Summary
Proteínas se unen a la actina filamentosa (F-actina) a través de módulos de unión de actina distintas. En este video se demuestra el procedimiento de la actina co-sedimentación, que es un ensayo in vitro utilizan habitualmente para analizar las proteínas o dominios específicos que se unen a la F-actina.
Abstract
El citoesqueleto de actina en la célula es una red de filamentos de actina que permite el movimiento de las células y los procesos celulares, y que genera tensión y ayuda a mantener la forma celular. Aunque el citoesqueleto de actina es una estructura rígida, es una estructura dinámica que está en constante remodelación. Una serie de proteínas se puede unir al citoesqueleto de actina. La unión de una proteína en particular a la F-actina se desea a menudo para apoyar la célula observaciones biológicas o para comprender mejor los procesos dinámicos debido a la remodelación del citoesqueleto de actina. La actina co-sedimentación ensayo es un ensayo in vitro utilizan habitualmente para analizar la unión de proteínas específicas o dominios de la proteína con la F-actina. Los principios básicos de la prueba implica un período de incubación de la proteína de interés (de larga duración o el dominio de), con F-actina, paso ultracentrifugación para precipitar la F-actina y el análisis de la proteína co-sedimentación con F-actina. Actina sedimentación co-ensayos pueden ser diseñados para medir la afinidad de unión de actina y en los ensayos de la competencia.
Protocol
1. Preparación de la actina
La fuente de la actina utilizada en este ensayo no era muscular plaquetas humanas (β-actina) obtenidos a partir del citoesqueleto Inc. alícuotas de archivo de 10 mg / ml se mantienen en el congelador -70 º C. Para el ensayo, la actina se diluye a 0,4 mg / ml en un tampón que contenía 5 mM Tris pH 8, 0,2 mM CaCl 2, 0,2 mM ATP y 0,5 mM de TDT, se centrifuga a 20.000 g durante 10 minutos a 4 º C. El sobrenadante, que es la actina monomérica está listo para ser polimerizado. Polimerización de la actina es inducida por la adición de KCl 50 mM, 1 mM ATP y 2 mM de MgCl 2. La polimerización se produce a temperatura ambiente durante 1 hora.
2. Preparación de la proteína
En este ensayo, se utiliza el C-terminal de Tallin, que se ha purificado como una proteína GST-etiquetados. La proteína que se utiliza en el ensayo se somete a una centrifugación de alta velocidad para pre-clara de los agregados antes de la incubación con F-actina.
La proteína se hace girar a 100.000 g en una ultracentrífuga Beckman durante 20 minutos a 22 º C.
3. Actina-proteína de incubación
La cantidad de actina y las proteínas en un ensayo puede variar. En este ejemplo estamos utilizando actina en exceso. Normalmente, una relación molar se calcula, por ejemplo. una relación de 4:1 molar de actina a la proteína.
En el siguiente ensayo, el volumen final de reacción es de 150 l. Búfer en el que se incuban las proteínas y F-actina dependerá de la proteína a ser probado y en las condiciones requeridas. En este ejemplo, se utiliza un tampón que contiene 10 mM Tris pH 7,0, 1 mM ATP, 0,2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl 2 y 2 mM de MgCl 2. La proteína y el F-actina se incuban en el buffer durante 1 hora a temperatura ambiente.
4. La sedimentación de la F-actina
Después de la incubación, las muestras se centrifugaron a 100.000 g a 22 º C. Utilizamos una ultracentrífuga Beckman en el video. El rotor se retira cuidadosamente para no molestar a los pellets.
5. El análisis de proteínas co-sedimentación con F-actina
Los sobrenadantes se retira cuidadosamente con la pipeta en un tubo eppendorf y 5 X Laemmli SDS-PAGE muestra de amortiguación, se añade. Un volumen adecuado de 1 x tampón de muestra Laemmli SDS-PAGE se añade al resto de pellets, una pipeta de arriba a abajo, y trasladado a nuevos tubos eppendorf. Las cantidades relativas de proteína en los sedimentos y sobrenadantes son analizados después de su separación por SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie del gel o Western Blot.
Con el fin de determinar la especificidad de la interacción con la proteína actina, la actina dependiente de la concentración de co-sedimentación se puede realizar. Para este tipo de experimento, una cantidad fija de la proteína y una serie de cantidades cada vez mayores de la actina se incuban, y el análisis se lleva a cabo como se describió anteriormente.
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Discussion
Actina co-sedimentación es un simple ensayo in vitro para analizar las proteínas de unión a specfic F-actina. En este vídeo, que muestran un ejemplo de cómo un sencillo actina co-sedimentación puede llevarse a cabo. Se muestra cómo preparar la F-actina, preparar la proteína a ser probado y el procedimiento de la actina co-sedimentación. Una serie de puntos deben ser considerados en el ejercicio de actina sedimentación co-ensayos. Por ejemplo, los componentes del tampón de incubación puede variar en función de la proteína a ser probado y el pH, la temperatura y la concentración de sal puede afectar la unión de F-actina. Hemos demostrado un enlace simple de F-actina, sin embargo este tipo de ensayo puede ser elaborado y utilizado para determinar la especificidad de unión de un dominio de la proteína y proteína para la F-actina.
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Acknowledgments
Gracias al Dr. Praveen Kumar en el laboratorio de Wittman en la UCSF para la película de la actina en células HaCaT.
References
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