Nous décrivons une méthode pour la préparation de l'ADN des balles d'or revêtues et de démontrer l'utilisation de ces balles à biolistically transfecter des neurones en culture des coupes d'hippocampe.
Transfection biolistique est un moyen physique de transfecter des cellules en bombardant avec des tissus de haute vitesse de l'ADN des particules enrobées. Nous fournissons un protocole détaillé pour la transfection biolistique de coupes d'hippocampe de rat, de la préparation initiale des balles revêtus d'ADN à la fusillade finale de la culture organotypique utilisant un canon à gènes. Transfection pistolet à gènes est un moyen efficace et facile de transfecter des neurones et est particulièrement utile pour l'étiquetage par fluorescence un petit nombre de cellules dans les tissus tranche. Dans cette vidéo, nous avons d'abord un aperçu des étapes nécessaires à la couche de particules d'or avec l'ADN. Nous avons ensuite montrer comment tapissent l'intérieur du tube en plastique avec des balles d'or / ADN, et la façon de couper ce tuyau pour obtenir les cartouches en plastique pour les charger dans le pistolet à gènes. Enfin, nous effectuons la transfection biolistique des cultures rat tranche de l'hippocampe, ce qui démontre la manipulation de l'Bio-Rad Helios canon à gènes, et offrant des conseils de dépannage pour obtenir des tranches de tissu sain et optimal transfectées.
Transfection biolistique est un moyen physique de transfecter des cellules par l'intermédiaire bombardement de tissus vivants avec des particules de haute vitesse de l'ADN d'or enrobées. Dans le transfert de gène médié particules, en général, les cellules transfectées résultat quand la balle vient reposer dans le noyau. Alors que de nombreuses méthodes de transfection différentes existent, telles que la microinjection, la lipofection, la transfection de phosphate de calcium, l'électroporation et la transfection virale, la transfection biolistique peut offrir un moins de travail, et alternative efficace pour transfecter des cellules qui ne sont pas facilement transfectées en utilisant ces autres méthodes. En fait, il a d'abord été développé comme une technique de transfert de gènes dans les plantes, car la présence de la paroi cellulaire faite de transfection difficile en utilisant des méthodes préexistantes 1. De même, biolistique a gagné en popularité dans le domaine de la neurobiologie depuis neurones post-mitotiques sont notoirement difficiles à transfecter 2,3. En particulier, il est largement reconnu comme principe de la technique pour être utilisés dans des expériences visant à évaluer la morphologie fine de neurones isolés dans les tranches de cerveau intact. Les méthodes décrites ici fournissent une explication détaillée et exhaustive de la façon d'effectuer la transfection biolistique des tranches de cerveau de culture en utilisant une main du gène-gun (le système Hélios Gene Gun; Bio-Rad).
Transfection biolistique est devenu la méthode privilégiée pour la transfection de neurones en culture tranche, car il permet la transfection d'un certain nombre de cellules éparses à travers la tranche du cerveau. De cette façon, les neurones individuels peuvent être examinés isolément. Comme cette technique est particulièrement bien adapté pour la transfection de neurones dans le cerveau tranche, il est souvent utilisé en conjonction avec deux microscopie biphotonique, puisque la visualisation 2-photons d'excitation permet de cellules marquées par fluorescence profonde dans le tissu diffusion de la lumière 4. En effet, les images à fort grossissement de la seule neurones pyramidaux présentées tout au long de cette vidéo ont été capturées à l'aide d'une coutume microscope intégré au laser 2-photons numérisation. En conclusion, la transfection biolistique est un moyen efficace de transfecter des cellules individuelles dans le contexte d'une forte densité de cellules environnantes, et comme tel s'est avéré extrêmement utile pour l'étiquetage fluorescence neurones individuels dans la culture tranche de neurones.
Nous tenons à remercier Mark Lucanic et Hwai-Jong Cheng de l'aide pour l'acquisition des images faible grossissement des coupes d'hippocampe ensemble présenté dans cette vidéo. Nous tenons également à remercier Sarah Parrish pour avoir aidé avec le texte qui accompagne la vidéo.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
1.6um gold particles (microcarrier) | 0.25g | Bio-Rad | 1652264 | |
1M CaCl2 | Fluka | 21115 | ||
100% EtOH | 1pint | Gold shield | ||
Cartridge Tubing | Bio-Rad | 1652412 | ||
Scintillation vials | 20ml, 500/case | VWR | 66021-668 | |
Dessication pellets | “Dricap” | MTI (800-445-9890) | ||
Water bath sonicator | model 50T | VWR | ||
Cartridge holder | pack of 5 | Bio-Rad | 1652426 | |
Barrel liner | pack of 5 | Bio-Rad | 1652417 | |
Diffuser screen | pack of 5 | Bio-Rad | 1652475 | |
O-ring | 75 Viton, Size 007, Qty, 100 | McMaster-Carr | ||
Screen (mesh) | McMaster-Carr | 144258 | ||
PVP | 20mg/ml in EtOH | Bio-Rad | Comes with tubing from biorad | |
Tubing prep station | Bio-Rad | 1652418 | ||
Tubing cutter | Bio-Rad | 1652422 | ||
Helios Gene-Gun | Bio-Rad | 1652411 | ||
Gene gun hose | Bio-Rad | Comes with Gene-Gun | ||
Spermidine | 5g | Sigma | s-0266 |