Summary
प्रोटीन अलग actin बाध्यकारी मॉड्यूल के माध्यम से filamentous actin (एफ actin) करने के लिए बाध्य. इस वीडियो में हम actin की प्रक्रिया सह अवसादन है, जो इन विट्रो परख में एक नियमित रूप से प्रोटीन या विशिष्ट डोमेन है कि एफ actin बाँध का विश्लेषण किया जाता है प्रदर्शित करता है.
Abstract
सेल के भीतर actin cytoskeleton actin filaments के एक नेटवर्क है कि कोशिकाओं और सेलुलर प्रक्रियाओं के आंदोलन की अनुमति देता है है, और है कि तनाव उत्पन्न करता है और मदद करता है सेलुलर आकार रखता है. हालांकि actin cytoskeleton एक कठोर संरचना है, यह एक गतिशील संरचना है कि लगातार remodeling है. प्रोटीन का एक संख्या actin cytoskeleton करने के लिए बाध्य कर सकते हैं. एफ actin के लिए एक विशेष प्रोटीन के बंधन अक्सर सेल जैविक टिप्पणियों का समर्थन या आगे actin cytoskeleton की remodeling के कारण गतिशील प्रक्रियाओं को समझने के लिए वांछित है. actin परख सह - अवसादन इन विट्रो परख में एक नियमित रूप से एफ actin के साथ विशिष्ट प्रोटीन या प्रोटीन डोमेन के बंधन का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. परख के बुनियादी सिद्धांतों के हित के प्रोटीन का एक ऊष्मायन (पूर्ण लंबाई या डोमेन) एफ actin के साथ, गोली और प्रोटीन एफ actin के साथ सह - sedimenting के एफ actin के विश्लेषण के लिए ultracentrifugation कदम शामिल है. Actin सह अवसादन assays के अनुसार बनाया जा सकता है actin बाध्यकारी समानताएं और प्रतियोगिता assays के उपाय.
Protocol
1. Actin की तैयारी
इस परख में इस्तेमाल किया actin के स्रोत गैर मांसपेशी मानव (β-actin) प्लेटलेट्स cytoskeleton इंक स्टॉक aliquots 10 मिलीग्राम / एमएल -70 º सी फ्रीजर में रखा जाता है से प्राप्त किया गया था. परख के लिए, actin 0.4 मिलीग्राम / एक बफर में 5 मिमी Tris 8 पीएच, 0.2 मिमी 2 CaCl, 0.2 मिमी एटीपी और 0.5 मिमी डीटीटी, 4 º सी. पर 10 मिनट के लिए 20,000 ग्राम पर centrifuged युक्त मिलीलीटर पतला है सतह पर तैरनेवाला है, जो monomeric actin polymerized बनने के लिए तैयार है. Actin polymerization के अलावा 50 मिमी KCl, 1 मिमी एटीपी और 2 मिमी 2 MgCl से प्रेरित है. polymerization के 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर होता है.
2. प्रोटीन की तैयारी
इस परख में, हम Talin, है जो एक प्रोटीन जीएसटी टैग के रूप में शुद्ध है की सी टर्मिनस उपयोग कर रहे हैं. परख में इस्तेमाल किया जा प्रोटीन समुच्चय के पूर्व स्पष्ट करने के लिए एक उच्च गति centrifugation के अधीन है एफ actin के साथ ऊष्मायन से पहले.
प्रोटीन एक Beckman ultracentrifuge में 100,000 जी पर 20 मिनट के लिए 22 º सी. पर घूमती है
3. Actin-प्रोटीन ऊष्मायन
और परख में actin और प्रोटीन की मात्रा अलग अलग होंगे. इस उदाहरण में हम अधिक में actin का उपयोग कर रहे हैं. आम तौर पर, एक दाढ़ अनुपात की गणना है, जैसे. 04:01 actin की दाढ़ प्रोटीन के अनुपात.
निम्नलिखित परख में, अंतिम प्रतिक्रिया की मात्रा 150 μl है. बफर में जो प्रोटीन और एफ actin incubated रहे हैं परीक्षण किया जा प्रोटीन और आवश्यक शर्तों पर निर्भर करेगा. इस उदाहरण में, हम एक 10 मिमी Tris 7.0 पीएच, 1 मिमी एटीपी, 0.2 मिमी डीटीटी, 1 मिमी EGTA, 0.1 मिमी CaCl 2 और 2 मिमी 2 MgCl युक्त बफर का उपयोग करें. प्रोटीन और एफ actin के कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए बफर में incubated हैं.
4. एफ actin के अवसादन
ऊष्मायन के बाद, नमूने 100.000 ग्राम पर 22 º सी. पर घूमती हैं हम वीडियो में एक Beckman ultracentrifuge का उपयोग करें. रोटर सावधानी से निकाल दिया जाता है के रूप में परेशान करने के लिए नहीं छर्रों.
5. एफ actin के साथ सह अवसादन प्रोटीन के विश्लेषण
supernatants एक Eppendorf ट्यूब और 5 एक्स Laemmli नमूना एसडीएस पृष्ठ बफर में pipetting द्वारा ध्यान हटा रहे हैं जोड़ा है. 1 एक्स Laemmli नमूना एसडीएस पृष्ठ बफर के एक उचित मात्रा शेष छर्रों को जोड़ा है, ऊपर pipetted और नीचे, और नए Eppendorf ट्यूबों को हस्तांतरित. छर्रों और supernatants में प्रोटीन के रिश्तेदार मात्रा में एसडीएस पृष्ठ और Coomassie जेल या सोख्ता पश्चिमी ब्लू धुंधला द्वारा उनकी जुदाई के बाद विश्लेषण कर रहे हैं.
एकाग्रता पर निर्भर सह sedimentations actin कर सकते हैं आदेश में actin के साथ प्रोटीन बातचीत की विशिष्टता का निर्धारण करने के लिए, प्रदर्शन किया. प्रयोग, प्रोटीन के एक निश्चित राशि और actin की बढ़ती मात्रा की एक श्रृंखला के इस तरह incubated हैं, और विश्लेषण किया जाता है ऊपर वर्णित के रूप में है.
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Discussion
सह - अवसादन actin इन विट्रो परख में एक सरल specfic एफ actin बंधनकारी प्रोटीन का विश्लेषण है. इस वीडियो में, हम कैसे एक साधारण सह अवसादन actin के बाहर किया जा सकता है एक उदाहरण प्रदर्शित करता है. हम बताते हैं कि कैसे एफ actin तैयार करने के लिए परीक्षण किया जा प्रोटीन और सह अवसादन actin की प्रक्रिया तैयार करते हैं. अंकों की संख्या जब बाहर actin सह अवसादन assays ले माना जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, ऊष्मायन के लिए बफर घटकों का परीक्षण करने के लिए और पीएच, तापमान, और नमक एकाग्रता एफ actin बाध्य प्रभावित कर सकता है प्रोटीन के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. हम एफ actin एक साधारण बाइंडिंग, लेकिन परख के इस प्रकार पर सविस्तार जा सकता है और एफ actin एक प्रोटीन या प्रोटीन डोमेन के बंधन विशिष्टता का निर्धारण किया दिखा दिया है.
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Acknowledgments
आप HaCAT कोशिकाओं में actin की फिल्म के लिए UCSF में Wittman प्रयोगशाला में डा. प्रवीण कुमार के लिए धन्यवाद.
References
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