Summary
אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה כדי לטעון מוגדרים מראש מספרי של תאים לתוך בארות microfabricated ולשמור אותם לפיתוח גוף embryoid.
Abstract
גופים Embryoid (EB) הם אגרגטים של תאים עובריים. הדרך הנפוצה ביותר ליצירת אגרגטים אלה היא השיטה ירידה תלוי, גישה מייגע של pipetting מספר שרירותי של תאים לתוך צלחות היטב. אינטראקציות בין בתאי גזע בכפייה בסמיכות זה לזה מקדמת את הדור של EBS. בגלל התקשורת בכל בארות יש להחליף באופן ידני כל יום, גישה זו היא אינטנסיבית באופן ידני.
יתר על כן, בגלל פרמטרים סביבתיים כולל תאים תאים, תא מסיסים אינטראקציות גורם, pH, זמינות החמצן יכול להיות פונקציות של גודל EB, אוכלוסיות תאים המתקבל טיפות תלוי המסורתי יכול להשתנות באופן דרמטי, גם כאשר בתרבית בתנאים זהים. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי אכן מספר ראשוני של התאים המרכיבים את המצרף יכולה להיות השפעה משמעותית על התמיינות בתאי גזע. פיתחנו שיטה תרבות פשוטה, מהירה, וניתן להרחבה לטעון מוגדרים מראש מספרי של תאים לתוך בארות microfabricated ולשמור אותם לפיתוח גוף embryoid. לבסוף, תאים אלה נגישים בקלות לניתוח ניסויים נוספים. שיטה זו ניתנת לכל מעבדה ואינה דורשת ציוד ייעודי. אנו להדגים שיטה זו על ידי יצירת גופים embryoid באמצעות תא אדום ניאון העכבר קו (129S6B6-F1).
Protocol
1. ביצוע טיפולית נידחת עובש
- הדפס את התבנית הרצויה על גיליון טיפולית נידחת באמצעות מדפסת הגדרה טובה.
- אופים טיפולית נידחת בבית גיליון 163 מעלות למשך כ -10 דקות, או עד התכווץ באופן מלא לאחר שרכש צורה רגילה.
- לאחר טיפולית נידחת עובש מתקרר, להטביע אותו באמבטיה isopropanol עד פני השטח להשלים מכוסה בקושי.
- בזהירות, לרסס קצת אצטון על התבנית ולנער המיכל כמה פעמים. הוסף isopropanol יותר לשטוף את עודפי אצטון לחזור על פעולה זו מספר פעמים עד טיפולית, עובש נראה נקי.
- עובש לטבול במים מזוקקים למשך 10 דקות כדי לשטוף את כל ממיס אורגני הנותרים.
- האוויר נקי טיפולית-עובש. Re-לחמם אותו כ -5 דקות על 163 מעלות צלסיוס זה דיו קומפקטי רצון להתאדות כל ממס הנותרים.
2. ביצוע PDMS microwells
- הכינו תערובת 10:01 PDMS סוכן / ריפוי, לבחוש נמרצות במשך כמה דקות.
- טיפולית נידחת מקום עובש בצלחת פטרי קטנות. יוצקים את תערובת PDMS עד שהוא מגיע בערך 1 / 2 ס"מ מעל פני השטח עובש.
- מניחים צלחת תחת פעמון ואקום לחסל את כל הבועות מתערובת PDMS.
- מניחים צלחת בתנור ב 70 ° C, למשך הלילה.
- שנותקו PDMS מוצקה עובש לקשור אותה זכוכית שקופית רק על ידי הפעלת לחץ.
- בטל first microwell שבב, שכן יש שאריות דיו incrusted בין PDMS.
- חזור על תהליך זה כדי לייצר שבב השני הוא דיו חינם ויש לו צורה מוגדרת יותר.
- נקה microwell שבב באמצעות פתרון אתנול 70%. מניחים אותו תחת מקור אור UV למשך 10 דקות כדי לחטא אותו.
3. תאים של השמנה microwells
- ספירת תאים ו לדלל אותם בתקשורת תרבות לריכוז הרצוי (תלוי כמה תאים ראשונית בארות אתה רוצה). לדוגמה, כדי לקבל כ 10-15 תאים לכל טוב (ממוצע = 11, SD = 5.4, קצב הטעינה = 93%), השתמשנו ריכוז של 8 × 10 4 תאים / מ"ל. עבור בריכוז של 17 × 10 4 תאים / מ"ל, נוכל לקבל בצורה אמינה בין 25 ל 35 תאים בכל טוב (ממוצע = 27.17857 SD = 7.7, קצב העמסה = 100%).
- בזהירות מקום שבב microwell בצינור צנטריפוגה המכילה 50 מ"ל בסיס מוצק PDMS.
- הוסף על 2JDP מ"ל של תמיסת התא.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 760 סל"ד ו - 4 ° C.
- Pipet את הפתרון עודף ובזהירות לשטוף microwell עם פתרון 1X PBS.
- המקום microwell בצלחת פטרי קטנה, נזהר תוך השבב מתוך הצינור צנטריפוגות.
- לשטוף עודף תאים באמצעות פתרון 1 X PBS.
- המקום שבב microwell תחת מיקרוסקופ הפוכה לאמת מספר של תאים המיועדים לכל טוב.
- דגירה microwell המכיל תאים בתנאים סטנדרטיים.
4. תא הדגירה
- פעל על פי פרוטוקול EB רגיל במעבדה.
- שנה את בינונית לאט מהצד של החדר; להימנע להפריע תא microwell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פיתחנו שיטה תרבות פשוטה, מהירה, וניתן להרחבה לטעון מוגדרים מראש מספרי של תאים לתוך בארות microfabricated (יצוק מ-טיפולית Dinks) ולשמור אותם לפיתוח גוף embryoid. לבסוף, תאים אלה נגישים בקלות לניתוח ניסויים נוספים. שיטה זו ניתנת לכל מעבדה ואינה דורשת ציוד ייעודי כי אנחנו לייתר את הצורך photolithography. אנחנו יכולים לשנות את הגודל של microwells וכן ריכוז של תאים / בארות כדי לשנות את המספר והגודל של הגופים embryoid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ברצוננו להודות על התמיכה CIRM של עבודה זו. קו התא נתרם בנדיבות בבית החולים הר סיני, טורונטו, אונטריו מד"ר Andras נאגי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | |||
References
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).
- Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies. J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).
- Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Controlled differentiation of stem cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).
- Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media. Development. 129, 539-549 (2002).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. J Transl Med. 4, (2006).
