Summary
Nous montrons une méthode simple et rapide à charger pré-défini le nombre de cellules dans des puits microfabriqué et de les maintenir pour le développement du corps embryoïdes.
Abstract
Corps embryoïdes (EB) sont des agrégats de cellules souches embryonnaires. La façon la plus commune de créer ces agrégats est la méthode la goutte suspendue, une approche laborieuse de pipetage un nombre arbitraire de cellules dans des plaques bien. Les interactions entre les cellules souches contraints à proximité les uns des autres favorise la génération de l'EBS. Parce que les médias dans chacun des puits doit être manuellement échangés chaque jour, cette approche est manuellement intensives.
Par ailleurs, parce que les paramètres environnementaux, y compris cellule-cellule, les interactions de facteurs cellulaires solubles, le pH, l'oxygène et la disponibilité peuvent être des fonctions de la taille de EB, les populations cellulaires obtenues à partir traditionnelle gouttes suspendues peut varier considérablement, même quand elles sont cultivées dans des conditions identiques. Des études récentes ont en effet montré que le nombre initial de cellules formant l'agrégat peut avoir des effets significatifs sur la différenciation des cellules souches. Nous avons développé une méthode de culture simple, rapide et évolutive pour charger pré-défini le nombre de cellules dans des puits microfabriqué et de les maintenir pour le développement du corps embryoïdes. Enfin, ces cellules sont facilement accessibles pour une analyse plus approfondie et d'expérimentation. Cette méthode se prête à n'importe quel laboratoire et ne nécessite aucun équipement dédié. Nous démontrons cette méthode en créant des corps embryoïdes en utilisant une ligne rouge fluorescente de cellules de souris (129S6B6-F1).
Protocol
1. Faire Shrinky-Mold Dink
- Imprimez le motif désiré sur Shrinky-dink feuille en utilisant une imprimante de bonne définition.
- Cuire Shrinky-dink feuille à 163 ° C pendant environ 10 minutes, ou jusqu'à ce que tout rétréci et ayant acquis une forme régulière.
- Après Shrinky-dink moule a refroidi, le plonger dans un bain d'isopropanol jusqu'à ce que la surface totale est à peine couverts.
- Soigneusement, vaporiser un peu d'acétone sur le moule et secouer le récipient à quelques reprises. Ajouter plus d'isopropanol pour laver l'excès d'acétone et de répéter cette étape plusieurs fois jusqu'à Shrinky-moisissure semble propre.
- Moisissures Plonger dans l'eau distillée pendant 10 minutes pour se laver de toute restantes solvant organique.
- Air propre Shrinky-moule. Il a reconduit la chaleur pendant environ 5 minutes à 163 ° C. Ce sera d'encre compacte et évaporer tout solvant restant.
2. Faire PDMS micropuits
- Préparer un mélange 10:01 PDMS agent / durcissement, et agiter vigoureusement pendant quelques minutes.
- Placez-Shrinky Dink moule dans une petite boîte de Petri. Verser le mélange PDMS jusqu'à ce qu'elle atteigne environ 1 / 2 cm sur la surface du moule.
- Placer sous le plat de cloche à vide pour éliminer toutes les bulles du mélange PDMS.
- Plat Mettre au four à 70 ° C, pendant la nuit.
- Coupez solides PDMS par la moisissure et le lier à une lame de verre simplement en appliquant une pression.
- Jeter premier micropuits puce, car il a les résidus d'encre incrustée entre le PDMS.
- Répétez cette procédure pour produire une seconde puce qui est sans encre et a une forme plus définie.
- Nettoyer micropuits-puce en utilisant une solution d'éthanol à 70%. Placez-le sous source de lumière UV pendant 10 minutes pour le stériliser.
3. Le piégeage des cellules dans des micropuits
- Comptez les cellules et les diluer dans des milieux de culture à la concentration souhaitée (selon le nombre de cellules initiales dans les puits que vous souhaitez). Par exemple, pour obtenir environ 10-15 cellules par puits (moyenne = 11, SD = 5,4, le taux de chargement = 93%), nous avons utilisé une concentration de 8 x 10 4 cellules / ml. Pour une concentration de 17 × 10 4 cellules / ml, on pouvait obtenir de manière fiable entre 25 et 35 cellules par puits (moyenne = 27,17857 SD = 7,7, le taux de chargement = 100%).
- Placez délicatement puce micropuits dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant une base de PDMS solidifié.
- Ajouter environ 2JDP ml de la solution de la cellule.
- Centrifuger pendant 5 minutes à 760 rpm et 4 ° C.
- Pipet à l'excès de solution et les laver soigneusement avec du PBS 1X micropuits solution.
- Placer dans un plat à micropuits Petry petits, en faisant attention tout en prenant la puce hors du tube de centrifugation.
- Lavez l'excès de cellules en utilisant une solution de PBS X.
- Placez puce micropuits sous un microscope inversé à vérifier le numéro de l'intention de cellules par puits.
- Incuber micropuits contenant des cellules dans des conditions standard.
4. Incubation des cellules
- Suivre le protocole EB normale dans le laboratoire.
- Changer le support lentement du côté de la chambre; éviter de perturber la cellule dans le puits.
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Discussion
Nous avons développé une méthode de culture simple, rapide et évolutive pour charger pré-défini le nombre de cellules dans des puits microfabriqué (moulés à partir de Shrinky-Dinks) et de les maintenir pour le développement du corps embryoïdes. Enfin, ces cellules sont facilement accessibles pour une analyse plus approfondie et d'expérimentation. Cette méthode se prête à n'importe quel laboratoire et ne nécessite aucun équipement dédié, parce que nous parer à la nécessité pour la photolithographie. Nous pouvons varier la taille des micropuits ainsi que la concentration de cellules / puits pour changer le nombre et la taille des corps embryoïdes.
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Acknowledgments
Nous tenons à remercier le CIRM pour le soutien de ce travail. La lignée cellulaire a été généreusement donnés par le Dr Andras Nagy à l'Hôpital Mount Sinai, à Toronto, en Ontario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | |||
References
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- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).
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