Gen Tabancası İşaretleri ve Dilim Kültür Nöronlar Biyolistik Transfeksiyon hazırlanması

Summary

Biz DNA kaplı altın mermi hazırlanması için bir metodu tanımlar ve biolistically kültürlü hipokampal dilim nöronlar transfect gibi mermi kullanımını göstermek.

Abstract

Biyolistik transfeksiyon yüksek hız DNA kaplı parçacıkları ile bombardıman doku hücreleri transfecting fiziksel bir araçtır. Biz DNA kaplamalı mermi ilk hazırlık Organotipik dilim kültürlerin bir gen tabancası kullanarak nihai çekim, rat hipokampal dilim Biyolistik transfeksiyon için ayrıntılı bir protokol sağlar. Gen tabancası transfeksiyon nöronlar transfecting verimli ve kolay bir yoludur ve floresan hücrelerin doku dilim küçük bir alt etiketlenmesi için özellikle yararlıdır. Bu video ilk DNA ile kat altın parçacıkları için gerekli adımları özetlemektedir. Gelecek, plastik boru içine altın / DNA mermilerle hattına nasıl göstermek, gen tabancasının içine yüklemek için plastik kartuşları elde etmek için bu boru kesmek için nasıl. Son olarak, Bio-Rad taşıma gösteren gen tabancası Helios ve sorun giderme danışma hizmeti sunan sağlıklı ve optimal transfekte bir doku dilimler elde etmek için, sıçan hipokampal dilim kültürlerin Biyolistik transfeksiyon gerçekleştirmek.

Protocol

Biyolistik Transfeksiyon İÇİN PROTOKOL

Mermi yapma

Bullets 6 aya kadar iyi, ama 2-3 ay sonra transfeksiyon verimliliği azalmaya başlayabilir. Bullets Dessicant pelet varlığında 4 ° C'de muhafaza edilmelidir. Flakon açılmadan önce oda sıcaklığına mermi depolandığı sintilasyon şişeleri, her zaman izin verin.

Başlamadan önce hazır olması:

• Spermidin (0.05M)
• CaCl ₂ (1M)
• EtOH (% 100 yüksek dereceli açılmamış şişe)
• Otoklavlı H ₂ 0
• Transfekte olarak DNA
• Polyvinylpyrrolidone (PVP-20 mg / ml stok)
• 2 X 15 ml konik (2/bullet set)
• Boru (1 oyulmuş X ~ 30 inç / bullet seti)
• Sintilasyon şişeleri (1/bullet seti)
• Kuruma pelet
• 10 ml şırınga w / ucunda boru

Tüp hazırlayın:

1. Kuru ~ tüp istasyonu w / N ₂ gaz (0.4 basıncı) en az 20 dakika bir tüp 30 inç (yaklaşık 2 inç sağ O-halka ötesine uzanan) .

Altın boncuk DNA çökeltisi:

1. Mikrosantrifüj tüp içinde 50 μmL toplam hacmi (maksimum 50 mg toplam DNA) transfekte DNA hazırlayın
2. 6-8 mg altın tartmak ve bir mikrosantrifüj tüpe transfer
3. Altın 0.05M spermidin 100 mcL ekleyin ve 20 saniye boyunca sonikasyon
4. Altın / spermidin DNA'nın 50 mcL ekleyin
5. Vortex (yaklaşık 5 ayar) w / kapağı açık
6. 1M CaCl ₂ bilge 100 mcL bırakın .
7. Sonikasyon kısa süreli (<5 sn)
8. Oda sıcaklığında 10 dakika çökelti izin ver
9. Kısaca sonikasyon

Sonication sırasında PVP çözüm hazırlayın:

1. (3,5 ml% 100 EtOH 7.5 20mg/ml PVP stokunun mcL ekleyin) mermi her set için 15 ml konik, 3.5mL seyreltik PVP PVP çözümü sulandırmak olun

EtOH altın boncuk Durulama:

1. Mikrosantrifüj 10 sn tam hızda altın boncuk Spin
2. Süpernatant atın, ama altın boncuk üstüne küçük bir miktar sıvı tutmak
3. Gerekirse 1ml EtOH 3X yıkayın, kısaca her zaman sonikasyon

Süspanse edin PVP çözüm altın / DNA:

1. 200 mcL 3,5 ml seyreltik PVP / EtOH çözüm altın pelletini tekrar
2. Vortex tekrar süspansiyon için altın pelet (gerekirse kısaca sonikasyon)
3. Yeni bir 15 ml konik, altın / PVP çözüm 200 mcL transfer
4. Tüm altın, 15 ml konik devredilmiştir kadar bir defada 200 mcL PVP ekleyerek, bu şekilde devam edin ve son hacmi 3.2 mL

Kaplama tüp:

1. N ₂ tüp istasyonu kapatın ve kuru tüp kaldırmak
2. 10 ml şırınga kuru boru takın
3. Gayretle 15 ml konik altın / PVP ile dolu sallamak
4. Altın / PVP çözüm boru sonuna yerleştirin ve kabarcıkları önlemek için yavaş yavaş olmak dikkatli emmek
5. ~ 2 inç boru iki ucunda kuru bırakın
6. Boru hala şırınga bağlı ve altın / PVP çözümü ile dolu, tüp geri istasyonu içine dikkatlice yerleştirin
7. Mark çözüm oturur boru ucu
8. Altın şırınga bağlı 5 dakika dinlendiriniz
9. Yerleşik altın (arka yıkamak için değil emin olun) geride bırakmış, böylece şırınga çekerek çok yavaş çözüm Suck
10. Şırınga çıkarın
11. 90 ° Döndür ve 2 saniye bekletin
12. 180 ° döndürün ve bir 2 saniye bekletin
13. 5 saniye için tüp Döndür
14. N ₂ valf 0.4 arasında okur böylece açın - 0.5 ve 5 dakika boyunca kuruma ise altın kaplamalı boru spin.

Tüp Kesme:

1. Boru boru hazırlık istasyonu çıkarın ve işaretleri biter kesti.
2. Etiketli bir sintilasyon flakon koyun kesme kartuşları yakalamak için boru kıyıcı altında
3. Tüp kıyıcı boru ve tüp temiz ustura ile kesmek
4. Sintilasyon flakon bir kuruma pelet yerleştirin.
5. 4 Mağaza kartuşları ° C

Atıcılık Doku Dilimleri

Kültürlü dilim çekerken, kontaminasyonu önlemek için nispeten steril bir teknik istihdam için çok önemlidir. Mermi iki farklı yapıları çekim yaparken, her iki seti de aynı kartuş tutucu içine yüklenmiş olabilir, ancak namlu-liner ve ekran yapıları arasında değiştirilmesi gerektiğini unutmayın.

Başlamadan önce hazır olması:

• DNA mermi (açmadan önce oda sıcaklığına kadar sintilasyon flakon sıcak izin)
• Doku dilimleri
• Gen Tabancası Helios
• Gen tabancası hortumu ile Helyum tankı bağlı </ P>
• Kartuş tutucu
• Yerinde plastik Namlu liner O-ring
• Difüzör (modifiye)
• Difüzör Ekran
• Forseps

Hazırlayıcı gen tabancası:

1. Kullanarak forseps kartuş tutucu içine altın kaplamalı plastik kartuşlarda yerleştirin.
2. Kartuşu tutucu kilit ilk geri iterek, gen tabancasının içine yerleştirin
3. Kilidi ile kartuş tutucu Güvenli
4. O-ring ve güvenli bir yerde difüzör ekran ile bir varil liner edinin
5. Gen tabancasının içine varil-liner Vida

Gen tabancası ile kültür dilim Çekim:

1. Kulak manşonlar koyun
2. Hortum bağlı helyum gazı tankı içine gen tabancası Tak
3. 180 PSI tankı üzerinde baskı
4. Difüzör ekranı herhangi bir toz veya enkaz kaldırmak için havaya bir boş vur. Silahı ateşlemek için, ilk tetiği çekin, sonra silah sesi çıkarıncaya kadar güvenlik kilidi düğmesini bastırın.
5. Boş Çekimden sonra, inkübatör dilim kaldırmak
6. Avans tabancası ilk inşa etmek
7. Yaklaşık 0.5 difüzör ekranı ile çekim dilim 1 inç
8. Advance kartuş kuyuları arasında.
9. Son iyi Çekimden sonra, kuvöz içine dilimlerini
10. Helyum hortum tabancası ayrılmakta önce gaz ve serbest basınç kapatın
11. Sökün varil liner ve kartuşunu çıkarın ve kullanılan kabuklar

Temizleme kartuşu sahipleri ve varil gömlekleri:

1. Yeri kartuşları, varil gömlekleri ve sabunlu su ile beher difüzör ekranları
2. 20 dakika banyo sonikatör ve sonikasyon yerleştirin beher
3. Tüm sabun artıkları kaldırılana kadar iyice su ile durulayın
4. Bir saat için% 70 EtOH yıkayınız
5. Kuruması için kuru kağıt havlu üzerine koyun bir gecede
6. Temizlik kartuşları, varil gömlekleri, ve ekranlar sonra sonraki Biyolistik transfections yeniden

Biyolistik Transfeksiyon Sorun giderme ipuçları

Biyolistik transfeksiyon bazen suboptimal transfeksiyon koşulları neden olabilir. Bu çok az ya da çok fazla hücre transfekte çok yüksek veya çok düşük ekspresyon düzeyleri yol açabilir, ya da genel olarak sağlıksız hale doku dilim neden olabilir. Genellikle sağlıksız dilimleri sonucu basınç patlama. Optimal transfekte doku dilimler elde etmek için bazı ipuçları bulunmaktadır.

: Dilim (ya da çok fazla hücre / dilim transfekte varsa) deneyin sağlıksız görünüyorsa

• artan çekim mesafesi
• azalan basınç gaz tankeri
• altın miktarını azaltarak
• Bio-Rad difüzör merkezi kesme ve difüzör ekranı ile merkezi yerine.

Eğer çok az hücreler transfekte deneyin:

• çekim mesafesi azalan
• gaz tankeri giderek artan bir baskı
• altın miktarını artırarak
• / iyi doku dilim sayısını artırarak
• O-ring varil-liner sağlam olduğundan emin olun.

Emin olun aynı çekim sırasında transfekte hem de çok sayıda ve çok az sayıda hücre ile dilimleri alırsanız:

• simetrik yukarıda silah tutan
• bu altın eşit boru iç kaplama. (Altın bir çizgi alıyorsanız, altın yerine bir kez daha hızlı bir oranda tüp süpernatantı çizmek ve azot açmadan önce altın uzun döndürmek Öte yandan, altın şeritli, Bu muhtemelen mermi yapımı sırasında çok fazla nem maruz kalma nedeniyle boru kaplama önce iyice kurulayın ve kapakları kapaklama) zamanında mermi hazırlanıyor, EtOH açılmamış bir şişe kullanarak emin olun.

Transfeksiyon verimliliği en iyi görünüyorsa (# hücreleri / dilim transfekte), ancak ifade seviyesi çok yüksek veya çok düşük görünüyor:

• altın oran DNA ayarlayın. (Çok düşük ise, örneğin, altın miktarı korumak, ancak DNA miktarını artırmak.)
• çekim ve veri toplama arasındaki süreyi ayarlamak

Yapıları çok az ifade alıyorsanız, çift transfeksiyon durumunda, emin olmak amacıyla, iki yapıları oranı uygun şekilde ayarlayın ve hem de yapıları aynı organizatörü altında olduğundan emin olun bir organizatörü dışı rekabet olmaz.

Discussion

Biyolistik transfeksiyon transfecting hücreleri canlı doku yüksek hız DNA kaplı altın parçacıkları ile bombardımanı ile fiziksel bir araçtır. Mermi çekirdeğinde dinlenmek için geldiğinde parçacık aracılı gen transferi, genel transfekte hücreler neden. Birçok farklı Transfeksiyonu yöntemleri var iken, mikroenjeksiyon, lipofection, kalsiyum-fosfat transfeksiyon, elektroporasyon ve viral transfeksiyon gibi, Biyolistik transfeksiyon, bu diğer yöntemleri kullanarak kolayca transfekte değil hücreler transfecting için yoğun daha az emek, ve verimli bir alternatif sunabilir. Aslında, hücre duvarının varlığı, önceden var olan ^yöntemleri 1 transfeksiyon zorlaştırdı beri ilk bitkilerde gen transferi için bir teknik olarak geliştirilmiştir . Benzer şekilde, post-mitotik nöronlar ^2,3 transfect herkesin bildiği gibi zor olduğundan biolistics nörobiyoloji alanında popülerlik kazanmıştır. Özellikle, ince bozulmamış beyin dilimleri tek nöronların morfolojisi değerlendirilmesini amaçlayan deneylerde kullanılmak üzere ilkesine tekniği yaygın olarak kabul edilmektedir. Burada açıklanan yöntemler, gen tabancası düzenlenen bir elin (Bio-Rad Helios Gen Tabancası sistemi) kullanarak kültürlü beyin dilim Biyolistik transfeksiyon nasıl gerçekleştirileceğine ilişkin detaylı ve kapsamlı bir açıklama sağlamak.

Seyrek, beyin dilim boyunca hücrelerinin sayısı transfeksiyon sağlar çünkü Biyolistik transfeksiyon dilim kültüründe nöronlar transfecting için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir. Bu şekilde, bireysel nöronlar izolasyon incelenebilir. Bu tekniğin özellikle de beyin dilim nöronlar transfecting için uygun olduğundan, genellikle ışık saçılması doku ⁴ içinde derin floresan işaretli hücrelerin foton 2-eksitasyon sağlar görselleştirme bu yana, 2-foton mikroskobu ile birlikte kullanılır . Aslında bu video boyunca sunulan tek piramidal nöronlar yüksek büyütme görüntüleri özel bir dahili 2-foton lazer tarama mikroskobu kullanılarak ele geçirildi. Sonuç Biyolistik transfeksiyon çevreleyen hücreler yüksek yoğunluklu kapsamında tek tek hücrelerin transfecting etkin bir araçtır ve floresan nöronal dilim kültüründe bireysel nöronlar etiketleme gibi son derece yararlı olduğunu kanıtlamıştır.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1.6um gold particles (microcarrier)	0.25g	Bio-Rad	1652264
1M CaCl2		Fluka	21115
100% EtOH	1pint	Goldshield
Cartridge Tubing		Bio-Rad	1652412
Scintillation vials	20ml, 500/case	VWR international	66021-668
Dessication pellets	”Dricap”	MTI (800-445-9890)
Water bath sonicator	model 50T	VWR international
Cartridge holder	pack of 5	Bio-Rad	1652426
Barrel liner	pack of 5	Bio-Rad	1652417
Diffuser screen	pack of 5	Bio-Rad	1652475
O-ring	75 Viton, Size 007, Qty, 100	McMaster-Carr
Screen (mesh)		McMaster-Carr	144258
PVP	20mg/ml in EtOH	Bio-Rad		Comes with tubing from biorad
Tubing prep station		Bio-Rad	1652418
Tubing cutter		Bio-Rad	1652422
Helios Gene-Gun		Bio-Rad	1652411
Gene gun hose		Bio-Rad		Comes with Gene-Gun
Spermidine	5g	Sigma-Aldrich	s-0266
Although we have listed all the products seperately, it is more economical to purchase "Helios Gene-Gun System", which includes with all the products from Bio-Rad listed above (cat # 165-2431).