto mer rörliga dessa celler.
Traditionellt har motilitet NSCs fastställts med hjälp av en Boyden kammare analys, där andelen celler vandrar genom ett membran utvärderas 5. Detta är en populationsbaserad analys, där cellens beteende inte kan bedömas individuellt. Den mikroflödessystem enhet som visas här innebär en möjlighet att studera cell rörelseförmågan i en enda cell nivå och i en väl kontrollerad kemisk miljö. Det möjliggör en, för första gången, att korrelera direkt EGFR-nivå proteinuttryck med NSCs motilitet fenotypen i levande celler. Den lilla storleken på enheten är särskilt användbart för experiment där celler källor är begränsade, såsom mänskliga stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av New York State Office of Science, Technology och akademisk forskning (NYSTAR) (i form av ett Center for Advanced Technology bidrag) och genom bidrag från Nanobioteknik Center (NBTC), ett STC-program i den nationella Science Foundation i avtalet Nej ECS-9876771, och den amerikanska hjärntumör Association och New York Academy of Medicine (JAB).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Reagent | Invitrogen | 11971-025 | |
| CO2-independent media | Reagent | Invitrogen | 18045-088 | A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine |
| Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | 25200-072 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14190-144 | Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium |
| Pen/Strep | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline |
| FBS | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | Fetal Bovine Serum, Qualified |
| Horse Serum | Reagent | Invitrogen | 16050-130 | Horse Serum, EIA tested (negative) serum |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin |
| EGF | Reagent | Sigma-Aldrich | E4127 | Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized |
| Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1356-500 |
References
- Blow, N. Microfluidics: in search of a killer application. Nature Methods. 4, 665-670 (2007).
- Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. ax, Archer, S. hivaun, Shuler, M. ichael L., Wu, M. ingming A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration. Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).
- Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility. Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).
- Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer. Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).
- Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis. J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).
- Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum. Cell. 68, 33-51 (1992).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).
