Summary
हम एक सरल और तेजी से विधि microfabricated कुओं में कक्षों की पूर्व निर्धारित संख्या लोड और उन्हें embryoid शरीर के विकास के लिए बनाए रखने दिखा.
Abstract
Embryoid निकायों (EB) भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का समुच्चय हैं. इन समुच्चय बनाने का सबसे आम तरीका फांसी ड्रॉप विधि, अच्छी तरह प्लेटों में कक्षों की एक मनमाना संख्या pipetting के एक श्रमसाध्य दृष्टिकोण है. एक दूसरे के करीब निकटता में मजबूर स्टेम कोशिकाओं के बीच बातचीत ईबीएस की पीढ़ी को बढ़ावा देता है. क्योंकि कुओं की प्रत्येक में मीडिया के लिए मैन्युअल रूप से हर दिन विमर्श किया जा, इस दृष्टिकोण मैन्युअल गहन है.
इसके अलावा, क्योंकि सेल सेल, सेल घुलनशील कारक बातचीत, पीएच, और ऑक्सीजन की उपलब्धता सहित पर्यावरण मापदंडों EB आकार का कार्य किया जा सकता है, सेल पारंपरिक फांसी बूंदों से प्राप्त आबादी नाटकीय रूप से भी भिन्न जब समान शर्तों के तहत संवर्धित कर सकते हैं. वास्तव में हाल के अध्ययनों से पता चला है कि कुल कोशिकाओं के गठन की प्रारंभिक संख्या स्टेम सेल भेदभाव पर महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है. हम एक सरल, तेजी से और स्केलेबल संस्कृति microfabricated कुओं में कक्षों की पूर्व निर्धारित संख्या लोड और उन्हें embryoid शरीर के विकास के लिए बनाए रखने के विधि विकसित किया है. अंत में, इन कोशिकाओं को आगे के विश्लेषण और प्रयोग के लिए आसानी से सुलभ हैं. यह विधि किसी भी प्रयोगशाला करने के लिए उत्तरदायी है और कोई समर्पित उपकरणों की आवश्यकता है. हम embryoid शरीर एक लाल फ्लोरोसेंट माउस सेल लाइन (129S6B6 F1) का उपयोग कर बनाने के द्वारा इस विधि का प्रदर्शन.
Protocol
1. Shrinky-dink मोल्ड बनाना
- Shrinky dink एक अच्छा परिभाषा प्रिंटर का उपयोग कर पत्रक पर वांछित पैटर्न प्रिंट.
- सेंकना 163 पर चादर shrinky dink डिग्री सेल्सियस के बारे में 10 मिनट, या जब तक के लिए पूरी तरह से सिकुड़ और एक नियमित रूप से आकार प्राप्त कर लिया.
- Shrinky dink - मोल्ड के बाद नीचे ठंडा है, यह एक isopropanol स्नान में डूब जब तक पूरा सतह मुश्किल से कवर किया जाता है.
- ध्यान से, मिट्टी पर कुछ एसीटोन स्प्रे और कंटेनर एक बार कुछ हिला. अधिक एसीटोन अधिक धोने और इस कदम को कुछ बार दोहराएँ जब तक shrinky मोल्ड साफ दिखता isopropanol जोड़ें.
- 10 मिनट के लिए किसी भी शेष कार्बनिक विलायक धोने आसुत जल में विसर्जित कर ढालना.
- एयर साफ shrinky - ढालना. 163 के बारे में 5 मिनट के लिए इसे पुनः गर्मी डिग्री सेल्सियस यह किसी भी शेष विलायक कॉम्पैक्ट स्याही लुप्त हो जाना जाएगा और.
2. PDMS microwells
- 10:01 PDMS / इलाज एजेंट मिश्रण तैयार है, और कुछ मिनट के लिए तेजी से आंदोलन.
- जगह एक छोटे से पेट्री डिश में ढालना shrinky-dink. PDMS मिश्रण डालो जब तक यह मोल्ड सतह पर के बारे में 1 / 2 सेमी तक पहुँचता है.
- वैक्यूम घंटी के तहत प्लेस पकवान PDMS मिश्रण से सभी बुलबुले को खत्म करने.
- प्लेस पकवान ओवन में 70 ° C, रात भर.
- आचारण से ठोस PDMS कट और एक गिलास स्लाइड के लिए यह सिर्फ दबाव लागू करने से बाँध.
- पहली microwell - चिप त्यागें, क्योंकि यह स्याही PDMS बीच incrusted अवशेष है.
- एक दूसरे चिप है कि स्याही से मुक्त है और एक अधिक परिभाषित आकार है का उत्पादन इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
- स्वच्छ microwell चिप 70% इथेनॉल समाधान का उपयोग. यूवी प्रकाश स्रोत के तहत यह 10 मिनट के लिए यह बाँझ के लिए रखें.
3. Microwells में फँसाने कोशिकाओं
- गणना कोशिकाओं और उन्हें वांछित एकाग्रता (आप कैसे कई कुओं में प्रारंभिक कोशिकाओं करना चाहते हैं पर निर्भर करता है) संस्कृति मीडिया में कमजोर. उदाहरण के लिए, अच्छी तरह से प्रति लगभग 10-15 कोशिकाओं (औसत = 11, = 5.4 एसडी, दर लोड हो रहा है = 93%) पाने के लिए, हम 8 के एक एकाग्रता × 10 4 कोशिकाओं / एमएल इस्तेमाल किया. 17 × 10 4 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता के लिए, हम मज़बूती से अच्छी तरह से प्रति 25 और 35 के बीच कोशिकाओं (औसत = 27.17857 एसडी = 7.7 लोड दर = 100%) मिल सकता है.
- ध्यान से एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र जम PDMS आधार युक्त ट्यूब में microwell चिप जगह है.
- सेल के समाधान के 2JDP मिलीलीटर के बारे में जोड़ें.
- 760 rpm पर 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र
- अतिरिक्त समाधान बाहर Pipet और ध्यान से पीबीएस 1X समाधान के साथ microwell धोने.
- एक छोटे से Petry डिश में microwell प्लेस, सावधान किया जा रहा है जबकि अपकेंद्रित्र ट्यूब की चिप बाहर ले.
- सेल अतिरिक्त 1 एक्स पीबीएस समाधान का उपयोग कर धो लें.
- एक औंधा के लिए अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं की संख्या का इरादा की पुष्टि की खुर्दबीन के नीचे microwell चिप रखें.
- सेते microwell मानक स्थितियों में कोशिकाओं से युक्त है.
4. सेल ऊष्मायन
- प्रयोगशाला में सामान्य EB प्रोटोकॉल का पालन करें.
- चैम्बर की ओर से धीरे धीरे मध्यम बदलें; microwell में परेशान सेल से बचें.
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Discussion
हम एक सरल, तेजी से और स्केलेबल संस्कृति microfabricated कुओं (Shrinky - Dinks से molded) में कक्षों की पूर्व निर्धारित संख्या लोड और उन्हें embryoid शरीर के विकास के लिए बनाए रखने के विधि विकसित किया है. अंत में, इन कोशिकाओं को आगे के विश्लेषण और प्रयोग के लिए आसानी से सुलभ हैं. यह विधि किसी भी प्रयोगशाला करने के लिए उत्तरदायी है और कोई समर्पित उपकरणों की आवश्यकता है क्योंकि हम photolithography के लिए जरूरत नहीं रहेगी. हम microwells के आकार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं / कुओं की एकाग्रता भिन्न embryoid निकायों की संख्या और आकार बदल सकते हैं.
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Acknowledgments
हम इस काम के समर्थन के लिए सीआईआरएम धन्यवाद देना चाहूंगा. सेल लाइन उदारता माउंट सिनाई अस्पताल, टोरंटो, ओंटारियो में डा. Andras नेगी से दान था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | |||
References
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- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
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