Summary
Kortikal kan akımı dinamikleri 2-foton mikroskobu ile kemirgen kuyruk damar içine enjekte görüntüleme floresan dekstran boyalar in vivo olarak incelenebilir. Bu video görüntü kan akışını dinamikleri ile farelerin bir cam kaplı kafatası pencere hazırlama neokorteks nasıl gösterir.
Abstract
Yaşayan kemirgenler bozulmamış beyin beyin damarsal (kılcal büyük damarları) ve kan akışını dinamikleri kaydetmek için resim yeteneği güçlü bir tekniktir. Kafatası bir pencereden in vivo olarak 2 foton mikroskopi kullanılarak damar içine enjekte görüntü floresan boyalar mümkün. Bu kan akışı ölçümleri elde etmek için de görüntü kortikal damarsal bir izin ve. Bu teknik aslında David Kleinfeld ve Winfried Denk tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklar, beyin tümörleri, ya da normal beyin fizyolojisi, serebral iskemi sırasında veya sonrasında kan akış dinamiklerini incelemek için kullanılabilir. Örneğin, kırmızı kan hücre hız veya akı infarkt ve çevresinde ne kadar inme nedenleri kan akış yönü vardiya ve değişiklikleri incelemek için kullanılır olmuştur. Burada kuyruk damar içine enjekte floresan boyalar kullanarak yaşayan farelerin neokorteks görüntü kan akışını dinamikleri 2-foton mikroskopi nasıl kullanılacağını göstermektedir.
Protocol
Kuyruk ven enjeksiyonları floresan dextrans boyalar
- Görüntü serebral vasküler amacıyla, hayvanların bir floresan boya ile intravenöz olarak enjekte edilmelidir. Dekstran benzer parçaları beyin kan bariyerini geçen ve kan damarlarının dışarı sızdıran boya engeller çünkü dekstran-konjuge boyaları kullanabilirsiniz.
- Fareler izofluran (% 4, indüksiyon için enjeksiyon sırasında% 1.5-2) ile anestezi.
- Kuyruk% 70 alkol ile dezenfekte edilir.
- 26 gauge iğne ile, 75-100 ul, tuzlu su içinde çözünmüş rodamin dekstran% 5 v / v çözümü, kuyruk mili boyunca kuyruk ven yarıda ile enjekte edilir.
- Boya, yaklaşık 2 saat içinde rodamin boya kullanılarak, pembe dönecek idrar atılır kadar hayvanların hemen kuyruk ven enjeksiyondan sonra görüntülü olabilir.
Iki foton mikroskopi kullanılarak kan akışı Görüntüleme (görüntülü damarların sayısına bağlı olarak toplam süresi 30-60 dakika, seans başına)
- Floresan dekstran boya enjeksiyonu takiben, fare (indüksiyon için% 4,% 1-1.5 görüntüleme) izofluran anestezisi.
- Fare sıkıca hayvan sıcak tutmak için bir termo-ayarlı ısıtma yastığı içeren mikroskop sahne, titanyum çubuğunu kullanarak eklenir. Bazı göz merhemi, gözleri nemli tutmak için uygulanır.
- Kraniyal pencere cam kapak,% 70 alkol ile temizlenir.
- Pencere odak düzlemli paralel olarak konumlandırılmış ve 4X objektif altında görüş alanı merkezli.
- Beyin yüzey damarlarının dijital bir kamera ile bir fotoğraf çekmek için en iyisidir. Bu resim görüntüleme oturumları her geçen gün art arda görüntülü bölgeyi bulmak için aşağıdaki referans görüntü olarak kullanılır.
- 4X objektif sahne hareket ettirmeden suya daldırma 40X hedefi ile değiştirilir. Görüş alanında dijital resim tekrar alınır. Sahne manipülatör koordinatları sıfır ayarlanır.
- Biz görüntü elde etme yazılımı olarak ScanImage kullanın. Bu laboratuvar Karel Svoboda (Pologruto ve ark, 2003) Tom Pologruto ve Bernardo Sabatini tarafından MatLab yazılmıştır. Lazer, güç ölçer, fotoğraf çarpanları tüpler, yükselteçler, vb: Önümüzdeki tüm diğer ekipman açmak
- Yansıması uygun pencere alanı kısa bir süre için en iyi bölgeyi bulmak için, düşük büyütmede taranır. Bir kere bu, düşük bir büyütme yığını görüntünün çekildiği için seçilen bölgenin tespit ve onun XY koordinatlarını açıklamalı.
- Küçük damarlar ve kılcal kan akış dinamikleri kaydetmek için ilgi geminin en az 40 mikron hat boyunca taraması kullanın. Bu tek bir "tarama" kalıcı bir saniye, mümkün olduğunca az lazer güç ve tarama koordinatları ve açı yazılı olarak kullanarak yapılır.
- Görüntüleme oturumu bittikten sonra, hayvanın anestezi kurtarmak sıcak bir odaya taşınır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kortikal kan akımı dinamikleri görüntüleme floresan dekstran boyalar iki foton mikroskobu ile kemirgen kuyruk damar içine enjekte in vivo olarak incelenebilir. Bu video görüntü kan akışını dinamikleri ile farelerin bir cam kaplı kafatası pencere hazırlama neokorteks nasıl bir yöntem gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescein isothio-cyanate-dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | FD500S | mol wt 500,000 |
| Rhodamine B isothio-cyanate-dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | R9379 | mol wt ~70,000 |
References
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Nat Acad Sci. 95, 15741-15746 (1998).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 17, 2-13 (2003).
- Zhang, S., Murphy, T. H. Imaging the impact of cortical microcirculation on synaptic structure and sensory-evoked hemodynamic responses in vivo. 5, (2007).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Nat Acad Sci. 104, 365-370 (2007).
