Summary
We tonen een eenvoudige en snelle methode om vooraf gedefinieerde aantallen cellen te laden in microfabricated putten en te onderhouden voor embryoid lichaam ontwikkeling.
Abstract
Embryoid organen (EB) zijn aggregaten van embryonale stamcellen. De meest voorkomende manier van het creëren van deze aggregaten is de opknoping neerzetten, een moeizame aanpak van het pipetteren een willekeurig aantal cellen in well platen. De interacties tussen de stamcellen gedwongen in de nabijheid van elkaar bevordert de generatie van de EBS. Omdat de media in elk van de putten moet handmatig worden uitgewisseld elke dag, deze aanpak wordt met de hand intensief.
Bovendien, omdat de milieu-parameters zoals cel-cel, cel-oplosbare factor interacties, pH en beschikbaarheid van zuurstof kan worden functies van EB grootte, kan celpopulaties verkregen uit de traditionele opknoping daalt ook sterk variëren indien gekweekt onder identieke omstandigheden. Recente studies hebben inderdaad aangetoond dat het aanvankelijke aantal cellen die het aggregaat kan aanzienlijke gevolgen stamcellen differentiatie. We hebben een eenvoudige, snelle en schaalbare methode om cultuur vooraf gedefinieerde aantallen cellen te laden in microfabricated putten en te onderhouden voor embryoid lichaam ontwikkeling. Tot slot, deze cellen zijn gemakkelijk toegankelijk voor verdere analyse en experimenten. Deze methode is vatbaar voor een lab en vereist geen speciale apparatuur. Laten we zien deze methode door het creëren van embryoid lichamen met behulp van een rode fluorescerende muizen cellijn (129S6B6-F1).
Protocol
1. Het maken van Shrinky-Dink Mold
- Druk het gewenste patroon op Shrinky-dink vel met behulp van een goede definitie printer.
- Bak Shrinky-dink vel bij 163 ° C gedurende ongeveer 10 minuten, of totdat ze volledig zijn gekrompen en de verwerving van een regelmatige vorm.
- Na Shrinky-dink mal is afgekoeld, ondergedompeld in een bad met isopropanol totdat het gehele oppervlak is nauwelijks bedekt.
- Zorgvuldig, spuit wat aceton op de mal en schud de verpakking een paar keer. Voeg meer isopropanol uit te spoelen aceton eigen risico en deze stap enkele keren herhalen totdat Shrinky-mould ziet er schoon.
- Dompel schimmel in gedestilleerd water gedurende 10 minuten te wassen alle resterende organische oplosmiddelen.
- Lucht schoon Shrinky-mal. Het opnieuw vuur ongeveer 5 minuten op 163 ° C. Dit zal compacte inkt en verdampen van de resterende oplosmiddel.
2. Het maken van PDMS microwells
- Maak een 10:01 PDMS / verharder mengsel, en schud krachtig gedurende enkele minuten.
- Plaats Shrinky-Dink schimmel in een petrischaaltje. Giet PDMS mengsel tot hij ongeveer 1 / 2 cm boven de mal oppervlak.
- Plaats schaaltje onder vacuüm bel om alle bubbels te elimineren uit PDMS mengsel.
- Plaats schotel in de oven op 70 ° C, 's nachts.
- Afgesneden solide PDMS van schimmel en bind het aan een glasplaatje alleen door druk uit te oefenen.
- Gooi eerste microwell-chip, want het heeft inktresten ingelegd tussen PDMS.
- Herhaal deze procedure om een tweede chip die is inkt-vrij en heeft een meer gedefinieerde vorm te produceren.
- Schone microwell-chip met behulp van 70% ethanol oplossing. Plaats het onder UV-licht bron gedurende 10 minuten om het te steriliseren.
3. Trapping cellen in microwells
- Tellen cellen en verdun ze in cultuur media tot de gewenste concentratie (afhankelijk van het aantal cellen in de eerste bronnen u wilt). Bijvoorbeeld, om circa 10-15 cellen per well (gemiddelde = 11, SD = 5,4, densiteit = 93%) te krijgen, gebruikten we een concentratie van 8 × 10 4 cellen / ml. Voor een concentratie van 17 × 10 4 cellen / ml, kunnen we betrouwbaar te krijgen tussen de 25 en 35 cellen per well (gemiddelde = 27,17857 SD = 7,7, densiteit = 100%).
- Plaats voorzichtig microwell chip in een centrifugebuis van 50 ml bevat een gestolde PDMS basis.
- Voeg ongeveer 2JDP ml van de cel oplossing.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 760 rpm en 4 ° C.
- Pipet uit overtollige oplossing en zorgvuldig microwell wassen met PBS 1X oplossing.
- Plaats microwell in een kleine Petry schotel, en let tijdens het gebruik van de chip uit de centrifugebuis.
- Was de cel overschot met behulp van een X PBS-oplossing.
- Plaats microwell chip onder een omgekeerde microscoop om beoogde aantal cellen per putje te controleren.
- Incubeer microwell met cellen in normale omstandigheden.
4. Cel incubatie
- Volg de normale EB-protocol in het lab.
- Verander het medium langzaam van de kant van de kamer, niet te storen de cel in de microwell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben een eenvoudige, snelle en schaalbare methode om cultuur vooraf gedefinieerde aantallen cellen te laden in microfabricated putten (gevormd uit Shrinky-Dinks) en te onderhouden voor embryoid lichaam ontwikkeling. Tot slot, deze cellen zijn gemakkelijk toegankelijk voor verdere analyse en experimenten. Deze methode is vatbaar voor een lab en vereist geen speciale apparatuur, omdat wij overbodig fotolithografie. We kunnen variëren van de grootte van de microwells evenals de concentratie van cellen / putten om het aantal en de grootte van de embryoid lichaam veranderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We willen graag CIRM bedanken voor de ondersteuning van dit werk. De cellijn werd gedoneerd van Dr Andras Nagy het Mount Sinai Hospital, Toronto, Ontario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | |||
References
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).
- Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies. J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).
- Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Controlled differentiation of stem cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).
- Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media. Development. 129, 539-549 (2002).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. J Transl Med. 4, (2006).
