Summary
Vi visar en enkel och snabb metod för att ladda fördefinierade antalet celler i mikrofabricerade brunnar och behålla dem för embryoid kropp utveckling.
Abstract
Embryoid organ (EB) är aggregat av embryonala stamceller. Det vanligaste sättet att skapa dessa aggregat är den droppe metoden, en mödosam tillvägagångssätt pipettering ett godtyckligt antal celler till bra plattor. Samspelet mellan stamceller tvingas in i närheten av varandra främjar uppkomsten av EBS. Eftersom media i var och en av brunnarna måste manuellt bytas varje dag, är denna metod manuellt intensiv.
Dessutom, eftersom miljöparametrar inklusive cell-cell, cell-lösliga interaktioner faktor, pH och syretillgång kan vara funktioner av EB storlek kan cellpopulationer som kommer från traditionella hängande droppar varierar kraftigt även när odlade under identiska förhållanden. Nyligen genomförda studier har ju visat att det ursprungliga antalet celler som bildar den sammanlagda kan få betydande effekter på stamceller differentiering. Vi har utvecklat en enkel, snabb och skalbar kultur metoden att läsa fördefinierade antalet celler i mikrofabricerade brunnar och behålla dem för embryoid kropp utveckling. Slutligen, dessa celler är lätt tillgängliga för vidare analys och experiment. Denna metod är mottaglig för någon labb och kräver ingen särskild utrustning. Vi visar här metoden genom att skapa embryoid organ med hjälp av en röd fluorescerande linje mus cell (129S6B6-F1).
Protocol
1. Göra Shrinky-Dink Mold
- Skriv det önskade mönstret på shrinky-Dink ark med hjälp av en bra definition skrivare.
- Grädda shrinky-Dink ark i 163 ° C i ca 10 minuter, eller tills helt krympt och har fått en regelbunden form.
- Efter shrinky-Dink mögel har svalnat, tills dränka den i en isopropanol bad hela ytan är knappt täckt.
- Försiktigt, spraya lite aceton över formen och skaka behållaren några gånger. Lägg till fler isopropanol att tvätta bort aceton överskott och upprepa detta steg några gånger tills shrinky-mögel ser ren.
- Sänk mögel i destillerat vatten i 10 minuter för att tvätta bort eventuell kvarvarande organiskt lösningsmedel.
- Air Clean shrinky-mögel. Re-värma den i cirka 5 minuter vid 163 ° C. Detta kommer kompakta bläck och avdunsta resterande lösningsmedel.
2. Göra PDMS mikrobrunnar
- Förbered en 10:01 PDMS / härdare blandning, och skaka kraftigt i några minuter.
- Placera shrinky-Dink mögel i en liten petriskål. Häll PDMS blandningen tills den når ca 1 / 2 cm över formens yta.
- Placera skålen under vakuum klocka att eliminera alla bubblor från PDMS blandning.
- Placera skålen i ugnen vid 70 ° C, över natten.
- Klipp av fasta PDMS från mögel och binda det till en glasskiva bara genom att utöva påtryckningar.
- Kasta first brunn-chip, eftersom det har bläck rester incrusted mellan PDMS.
- Upprepa denna procedur för att producera ett andra chip som är bläck-fri och har en mer definierad form.
- Rengör brunn-chip med 70% etanol-lösning. Placera den i UV-ljuskällan i 10 minuter för att sterilisera den.
3. Svällning celler i mikrobrunnar
- Räkna celler och späda ut dem i kultur media till önskad koncentration (beroende på hur många inledande celler i brunnar du vill). Till exempel, för att få cirka 10-15 celler per brunn (genomsnitt = 11, SD = 5,4, lastning sats = 93%) använde vi en koncentration av 8 × 10 4 celler / ml. För en koncentration av 17 × 10 4 celler / ml, skulle vi kunna få ett tillförlitligt mellan 25 och 35 celler per brunn (genomsnitt = 27,17857 SD = 7,7, lastning sats = 100%).
- Placera försiktigt mikrobrunn chip i ett 50 ml centrifugrör innehållande en stelnad PDMS bas.
- Tillsätt ca 2JDP ml av cellen lösningen.
- Centrifugera i 5 minuter vid 760 rpm och 4 ° C.
- Pipettera upp överflödig lösning och noggrant tvätta brunn med PBS 1X-lösning.
- Placera brunn i en liten Petry maträtt, var försiktig när du tar chippet ur centrifugrör.
- Tvätta cell överskott med 1 X PBS lösning.
- Placera brunn chip i ett inverterat mikroskop för att kontrollera planerade antalet celler per brunn.
- Inkubera brunn som innehåller celler under standardförhållanden.
4. Cell inkubation
- Följ normala EB-protokollet i labbet.
- Ändra mediet sakta från sidan av kammaren, undvika att störa cellen i brunn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utvecklat en enkel, snabb och skalbar kultur metoden att läsa fördefinierade antalet celler i mikrofabricerade brunnar (gjutna från Shrinky-Dinks) och underhålla dem för embryoid kropp utveckling. Slutligen, dessa celler är lätt tillgängliga för vidare analys och experiment. Denna metod är mottaglig för någon labb och kräver ingen särskild utrustning för att vi undanröja behovet av fotolitografi. Vi kan variera storleken på mikrobrunnarna samt koncentrationen av celler / brunnar för att ändra antalet och storleken på embryoid organ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka CIRM för att stödja detta arbete. Den cellinje var generöst donerade från Dr Andras Nagy vid Mount Sinai Hospital, Toronto, Ontario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | |||
References
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).
- Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies. J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).
- Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Controlled differentiation of stem cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).
- Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media. Development. 129, 539-549 (2002).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. J Transl Med. 4, (2006).
