Proteine binden an filamentösen Aktin (F-Aktin) durch verschiedene Aktin-bindende Module. In diesem Video zeigen wir das Verfahren von Aktin co-Sedimentation, die eine in vitro-Assay routinemäßig verwendet, um Proteine oder bestimmte Domänen, die F-Aktin binden zu analysieren.
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Methodenartikel
Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Aktin-Zytoskelett in der Zelle ist ein Netzwerk von Aktin-Filamenten, die die Bewegung von Zellen und zelluläre Prozesse ermöglicht, und das erzeugt Spannung und hilft unterhält zelluläre Form. Obwohl das Aktin-Zytoskelett ist eine starre Struktur, es ist eine dynamische Struktur, die ständig Umbau ist. Eine Reihe von Proteinen, um das Aktin-Zytoskelett zu binden. Die Bindung eines bestimmten Proteins zu F-Aktin ist oft erwünscht, zellbiologische Beobachtungen stützen oder besser zu verstehen dynamische Prozesse wegen Umbau des Aktin-Zytoskeletts. Die Aktin-Co-Sedimentation Assay ist ein in-vitro-Test routinemäßig verwendet, um die Bindung spezifischer Proteine oder Proteindomänen mit F-Aktin zu analysieren. Die grundlegenden Prinzipien des Tests beinhalten eine Inkubation des Proteins von Interesse (in voller Länge oder Domäne) mit F-Aktin, Ultrazentrifugationsschritt zu Pellets F-Aktin und Analyse des Proteins co-sedimentiert mit F-Aktin. Aktin co-Sedimentation Assays können entsprechend ausgelegt sein, um Aktin Bindungsaffinitäten und im Wettbewerb Assays messen.
Protokoll
1. Vorbereitung von Aktin
Die Quelle von Aktin in diesem Test verwendet wurde non-muscle menschlichen Blutplättchen (β-Aktin) von Zytoskelett Inc. Stock Aliquots bei 10 mg / ml in der -70 ° C Gefrierschrank aufbewahrt erhalten. Für den Test wird die Aktin bis 0,4 mg / ml in einem Puffer, enthaltend 5 mM Tris pH 8, 0,2 mM CaCl 2, 0,2 mM ATP und 0,5 mM DTT, bei 20.000 g für 10 Minuten zentrifugiert bei 4 º C verdünnt Der Überstand, der monomeren Aktin ist bereit, polymerisiert werden. Aktin-Polymerisation wird durch Zugabe 50 mM KCl, 1 mM ATP und 2 mM MgCl 2 induziert. Die Polymerisation erfolgt bei Raumtemperatur für 1 S....
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Diskussion
Aktin co-Sedimentation ist ein einfaches in vitro-Assay zur specfic Proteine die Bindung an F-Aktin zu analysieren. In diesem Video zeigen wir ein Beispiel, wie eine einfache Aktin co-Sedimentation durchgeführt werden kann. Wir zeigen, wie F-Aktin vorbereiten, bereiten das Protein getestet werden und das Verfahren von Aktin co-Sedimentation. Eine Reihe von Punkten zu beachten bei der Durchführung von Aktin-Co-Sedimentation Assays werden. Zum Beispiel kann der Puffer-Komponenten für die Inkubation je nach Protein getestet und pH-Wert, Temp.......
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Danksagungen
Wir danken Ihnen, Dr. Praveen Kumar in der Wittman Labor am UCSF für den Film von Aktin in HaCaT-Zellen.
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Referenzen
- Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin. Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).
- Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G.
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Nachdrucke und Genehmigungen
