Summary
Мы показываем, простой и быстрый метод для загрузки предварительно определенные числа клеток в microfabricated скважин и поддерживать их на эмбриоидных развития организма.
Abstract
Эмбриоидных органов (EB) являются агрегатами эмбриональных стволовых клеток. Наиболее распространенным способом создания этих агрегатов методом висячей капли, трудоемкий подход пипетирования произвольное количество клеток в хорошо пластин. Взаимодействий между стволовыми клетками вынуждены непосредственной близости друг от друга способствует поколения EBS. Потому что средства массовой информации в каждой из скважин вручную обменялись каждый день, этот подход вручную интенсивно.
Более того, поскольку параметры окружающей среды, включая сотовые-ячейки и растворимые взаимодействия фактора, рН и наличие кислорода могут быть функциями EB размер, клеточных популяций получены от традиционных висят капли могут резко меняться даже при культивировании в одинаковых условиях. Недавние исследования показали, что действительно начальное количество клеток, образующих совокупности может оказать существенное воздействие на стволовые дифференциации клеток. Мы разработали простой, быстрой и масштабируемой культуры метод для загрузки предварительно определенные числа клеток в microfabricated скважин и сохранить их для эмбриоидных развития организма. Наконец, эти клетки были легко доступны для дальнейшего анализа и экспериментов. Этот метод поддается любой лаборатории и не требует специализированного оборудования. Мы показываем этот метод путем создания эмбриоидных органов использованием красного флуоресцентного клеточной линии мыши (129S6B6-F1).
Protocol
1. Создание Shrinky-Mold Динка
- Печать желаемый рисунок на shrinky-Динка листа с помощью хорошего принтера определение.
- Выпекать shrinky-Динка листа при 163 ° С около 10 минут, или пока он полностью не уменьшились, а получив правильной формы.
- После shrinky-Динка плесень остынет, погрузите его в бане, пока изопропанола всей поверхности почти не охвачены.
- Осторожно, спрей некоторые ацетона над плесень и встряхните контейнер несколько раз. Добавить еще изопропанола, чтобы смыть ацетоном избыточных и повторить этот шаг несколько раз, пока shrinky-плесень выглядит чистым.
- Погрузите плесени в дистиллированной воде в течение 10 минут, чтобы смыть все оставшиеся органическом растворителе.
- Воздух чистый shrinky-формы. Повторное нагреть его в течение 5 минут при 163 ° С. Это будет компактный чернил и испарять любые оставшиеся растворителя.
2. Создание PDMS микролунки
- Подготовка 10:01 PDMS / отвердитель смеси, и агитировать энергично в течение нескольких минут.
- Место shrinky-Динка плесени в небольшой чашке Петри. Вылейте смесь PDMS, пока не достигнет примерно 1 / 2 см на поверхности формы.
- Место блюдо под вакуумом колокол в целях ликвидации всех пузырьков из смеси PDMS.
- Место блюдо в духовке при температуре 70 ° C, в одночасье.
- Срезать твердые PDMS от плесени и привязать его к стеклу только путем применения давления.
- Отменить первый микролуночные-чипа, так как он имеет остатки краски инкрустированный между PDMS.
- Повторите эту процедуру для получения второй чип, который чернильный, свободных и имеет более определенные формы.
- Чистая микролуночные-чипов с помощью 70% спиртового раствора. Поместите его под ультрафиолетовым источником света в течение 10 минут, чтобы стерилизовать.
3. Перехват клеток в лунки
- Граф клетки и разбавить их в культуру средств массовой информации к желаемой концентрации (в зависимости от того, сколько исходных клеток в скважинах вы хотите). Например, чтобы получить примерно 10-15 клеток на лунку (среднее = 11, SD = 5,4, погрузка ставка = 93%), мы использовали концентрации 8 × 10 4 клеток / мл. Для концентрации 17 × 10 4 клеток / мл, мы могли бы надежно получить от 25 до 35 клеток на лунку (среднее = 27,17857 SD = 7,7, погрузка ставка = 100%).
- Осторожно поместите микролуночные чип в 50 мл центрифуге трубки, содержащей затвердевших PDMS базы.
- Добавьте приблизительно 2JDP мл ячейки решение.
- Центрифуга в течение 5 минут при 760 оборотах в минуту и 4 ° C.
- Внесите лишний раствор и тщательно мыть микролуночные раствором PBS 1X.
- Место микролуночные в небольшое блюдо Петри, будьте осторожны при приеме чип из центрифуги трубы.
- Вымойте ячейки избыточного использования 1 X PBS решение.
- Место микролуночные чип под инвертированным микроскопом проверить предназначен число клеток на лунку.
- Инкубируйте микролуночные содержащие клетки при стандартных условиях.
4. Сотовые инкубации
- Следуйте нормальной протокол EB в лаборатории.
- Изменение среды медленно со стороны камеры; не мешать ячейку в микролуночные.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы разработали простой, быстрой и масштабируемой культуры метод для загрузки предварительно определенные числа клеток в microfabricated скважин (отлит из Shrinky-Dinks) и сохранить их для эмбриоидных развития организма. Наконец, эти клетки были легко доступны для дальнейшего анализа и экспериментов. Этот метод поддается любой лаборатории и не требует никакого специализированного оборудования, потому что мы устранить необходимость в фотолитографии. Мы можем варьировать размер лунки, а также концентрации клеток / скважины, чтобы изменить количество и размер эмбриоидных органов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить CIRM за поддержку этой работы. Клеточная линия была щедро пожертвовал от доктора Андраш Надь в больнице Маунт Синай в Торонто, Онтарио.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | |||
References
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).
- Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies. J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).
- Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Controlled differentiation of stem cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).
- Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media. Development. 129, 539-549 (2002).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. J Transl Med. 4, (2006).
