Summary
Nos muestran un método sencillo y rápido para cargar previamente definidos el número de células en los pozos microfabricated y mantenimiento para el desarrollo del cuerpo embrioides.
Abstract
Cuerpos embrioides (EB) son agregados de células madre embrionarias. La forma más común de la creación de estos agregados es el método de la gota colgante, un enfoque laborioso de pipeteo un número arbitrario de las células en placas. Las interacciones entre las células madre obligado a cerca de uno al otro promueve la generación de la EBS. Debido a que los medios de comunicación en cada uno de los pozos tiene que ser intercambiados de forma manual todos los días, este enfoque es manual intensivo.
Además, debido a los parámetros ambientales como la célula-célula, las células interacciones de los factores solubles, pH, y la disponibilidad de oxígeno pueden ser funciones del tamaño de EB, las poblaciones de células obtenidas a partir de gotas colgantes tradicionales pueden variar considerablemente, incluso cuando se cultivan en condiciones idénticas. Estudios recientes han demostrado claramente que el número inicial de células que forman el conjunto puede tener efectos significativos sobre la diferenciación de células madre. Hemos desarrollado un método de cultivo sencillo, rápido y escalable para la carga de pre-definidos del número de células en los pozos microfabricated y mantenimiento para el desarrollo del cuerpo embrioides. Por último, estas células son fácilmente accesibles para su posterior análisis y la experimentación. Este método se presta a cualquier laboratorio y no requiere equipo especializado. Se demuestra que este método mediante la creación de cuerpos embrioides con una línea roja fluorescente de células de ratón (129S6B6-F1).
Protocol
1. Hacer Shrinky Dink-Moho
- Imprimir el modelo deseado en la hoja de Shrinky-dink con una impresora buena definición.
- Hornee Shrinky-dink hoja a 163 ° C durante unos 10 minutos, o hasta que esté completamente reducido y haber adquirido una forma regular.
- Después de Shrinky-dink molde se haya enfriado, se sumergen en un baño de isopropanol hasta que la superficie total es de apenas cubiertos.
- Cuidadosamente, rociar un poco de acetona sobre el molde y agitar contenedores un par de veces. Añadir más isopropanol para vaciar el exceso de acetona y repetir este paso varias veces hasta que Shrinky el molde se ve limpio.
- Molde de sumergir en agua destilada durante 10 minutos para lavar cualquier resto de solvente orgánico.
- Aire limpio Shrinky el molde. Volver a calentar durante unos 5 minutos a 163 ° C. Esto tinta compacta y evaporar cualquier solvente restante.
2. Hacer PDMS micropocillos
- Prepare una mezcla de agente de 10:01 PDMS / curado y agitar enérgicamente durante unos minutos.
- Lugar Shrinky-dink molde en una pequeña placa de Petri. Vierta la mezcla de PDMS hasta llegar a aproximadamente 1 / 2 cm sobre la superficie del molde.
- Introducir la cápsula en la campana de vacío para eliminar todas las burbujas de la mezcla de PDMS.
- Introducir la cápsula en el horno a 70 ° C, durante la noche.
- Cortar sólidos PDMS del molde y se unen a un portaobjetos de vidrio con sólo aplicar presión.
- Primer descarte de micropocillos-chip, ya que cuenta con restos de tinta incrustada entre PDMS.
- Repita este procedimiento para producir un segundo chip que está sin tinta y tiene una forma más definida.
- Limpie micropocillos-chip con solución al 70% de etanol. Colócalo debajo de la fuente de luz UV durante 10 minutos para esterilizarlo.
3. Las células de trampeo en micropocillos
- Recuento de células y se diluye en medio de cultivo a la concentración deseada (dependiendo del número de células iniciales en los pozos que le gustaría). Por ejemplo, para obtener aproximadamente 10-15 células por pocillo (media = 11, SD = 5,4, la tasa de carga = 93%), se utilizó una concentración de 8 × 10 4 células / ml. Para una concentración de 17 × 10 4 células / ml, se podría obtener de forma fiable entre 25 y 35 células por pocillo (media = 27.17857 SD = 7,7, la tasa de carga = 100%).
- Con cuidado, coloque chips pocillos en un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene una base de PDMS solidificado.
- Añadir alrededor de 2JDP ml de la solución de células.
- Centrifugar durante 5 minutos a 760 rpm y 4 ° C.
- Pipeta de exceso de solución y lave cuidadosamente pocillos con PBS solución 1X.
- Colocar en una placa de micropocillos Petry pequeño, con cuidado, teniendo el chip del tubo de centrífuga.
- Lavar el exceso de células usando una solución de PBS X.
- Lugar de chips de micropocillos bajo un microscopio invertido para verificar el número previsto de células por pocillo.
- Incubar micropocillos que contienen las células en condiciones normales.
4. Incubación de células
- Seguir el protocolo normal de EB en el laboratorio.
- Cambiar el medio lentamente desde el lado de la cámara, no molestar a la celda de la microplaca.
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Discussion
Hemos desarrollado un método de cultivo sencillo, rápido y escalable para la carga de pre-definidos del número de células en los pozos microfabricated (moldeados a partir de Shrinky-Dinks) y mantenimiento para el desarrollo del cuerpo embrioides. Por último, estas células son fácilmente accesibles para su posterior análisis y la experimentación. Este método se presta a cualquier laboratorio y no requiere equipo especializado, ya que elimina la necesidad de fotolitografía. Podemos variar el tamaño de las cúpulas, así como la concentración de células / pozos para cambiar el número y el tamaño de los cuerpos embrioides.
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Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias al CIRM para apoyar este trabajo. La línea celular fue generosamente donada por el Dr. Andras Nagy en el Mount Sinai Hospital, Toronto, Ontario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | |||
References
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- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
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