我々は、DNAコートした金の弾丸の製造方法を説明し、biolistically培養海馬スライスの神経細胞をトランスフェクトするためにそのような弾丸の使用方法を示しています。
微粒子銃トランスフェクションは、高速のDNA被覆粒子と組織を照射して細胞をトランスフェクトの物理的な手段です。我々はDNAコーティングされた弾丸の初期準備から遺伝子銃を用いて器官切片培養の最後の撮影に、ラット海馬スライスの微粒子銃トランスフェクションのための詳細なプロトコルを提供しています。遺伝子銃のトランスフェクションは、神経細胞をトランスフェクトの効率的かつ容易な手段であると蛍光組織切片中の細胞の小さなサブセットを標識するために特に便利です。このビデオでは、まず、DNAで被覆金粒子に必要なステップを概説。我々は、次のゴールド/ DNA銃弾のプラスチックチューブの内側を並べる方法を示し、および遺伝子銃にロードするためのプラスチック製のカートリッジを取得するために、このチューブをカットする方法。最後に、我々は、遺伝子銃をヘリオス、そして健康的で最適にトランスフェクトされた組織切片を得るためにトラブルシューティングのアドバイスを提供するバイオラッドの処理を示す、ラット海馬スライス培養のバイオリスティックトランスフェクションを実行します。
微粒子銃トランスフェクションは、高速のDNA被覆した金粒子による生体組織の砲撃を経由して細胞をトランスフェクトの物理的な手段です。弾丸が核内に静止する時、粒子による遺伝子導入では、一般的なトランスフェクションされた細胞になる。多くの異なるトランスフェクション法が存在するが、そのようなマイクロインジェクション、リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーションおよびウイルス性トランスフェクションとして、バイオリスティックトランスフェクションは簡単にこれらの他の方法を用いてトランスフェクトしていない細胞をトランスフェクトするための集中的な少ない労働力、および効率的な代替手段を提供することができます。細胞壁の存在は、既存の方法1を使用してトランスフェクションが困難になるので、実際には、まず、植物に遺伝子導入する技術として開発されました。有糸分裂後のニューロンは2,3をトランスフェクションが難しいことで知られていますので、同様に、biolisticsは神経生物学の分野で人気を博している。特に、それは広く無傷の脳スライス内の単一ニューロンの微細な形態を評価することを目的とした実験に使用される原理の手法として認識されます。方法は、遺伝子銃保有の手を(; Bio – Rad社ヘリオス遺伝子銃システム)を使用して培養脳スライスの微粒子銃トランスフェクションを実行する方法の詳細かつ包括的な説明を提供するここで説明する。
それは脳スライス中の細胞の疎な数のトランスフェクションを可能にするため微粒子銃トランスフェクションは、スライス培養で神経細胞をトランスフェクションするための好ましい方法となっています。この方法では、個々の神経細胞は単独で調べることができます。この技術は特によく脳スライスの神経細胞のトランスフェクションに適しているため、それはしばしば、2光子顕微鏡と組み合わせて使用されている、2光子励起以来、光散乱の組織4内の深い蛍光標識細胞の可視化を可能にします。確かにこの映像を通して紹介単錐体細胞の高倍率の画像は、カスタム構築された2光子レーザー走査顕微鏡を用いて捕獲された。結論微粒子銃トランスフェクションでは周囲の細胞の高密度のコンテキスト内で個々の細胞にトランスフェクションの効率的な手段であり、そのように蛍光神経スライス培養で個々のニューロンを標識するための非常に役立っています。
我々はこのビデオで紹介する全体海馬スライスの低倍率の画像を取得するとヘルプはマークルーカニックとHwai -ジョンチェンに感謝したいと思います。我々はまた、ビデオを伴うテキストと支援のためにサラパリッシュに感謝します。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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1.6um gold particles (microcarrier) | 0.25g | Bio-Rad | 1652264 | |
1M CaCl2 | Fluka | 21115 | ||
100% EtOH | 1pint | Gold shield | ||
Cartridge Tubing | Bio-Rad | 1652412 | ||
Scintillation vials | 20ml, 500/case | VWR | 66021-668 | |
Dessication pellets | “Dricap” | MTI (800-445-9890) | ||
Water bath sonicator | model 50T | VWR | ||
Cartridge holder | pack of 5 | Bio-Rad | 1652426 | |
Barrel liner | pack of 5 | Bio-Rad | 1652417 | |
Diffuser screen | pack of 5 | Bio-Rad | 1652475 | |
O-ring | 75 Viton, Size 007, Qty, 100 | McMaster-Carr | ||
Screen (mesh) | McMaster-Carr | 144258 | ||
PVP | 20mg/ml in EtOH | Bio-Rad | Comes with tubing from biorad | |
Tubing prep station | Bio-Rad | 1652418 | ||
Tubing cutter | Bio-Rad | 1652422 | ||
Helios Gene-Gun | Bio-Rad | 1652411 | ||
Gene gun hose | Bio-Rad | Comes with Gene-Gun | ||
Spermidine | 5g | Sigma | s-0266 |