Summary
Nous démontrons que la surexpression du facteur de croissance épidermique récepteurs (EGFR) améliore la motilité des cellules souches neurales (NSC) en utilisant un roman sur gel d'agarose dispositif basé microfluidique. Cette technologie peut être facilement adaptable à d'autres systèmes cellulaires de mammifères où les sources de cellules sont rares, telles que des cellules souches neurales, et le tour autour du temps est critique.
Abstract
Bien que la technologie microfluidique a atteint un nouveau niveau de maturité pour les dosages macromoléculaire, dosages cellulaires sont encore à un stade infantile 1. Ceci est largement dû à la difficulté avec laquelle on peut créer un microenvironnement cellulaire compatible et stable en utilisant des techniques de microfabrication et des matériaux conventionnels. Nous abordons ce problème via l'introduction d'un matériau de microfabrication révolutionnaires, gel d'agarose, comme matériau de base pour le dispositif microfluidique. Gel d'agarose est très malléable et perméable au gaz et les nutriments nécessaires à la survie cellulaire, et donc un matériau idéal pour des essais cellulaires. Nous avons montré précédemment que les dispositifs à base de gel d'agarose ont été couronnés de succès dans l'étude de la migration des cellules bactériennes et des neutrophiles 2. Dans ce rapport, trois en parallèle des canaux microfluidiques sont modelés dans une membrane de gel d'agarose d'environ 1mm d'épaisseur. Flux constant avec les médias / tampons sont maintenues dans les deux canaux latéraux à l'aide d'une pompe péristaltique. Les cellules sont maintenues dans le canal du centre pour l'observation. Depuis les nutriments et les produits chimiques dans les canaux secondaires sont constamment diffuser sur le côté pour le canal central, de l'environnement chimique du canal central est facilement contrôlée via le flux le long des canaux latéraux. En utilisant ce dispositif, nous démontrons que le mouvement des cellules souches neurales peuvent être surveillés optiquement avec aisance dans des conditions chimiques différentes, et les résultats expérimentaux montrent que la surexpression du facteur de croissance épidermique récepteurs (EGFR) améliore la motilité des cellules souches neurales. La motilité des cellules souches neurales est un biomarqueur important pour évaluer l'agressivité des cellules, par conséquent le facteur tumorigène 3. Décrypter les mécanismes sous-jacents motilité NSC donnera un aperçu de ces deux troubles du développement neural et dans le cancer du cerveau des cellules souches d'invasion.
Protocol
Procédure
Revêtement avec diapositives fibronectine
Avant le montage du dispositif microfluidique, stériliser les lames de verre avec de la fibronectine. Enduire les diapositives dans une biohood pour maintenir la stérilité. Aligner une entretoise stériles PDMS sur les bords de la lame et de marquer le côté qui est tourné vers le haut avec un marqueur permanent. Pipeter 1 ml d'une 5 pg / ml solution de fibronectine (Sigma) à l'intérieur de l'entretoise PDMS sur l'ensemble de la lame de verre. Laisser les lames au repos pendant une heure, puis sécher complètement l'aide d'une arme de N 2. Les diapositives peuvent être conservés à 4 o C pour les expériences ultérieures.
L'assemblage du dispositif
Le protocole ensemble du dispositif de montage est fait dans un biohood dans des conditions stériles, en utilisant les procédures suivantes:
- Nettoyer le maître de silicium avec des microcanaux calqué sur lui par l'essuyer avec 70% d'éthanol et séchage avec le N 2 pistolet. Placez une entretoise stériles PDMS de 1 mm de hauteur à l'aide des pinces autour des reliefs du maître.
- Préparer le gel d'agarose utilisée dans le dispositif en pesant 0,3 g de poudre d'agarose (Fisher Scientific) et 10 ml de CO 2-médias indépendants (Invitrogen) dans un bécher de 50 ml. Remuer le mélange avec une spatule et de chaleur dans un four micro-ondes pendant 20 secondes sur HAUT. Si granules insolubles sont présentes, chauffer le mélange pendant 10 secondes et agiter le mélange chaud pour se débarrasser des granules derniers. Répétez le processus avec un temps de chauffage de 8 secondes, puis 5 secondes.
- Verser rapidement la solution d'agarose sur le maître de silicium entouré par l'entretoise PDMS et couvrir immédiatement le mélange d'agarose avec une lame de verre stérile. Appliquer une pression constante et douce à la diapositive pendant environ 2 minutes pour s'assurer que l'agarose gel sera à la même constante de 1 mm de hauteur que l'entretoise PDMS.
- Après les gels d'agarose, décollez le gel d'agarose à motifs avec l'entretoise PDMS par le maître de silicium et le transfert d'une lame de verre recouvert de fibronectine avec les microcanaux dans le gel d'agarose face à la diapositive. Utilisez un bout de la seringue de calibre 16 pour perforer des trous dans les régions de réservoir des microcanaux pour l'entrée et accède sortie. Ajouter 500 pi de CO 2-médias indépendants au gel d'agarose à motifs sur la lame pour éviter le dessèchement des microcanaux.
- Lavez le collecteur d'acryliques utilisés dans le dispositif à l'éthanol 70% et rincer à l'eau DI. Alignez les trous dans le collecteur avec les trous percés dans le gel d'agarose avec les microcanaux. Ensuite, aligner le collecteur avec le gel, l'entretoise PDMS, et la lame de fibronectine avec le châssis métallique de l'appareil. Placez les vis dans le dispositif et serrer au point de résistance en utilisant un tournevis. Ceci est fait pour s'assurer que le dispositif n'est pas trop serré au point de déformer les microcanaux de l'agarose. Serrez les vis dans un sens horaire pour s'assurer que le gel de l'intérieur du dispositif ne se déplace pas. Test de l'appareil pour détecter les fuites et des blocages dans les microcanaux aide d'une seringue de 1ml. La seringue est équipée avec des tubes en Tygon avec une pipette de gel de chargement à l'extrémité de la tubulure d'injecter du CO 2 des médias indépendants dans les microcanaux. Un microcanal est réputé formé avec succès lorsque le support est observé que la sortie de la sortie du microcanal lorsque le support est injecté dans l'entrée correspondante. Maintenant, l'appareil est prêt à l'emploi.
Préparation et d'ensemencement des cellules dans l'appareil
Lorsque les cellules atteignent 70% (densité cellulaire environ 100.000 cellules / ml) de confluence, elles sont prêtes à être ensemencées dans l'appareil.
Objet des cellules à deux DPBS (Invitrogen) lavages. Ajouter 200 ul de trypsine-EDTA (Invitrogen) pour détacher les cellules. Transférer les cellules dans un tube de 15 ml contenant 5 ml de centrifugeuse médias M2 contenant du sérum pour inactiver la trypsine. Centrifugé le milieu de croissance avec les cellules à 1000 rpm pendant 5 minutes. Aspiré le surnageant et resuspendre le culot de cellules de 5 ml de DPBS. Centrifuger les cellules DPBS nouveau dans les mêmes conditions. Aspiré le surnageant à nouveau, et remettre le culot de cellules dans 500 ul de CO 2-médias indépendants.
Graine de la suspension résultante de cellules dans le centre de microcanaux de l'appareil via par gravité débit. Ajouter l'entrée et la sortie du centre de microcanaux avec 60 ul de la suspension cellulaire et 20 pi de CO 2 moyennes indépendantes, respectivement. Observez le centre sous un microscope à microcanaux fond clair pour chercher l'adhésion cellulaire. Les cellules adhèrent généralement au bout de 10 minutes. Après que les cellules adhèrent au fond du canal à une densité adéquate, pipeted la suspension de cellules restant dans l'entrée et les médias dans la prise. Placer 60 l de CO 2-médias indépendants dans les deux entrée et de sortie du canal central. Placez PDMS couvre plus ee centre d'entrée et de sortie pour minimiser l'évaporation des médias à partir du canal du centre.
Imagerie des cellules dans l'appareil
Avant l'assemblage de l'appareil, le fil de la tubulure stérile péristaltique à travers la station météorologique du microscope (Olympus X81) et se connecter avec la pompe péristaltique (Watson-Marlow 205U/CA). Rincer PBS à travers le tube à un taux de 4 tours. Après le montage du dispositif, préparer des concentrations appropriées du facteur de croissance épidermique (EGF) (Sigma) des solutions dans le CO 2-médias indépendants dans un des tubes de 15 ml centrifugeuse. Vortex les solutions EGF pendant 5 secondes et se connecter avec le tube. Connectez les tuyaux marqués avec des concentrations FEM correspondant à l'appareil. Il faut environ une heure pour le FEM à diffuser à travers la crête de canal et d'établir un gradient chimique stable.
Un logiciel d'imagerie, Slidebook, est utilisé pour prendre une série d'images à toutes les 10 minutes pendant environ 5 heures dans une période d'expérimentation. Le XY automatisé est programmé de telle sorte que deux sous-domaines (chacun avec une superficie de 400 microns x400μm) du canal de ce même centre, et un total de trois canaux du centre sont imagées à un instant donné. Les cellules dans les canaux du centre différents (typiquement 3 en un seul passage) ont des concentrations différentes du FEM, comme indiqué sur le tube.
Matériel et équipement
Les lignées de cellules: les cellules sont C17.2 NSCs issus de la couche externe du cervelet de souris germinales postnatales 6, 7. En utilisant cette lignée cellulaire, nous avons développé deux autres lignées de cellules souches murines en utilisant la méthode de transfection rétrovirus. Ces deux lignées de cellules transfectées de façon stable sont (1) wtEGFR - qui surexprime l'EGFR humain de type sauvage, et (2) ΔEGFR - qui est un mutant constitutivement actif EGFR. Pour faciliter la détection, les rétrovirus réaliser une dorsale avec le gène d'intérêt suivie par un site interne pour la liaison du ribosome (IRES) et la protéine fluorescente verte (GFP).
La culture cellulaire: La souris C17.2 CNS et leurs variantes ont été cultivées dans une plaque de 6 puits dans M2 médias (DMEM (Invitrogen) avec 10% sérum de veau fœtal (FBS) (Invitrogen), cheval de 5% de sérum (SH) (Invitrogen ), et 1% de pénicilline / streptomycine (Invitrogen).) Les cellules ont été maintenues à 37 ° C dans l'air de 80% et 5% de CO 2.
Dispositif microfluidique: Un collecteur en plastique, une entretoise PDMS, et un châssis inoxydable pour maintenir le dispositif en place.
Imagerie
Un microscope inversé fluorescente (Olympus IX-81) est utilisé, en relation avec une caméra CCD intensifiée (Orca, Hamamatsu). Le dispositif microfluidique est monté sur une scène automatisé xyz, et le stade est fermé par une enceinte environnementale qui maintient une température de 37 o C. Il ya généralement des dispositifs 3-4 sur la même puce qui sera tourné au point même temps en utilisant la scène automatisés XYZ.
Débit maintien
Une pompe péristaltique avec 8 lignes parallèles (Watson-Marlow 205U/CA) automatique est utilisée pour maintenir les flux dans l'ensemble de l'évier et des canaux de source.
Fig. Une motilité des souches de NSC trois (parents, wtEGFR et D R-EGF) dans des concentrations différentes FEM Toutes les trajectoires sont tirées d'un film suivi de 5 heures (sauf pour wtEGF 100ng/ml, 4 heures), et l'origine de toutes les pistes ont été repositionné à (0,0) à des fins de comparaison.
Fig. 2 Corrélation du niveau d'expression de l'EGFR et la motilité (a) deux images de NSCs wtEGF sur la surface d'un canal microfluidique avec 100ng/ml FEM. L'image de gauche est une image fluorescente, et la droite est une image de champ transmis lumineux. La barre d'échelle est 100 microns, et le Largeur du chenal est de 400 um. Les cellules sont séparées en deux populations par l'éclat de la GFP exprimée. Cellules dans les cercles bleus sont gradateur, donc le niveau d'expression EGFR moins, et les cellules dans les cercles rouges sont brigher, donc niveau supérieur expression de l'EGFR. (B) Trajectoires des cellules avec le niveau d'expression EGFR basse et haute. Ces trajectoires sont prises à partir de quatre heures de temps de film.
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Discussion
Fig. 1 montre les trajectoires de souches NSC trois, les cellules parentales, le wtEGFR et le ΔEGFR (contrôle). Chaque ensemble de trajectoires ont été obtenus à partir d'un film 5 heures de temps. Pour les cellules parentales, la motilité cellulaire atteint son paroxysme lorsque la concentration du FEM a été ~ 10ng/ml; pour les cellules wtEGFR, la motilité cellulaire de pointe déplacé vers 100ng/ml ou au-dessus, car les cellules ΔEGFR, la motilité cellulaire était indépendante de la concentration du FEM comme prévu.
Les cellules wtEGF avec 100ng/ml étaient les cellules les plus mobiles, ils ont déménagé à environ 1,5 fois plus vite que les cellules parentales avec 10ng/ml. Cela indique que (1) sur l'expression de l'EGFR améliore la motilité des cellules; (2) le nombre d'événements FEM Biding ligand-récepteur a un impact direct sur la motilité cellulaire. Lignée cellulaire ΔEGFR est un mutant constitutivement actif EGFR. Ce mutant apparaît dans ~ 60% de glioblastome humain. Il a un domaine extracellulaire tronqué qui devient un actif constitutive indépendante du ligand kinase. L'intensité de l'autophosphorylation est faible (environ 10%) par rapport aux ligands activés de type sauvage EGFR (wtEGFR) 4. Cela sous-tend l'observation que les cellules ont ΔEGF motilité légèrement supérieur au parentale et wtEGFR (en l'absence d'EGF), mais la motilité est maintenu constant à des concentrations diverses FEM.
Puisque les cellules wtEGFR effectué mêmes copies de la GFP (green fluorescent protein) et EGFR, l'intensité de fluorescence des cellules wtEGFR révéler les niveaux d'expression EGFR. Cela nous permet de corréler le niveau d'expression de protéines EGFR (vert intensité de fluorescence) avec la motilité cellulaire. Fig. 2 montre les trajectoires de deux populations de cellules, les cellules dans le cercle rouge sont plus brillantes, ce qui a élevé le niveau d'expression EGFR, et les cellules de cercle bleu sont le dîner, a donc inférieure au niveau expression de l'EGFR. Les résultats démontrent encore une fois que plus le niveau d'expression de l'EGFR, plus mobiles, ces cellules sont.
Traditionnellement, la motilité du CNS a été déterminée en utilisant un dosage chambre de Boyden, où le pourcentage de cellules qui migrent à travers une membrane est évaluée 5. Ceci est un test de population, où le comportement cellulaire ne peut pas être évaluée individuellement. Le dispositif microfluidique ici montre la possibilité d'étudier le mouvement de cellule à un niveau cellule unique, et dans un environnement chimique bien contrôlé. Elle permet, pour la première fois, de corréler directement le niveau de protéines EGFR avec le phénotype motilité NSCs dans les cellules vivantes. La petite taille de l'appareil est particulièrement utile pour des expériences où les sources cellules sont limitées, telles que les cellules souches humaines.
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Acknowledgments
Ce travail est soutenu par l'Office État de New York de la Science, technologie et recherche universitaire (NYSTAR) (sous la forme d'un Centre for Advanced Technology de subvention), et par des subventions du Centre nanobiotechnologie (NBTC), un programme national de la STC Science Foundation vertu de l'Accord n ° ECS-9876771, et l'Association américaine du cerveau de la tumeur et la New York Academy of Medicine (JAB).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Reagent | Invitrogen | 11971-025 | |
| CO2-independent media | Reagent | Invitrogen | 18045-088 | A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine |
| Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | 25200-072 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14190-144 | Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium |
| Pen/Strep | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline |
| FBS | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | Fetal Bovine Serum, Qualified |
| Horse Serum | Reagent | Invitrogen | 16050-130 | Horse Serum, EIA tested (negative) serum |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin |
| EGF | Reagent | Sigma-Aldrich | E4127 | Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized |
| Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1356-500 |
References
- Blow, N. Microfluidics: in search of a killer application. Nature Methods. 4, 665-670 (2007).
- Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. ax, Archer, S. hivaun, Shuler, M. ichael L., Wu, M. ingming A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration. Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).
- Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility. Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).
- Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer. Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).
- Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis. J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).
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- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).
