Summary
Vamos mostrar um método simples e rápido para carregar números pré-definidos de células em poços microfabricated e mantê-los para o desenvolvimento do corpo embrióides.
Abstract
Corpos embrióides (EB) são agregados de células-tronco embrionárias. A forma mais comum de criar esses agregados é o método de gota em suspensão, uma abordagem laboriosa de pipetagem um número arbitrário de células em placas bem. As interações entre as células-tronco forçado a estreita proximidade um do outro promove a geração dos EBs. Porque a mídia em cada um dos poços tem que ser trocado manualmente todos os dias, esta abordagem é manualmente intensivo.
Além disso, porque os parâmetros ambientais, incluindo a célula-célula, as interações célula-soluble fator, pH, ea disponibilidade de oxigênio podem ser funções de tamanho EB, populações de células obtidas a partir tradicionais gotas de suspensão pode variar drasticamente, mesmo quando cultivadas em condições idênticas. Estudos recentes têm mostrado que na verdade o número inicial de células que formam o agregado pode ter efeitos significativos sobre a diferenciação de células-tronco. Nós desenvolvemos um método de cultura simples, rápida e escalável para carregar números pré-definidos de células em poços microfabricated e mantê-los para o desenvolvimento do corpo embrióides. Finalmente, essas células são facilmente acessíveis para posterior análise e experimentação. Este método é passível de qualquer laboratório e não exige equipamentos dedicados. Nós demonstrar este método, criando corpos embrióides usando uma linha de células vermelhas fluorescentes mouse (129S6B6-F1).
Protocol
1. Fazendo Shrinky Dink-Mold
- Imprimir o padrão desejado na Shrinky dink folhas usando uma impressora boa definição.
- Asse folha Shrinky dink-a 163 ° C por cerca de 10 minutos, ou até totalmente encolhido e tendo adquirido uma forma regular.
- Depois Shrinky dink-molde ter arrefecido, submerge-o em um banho de isopropanol até que a superfície total é mal cobria.
- Cuidadosamente, spray alguns acetona sobre o molde e agitar recipiente algumas vezes. Adicione mais isopropanol para lavar o excesso de acetona e repita este passo algumas vezes até Shrinky molde parece limpo.
- Molde mergulhe em água destilada por 10 minutos para lavar qualquer solvente orgânico restantes.
- Ar limpo Shrinky molde. Re-aquecer por aproximadamente 5 minutos a 163 ° C. Isso vai de tinta compacta e evaporar qualquer solvente restante.
2. Fazendo PDMS micropoços
- Prepare uma mistura de agente de 10:01 PDMS / cura e agita-se vigorosamente durante alguns minutos.
- Molde lugar Shrinky dink em uma pequena placa de Petri. Despeje a mistura PDMS até atingir cerca de 1 / 2 cm sobre a superfície do molde.
- Prato colocar sob sino de vácuo para eliminar todas as bolhas da mistura PDMS.
- Prato coloque no forno a 70 ° C, durante a noite.
- Cortadas PDMS sólidos de molde e vinculá-lo a uma lâmina de vidro apenas pela aplicação de pressão.
- Descartar primeiro micropoços-chip, uma vez que tem resíduos de tinta incrustada entre PDMS.
- Repita este procedimento para produzir um chip de segundo que é a tinta-livre e tem uma forma mais definida.
- Limpa micropoços-chip utilizando solução de etanol 70%. Colocá-lo sob fonte de luz UV durante 10 minutos para esterilizá-lo.
3. Células Trapping em micropoços
- Contagem de células e diluí-los em meios de cultura para a concentração desejada (dependendo do número de células iniciais em poços que gostaria). Por exemplo, para obter cerca de 10-15 células por poço (média = 11, DP = 5,4, taxa de carregamento = 93%), foi utilizada uma concentração de 8 × 10 4 células / ml. Para uma concentração de 17 × 10 4 células / ml, poderíamos obter de forma confiável entre 25 e 35 células por poço (média = 27,17857 DP = 7,7, taxa de carregamento = 100%).
- Cuidadosamente coloque chip de micropoços em um tubo de centrífuga de 50 ml contendo um solidificou base de PDMS.
- Adicionar cerca de 2JDP ml da solução celular.
- Centrifugar durante 5 minutos a 760 rpm e 4 ° C.
- Pipeta com excesso de solução e lavar cuidadosamente com PBS micropoços solução de 1X.
- Coloque em um prato de micropoços Petry pequeno, sendo cuidado ao tirar o chip para fora do tubo de centrifugação.
- Lavar o excesso de células usando um X solução PBS.
- Lugar de chips micropoços sob um microscópio invertido para verificar o número pretendido de células por poço.
- Incubar micropoços contendo células em condições normais.
4. Incubação de células
- Seguir o protocolo EB normal no laboratório.
- Mudar o meio devagar do lado da câmara; evitar a perturbação do celular na microplaca.
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Discussion
Nós desenvolvemos um método de cultura simples, rápida e escalável para carregar números pré-definidos de células em poços microfabricated (moldados a partir Shrinky-Dinks) e mantê-los para o desenvolvimento do corpo embrióides. Finalmente, essas células são facilmente acessíveis para posterior análise e experimentação. Este método é passível de qualquer laboratório e não exige equipamentos dedicados, porque evitaria a necessidade de fotolitografia. Podemos variar o tamanho dos poços, bem como a concentração de células / poços para alterar o número e tamanho dos corpos embrióides.
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Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a CIRM para apoiar este trabalho. A linhagem celular foi generosamente doado pelo Dr. Andras Nagy no Mount Sinai Hospital, Toronto, Ontário.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | |||
References
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- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
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