Summary
Kortikale Durchblutung Dynamik kann in vivo durch bildgebende fluoreszierenden Dextran Farbstoffe in die Schwanzvene von Nagetieren, die mit 2-Photonen-Mikroskopie injiziert untersucht werden. Dieses Video zeigt, wie man Bild Blutfluss Dynamik in Neokortex der Maus über einen mit Glas überdachten kranialen Fenster Vorbereitung.
Abstract
Die Fähigkeit zur Abbildung der zerebralen Gefäße (von großen Schiffen auf Kapillaren) und Aufzeichnung des Blutflusses Dynamik im intakten Gehirn von lebenden Nagern ist eine leistungsstarke Technik. Mit In-vivo-2-Photonen-Mikroskopie durch ein Schädel-Fenster ist es möglich, Bild fluoreszierende Farbstoffe intravenös injiziert. Dies erlaubt es, Bild der kortikalen Gefäße und auch Messungen des Blutflusses erhalten. Diese Technik wurde ursprünglich von David Kleinfeld und Winfried Denk entwickelt. Die Methode kann verwendet werden, um den Blutfluss Dynamik während oder nach der zerebralen Ischämie zu studieren, in neurodegenerativen Erkrankungen, bei Hirntumoren oder in normale Physiologie des Gehirns. Zum Beispiel wurde verwendet, um zu untersuchen, wie Schlaganfall verursacht Veränderungen in den Blutfluss Richtung und Veränderungen in der roten Blutkörperchen Geschwindigkeit oder Fluss in und rund um den Infarkt. Hier zeigen wir, wie 2-Photonen-Mikroskopie zum Bild des Blutflusses Dynamik den Einsatz in der Großhirnrinde von Mäusen mit fluoreszierenden Farbstoffen in die Schwanzvene injiziert.
Protocol
Schwanzvene Injektionen von fluoreszierenden Farbstoffen Dextrane
- Um Bild zerebrale Gefäßsystem, müssen die Tiere intravenös mit einem fluoreszierenden Farbstoff injiziert werden. Wir verwenden Dextran-konjugierten Farbstoffe, weil die Dextran-Einheit verhindert der Farbstoff vor der Kreuzung das Gehirn Blut-Schranke und ein Auslaufen der Blutgefäße.
- Mäuse sind mit Isofluran (4% für die Induktion, 1.5-2% während der Injektion).
- Der Schwanz ist mit 70% Alkohol desinfiziert.
- Mit einer 26-Gauge-Nadel, ist 75-100 ul einer 5% v / v Lösung von Rhodamin Dextran in Kochsalzlösung gelöst durch die Schwanzvene, auf halbem Weg entlang der Welle des Schwanzes injiziert.
- Die Tiere können sofort nach der Schwanzvene Injektion abgebildet werden, bis der Farbstoff im Urin, was wiederum rosa wird, wenn mit einem Rhodamin-Farbstoffs in ca. 2 Stunden ausgeschieden wird.
Imaging des Blutflusses mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie (Gesamtdauer 30-60 min pro Sitzung, abhängig von der Zahl der Schiffe abgebildet)
- Nach dem fluoreszierenden Farbstoff Dextran Injektion wird die Maus mit Isofluran (4% für die Induktion, 1-1,5% für die Bildgebung).
- Die Maus ist fest verbunden mit dem Titan-bar an das Mikroskop Bühne, die eine thermo-regulierten Heizkissen, damit die Tier warm enthält. Einige Augensalbe angewendet wird, damit die Augen feucht.
- Das Deckglas der Schädelbasis Fenster ist mit 70% igem Alkohol gereinigt.
- Das Fenster ist parallel zur Bildebene positioniert und zentriert auf dem Gebiet der Blick unter die 4X Ziel.
- Am besten ist es, ein Foto von der Hirnoberfläche Schiffe mit einer digitalen Kamera aufnehmen. Dieses Bild wird als Bild der Referenz in folgenden Imaging-Sitzungen, um das abgebildete Region immer wieder zu finden von Tag zu Tag verwendet werden.
- Die 4X Ziel ist es, mit dem Eintauchen in Wasser 40X-Objektiv ohne Verschieben der Bühne ersetzt. Ein digitales Bild des Sichtfeldes wird wieder aufgenommen. Die Koordinaten auf der Bühne Manipulator sind auf Null gesetzt.
- Wir verwenden scanimage die Bildaufnahme-Software. Dies wurde in MatLab von Tom Pologruto und Bernardo Sabatini im Labor von Karel Svoboda (Pologruto et al., 2003) geschrieben. Laser, Leistungsmesser, der Photomultiplier Röhren, Verstärker, etc.: Wir als nächstes auf alle anderen Geräte wieder
- Der Bereich des Fensters geeignet, die abgebildet werden soll, kurz bei geringer Vergrößerung gescannt, um die besten Regionen zu finden. Sobald diese identifiziert sind, eine geringe Vergrößerung Stapel von der gewählten Region um Bild aufgenommen wird, und dessen XY-Koordinaten sind annotiert.
- Zur Aufzeichnung des Blutflusses Dynamik in kleinen Gefäßen oder Kapillaren verwenden wir Linien-Scans entlang mindestens 40 mu m des Schiffes von Interesse. Diese einzelnen "Sweeps" dauerhafte 1 Sekunde erfolgen mit so wenig Laserleistung wie möglich und die Koordinaten und Winkel des Scannens werden aufgeschrieben.
- Sobald die Bildgebung Sitzung vorbei ist, ist das Tier in einen warmen Raum, in dem sie aus der Narkose erholen können verschoben.
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Discussion
Kortikale Durchblutung Dynamik kann in vivo durch bildgebende fluoreszierenden Dextran Farbstoffe in die Schwanzvene von Nagetieren, die mit Zwei-Photonen-Mikroskopie injiziert untersucht werden. Dieses Video zeigte eine Methode, wie Bild Blutfluss Dynamik in Neokortex der Maus über einen mit Glas überdachten kranialen Fenster Vorbereitung.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescein isothio-cyanate-dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | FD500S | mol wt 500,000 |
| Rhodamine B isothio-cyanate-dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | R9379 | mol wt ~70,000 |
References
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Nat Acad Sci. 95, 15741-15746 (1998).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 17, 2-13 (2003).
- Zhang, S., Murphy, T. H. Imaging the impact of cortical microcirculation on synaptic structure and sensory-evoked hemodynamic responses in vivo. 5, (2007).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Nat Acad Sci. 104, 365-370 (2007).
