Summary
Corticale doorbloeding dynamiek kan worden bestudeerd in vivo door beeldvorming fluorescente kleurstoffen dextran geïnjecteerd in de staartader van knaagdieren met twee-foton microscopie. Deze video laat zien hoe u foto doorbloeding dynamiek in neocortex van muizen door middel van een met glas overdekt craniale venster voorbereiding.
Abstract
De mogelijkheid om het imago van de cerebrale vaatstelsel (van grote schepen naar capillairen) en neem de bloedstroom dynamiek in de intacte hersenen van levende knaagdieren is een krachtige techniek. Met behulp van in vivo twee-foton microscopie door middel van een craniale raam is het mogelijk om de afbeelding fluorescente kleurstoffen intraveneus geïnjecteerd. Dit laat een om het imago van de corticale vaatstelsel en ook te verkrijgen metingen van de bloedstroom. Deze techniek werd oorspronkelijk ontwikkeld door David Kleinfeld en Winfried Denk. De methode kan worden gebruikt om de bloedstroom dynamiek studie tijdens of na cerebrale ischemie, in neurodegeneratieve aandoeningen, bij hersentumoren, of in de normale hersenen fysiologie. Zo heeft het gebruikt om te bestuderen hoe een beroerte veroorzaakt verschuivingen in de bloedstroom richting en veranderingen in de rode bloedcellen snelheid of flux in en rond het infarct. Hier laten we zien hoe de twee-foton microscopie gebruikt om de afbeelding bloedstroom dynamiek in de neocortex van levende muizen met behulp van fluorescente kleurstoffen ingespoten in de staartader.
Protocol
Staartader injecties van fluorescerende kleurstoffen dextranen
- Om de afbeelding cerebrale vaatstelsel, moeten de dieren intraveneus geïnjecteerd te worden met een fluorescerende kleurstof. We maken gebruik van dextran-geconjugeerde kleurstoffen, omdat de groep dextraan voorkomt dat de kleurstof van het oversteken van de hersen bloed barrière en uitlekken van de bloedvaten.
- Muizen worden verdoofd met isofluraan (4% voor inductie, 1,5-2% tijdens de injectie).
- Staart is gedesinfecteerd met alcohol 70%.
- Met een 26 gauge naald, is 75 tot 100 ul van een 5% v / v oplossing van rhodamine dextran opgelost in een zoutoplossing ingespoten via de staartader, halverwege langs de schacht van de staart.
- Dieren kunnen worden afgebeeld onmiddellijk na staartader injectie totdat de kleurstof wordt uitgescheiden in de urine, die roze als u een rhodamine kleurstof in ongeveer 2 uur.
Beeldvorming van de doorbloeding met behulp van twee-foton microscopie (totale duur 30-60 minuten per sessie, afhankelijk van het aantal schepen afgebeeld)
- Naar aanleiding van de fluorescente kleurstof dextran injectie, de muis wordt verdoofd met isofluraan (4% voor inductie, 1-1,5% voor imaging).
- Muis is stevig bevestigd met behulp van de titanium balk om de microscoop stadium, dat een thermo-regelbare verwarming pad te houden van het dier warm bevat. Sommige oogzalf wordt toegepast om de ogen vochtig.
- Het deksel glas van de craniale venster wordt gereinigd met 70% alcohol.
- Het venster is evenwijdig aan het brandvlak en in het midden van het gezichtsveld onder de 4X doelstelling.
- Het beste is om een foto van de hersenen oppervlak schepen nemen met een digitale camera. Deze foto zal gebruikt worden als het beeld van de referentie in het volgen van beeldvorming sessies om de belichte gebied herhaaldelijk te vinden vanaf dag tot dag.
- Het 4X doel is vervangen door de onderdompeling in water 40X objectief zonder te bewegen het podium. Een digitale afbeelding van het beeldveld is weer genomen. De coördinaten in het stadium manipulator zijn ingesteld op nul.
- Wij gebruiken scanimage als de afbeelding acquisitie software. Dit werd geschreven in MatLab door Tom Pologruto en Bernardo Sabatini in het laboratorium van Karel Svoboda (Pologruto et al.., 2003). We eerstvolgende afslag op alle andere apparatuur: de laser, de macht meter, de foto multipliers buizen, de versterkers, enz.
- Het gebied van het venster geschikt om te worden afgebeeld wordt kort gescand bij een lage vergroting om de beste regio's te vinden. Zodra deze zijn geïdentificeerd, een lage vergroting stapel van de gekozen regio om opname wordt gemaakt, en de XY coördinaten zijn geannoteerd.
- Voor het opnemen van de bloedstroom dynamiek in kleine vaten of capillairen we gebruik van lijn scans langs ten minste 40 micrometer van het schip van belang. Deze single "sweeps" een looptijd van een seconde worden gedaan met behulp van zo weinig mogelijk stroom voor laser en de coördinaten en de hoek van het scannen zijn opgeschreven.
- Zodra de beeldvorming sessie voorbij is, is het dier overgebracht naar een warme kamer waar het kan herstellen van de narcose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Corticale doorbloeding dynamiek kan worden bestudeerd in vivo door beeldvorming fluorescente kleurstoffen dextran geïnjecteerd in de staartader van knaagdieren met twee-foton microscopie. Deze video toonde een methode voor het afbeelden van de bloedstroom dynamiek in neocortex van muizen door middel van een met glas overdekt craniale venster voorbereiding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescein isothio-cyanate-dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | FD500S | mol wt 500,000 |
| Rhodamine B isothio-cyanate-dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | R9379 | mol wt ~70,000 |
References
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Nat Acad Sci. 95, 15741-15746 (1998).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 17, 2-13 (2003).
- Zhang, S., Murphy, T. H. Imaging the impact of cortical microcirculation on synaptic structure and sensory-evoked hemodynamic responses in vivo. 5, (2007).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Nat Acad Sci. 104, 365-370 (2007).
