Summary
Proteine binden an filamentösen Aktin (F-Aktin) durch verschiedene Aktin-bindende Module. In diesem Video zeigen wir das Verfahren von Aktin co-Sedimentation, die eine in vitro-Assay routinemäßig verwendet, um Proteine oder bestimmte Domänen, die F-Aktin binden zu analysieren.
Abstract
Das Aktin-Zytoskelett in der Zelle ist ein Netzwerk von Aktin-Filamenten, die die Bewegung von Zellen und zelluläre Prozesse ermöglicht, und das erzeugt Spannung und hilft unterhält zelluläre Form. Obwohl das Aktin-Zytoskelett ist eine starre Struktur, es ist eine dynamische Struktur, die ständig Umbau ist. Eine Reihe von Proteinen, um das Aktin-Zytoskelett zu binden. Die Bindung eines bestimmten Proteins zu F-Aktin ist oft erwünscht, zellbiologische Beobachtungen stützen oder besser zu verstehen dynamische Prozesse wegen Umbau des Aktin-Zytoskeletts. Die Aktin-Co-Sedimentation Assay ist ein in-vitro-Test routinemäßig verwendet, um die Bindung spezifischer Proteine oder Proteindomänen mit F-Aktin zu analysieren. Die grundlegenden Prinzipien des Tests beinhalten eine Inkubation des Proteins von Interesse (in voller Länge oder Domäne) mit F-Aktin, Ultrazentrifugationsschritt zu Pellets F-Aktin und Analyse des Proteins co-sedimentiert mit F-Aktin. Aktin co-Sedimentation Assays können entsprechend ausgelegt sein, um Aktin Bindungsaffinitäten und im Wettbewerb Assays messen.
Protocol
1. Vorbereitung von Aktin
Die Quelle von Aktin in diesem Test verwendet wurde non-muscle menschlichen Blutplättchen (β-Aktin) von Zytoskelett Inc. Stock Aliquots bei 10 mg / ml in der -70 ° C Gefrierschrank aufbewahrt erhalten. Für den Test wird die Aktin bis 0,4 mg / ml in einem Puffer, enthaltend 5 mM Tris pH 8, 0,2 mM CaCl 2, 0,2 mM ATP und 0,5 mM DTT, bei 20.000 g für 10 Minuten zentrifugiert bei 4 º C verdünnt Der Überstand, der monomeren Aktin ist bereit, polymerisiert werden. Aktin-Polymerisation wird durch Zugabe 50 mM KCl, 1 mM ATP und 2 mM MgCl 2 induziert. Die Polymerisation erfolgt bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
2. Zubereitung von Protein-
In diesem Test werden wir die Verwendung des C-Terminus von Talin, die als GST-markierte Protein wurde gereinigt. Das Protein im Assay verwendet werden soll, um eine Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation vor, frei von Aggregaten vor der Inkubation mit F-Aktin unterzogen.
Das Protein wird bei 100.000 g in einer Beckman-Ultrazentrifuge für 20 min bei 22 º C gesponnen
3. Aktin-Protein-Inkubation
Der Betrag von Aktin und Protein in einem Test variieren. In diesem Beispiel verwenden wir Aktin im Übermaß. Normalerweise wird ein Molverhältnis berechnet, zB. einem 4:1 Molverhältnis von Aktin an Protein.
In den folgenden Assay wird die Endreaktionsvolumen 150 pl. Der Puffer, in dem die Protein-und F-Aktin inkubiert wird das Protein getestet werden und auf die notwendigen Voraussetzungen abhängig. In diesem Beispiel verwenden wir einen Puffer mit 10 mM Tris pH 7,0, 1 mM ATP, 0,2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl 2 und 2 mM MgCl 2. Die Protein-und F-Aktin sind in den Puffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
4. Sedimentation von F-Aktin
Nach der Inkubation werden die Proben bei 100.000 g bei 22 º C gesponnen Wir verwenden einen Beckman Ultrazentrifuge in dem Video. Der Rotor ist vorsichtig, um nicht auf die Pellets stören entfernt.
5. Analyse von Protein-Co-Sedimentation mit F-Aktin
Die Überstände werden sorgfältig durch Pipettieren in ein Eppendorf-Röhrchen und 5 X Laemmli SDS-PAGE-Probenpuffer entfernt wird aufgenommen. Eine entsprechende Volumen von 1 X Laemmli SDS-PAGE-Probenpuffer ist es, die Pellets noch hinzu, pipettiert rauf und runter, und in neue Eppendorf-Röhrchen. Die relativen Mengen an Protein in den Pellets und Überstände werden nach ihrer Trennung durch SDS-PAGE und Coomassie-Blau-Färbung des Gels oder Western-Blot analysiert.
Um die Spezifität der Protein-Interaktion mit Aktin zu bestimmen, Aktin abhängig von ihrer Konzentration co-Ablagerungen durchgeführt werden kann. Für diese Art von Experiment, eine feste Menge des Proteins und eine Reihe von steigenden Mengen an Aktin inkubiert, und die Analyse erfolgt wie oben beschrieben durchgeführt.
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Discussion
Aktin co-Sedimentation ist ein einfaches in vitro-Assay zur specfic Proteine die Bindung an F-Aktin zu analysieren. In diesem Video zeigen wir ein Beispiel, wie eine einfache Aktin co-Sedimentation durchgeführt werden kann. Wir zeigen, wie F-Aktin vorbereiten, bereiten das Protein getestet werden und das Verfahren von Aktin co-Sedimentation. Eine Reihe von Punkten zu beachten bei der Durchführung von Aktin-Co-Sedimentation Assays werden. Zum Beispiel kann der Puffer-Komponenten für die Inkubation je nach Protein getestet und pH-Wert, Temperatur und Salzkonzentration kann die Bindung an F-Aktin beeinflussen. Wir haben eine einfache Bindung an F-Aktin, aber diese Art von Test kann ausgearbeitet werden und verwendet werden, um verbindliche Spezifität einer Protein-oder Protein-Domäne zu F-Aktin bestimmen demonstriert.
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Acknowledgments
Wir danken Ihnen, Dr. Praveen Kumar in der Wittman Labor am UCSF für den Film von Aktin in HaCaT-Zellen.
References
- Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin. Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).
- Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength. Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).
- Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain. J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).
