Summary
Biz microfabricated kuyu içine hücrelerin önceden tanımlı numaralar yüklemek ve embriyoid vücut gelişimi için onları korumak için basit ve hızlı bir yöntem gösteriyor.
Abstract
Embriyoid organları (EB), embriyonik kök hücrelerin agrega. Bu agrega oluşturarak en yaygın yolu, asılı damla yöntemi, kuyucuğu keyfi bir hücre sayısı pipetleme zahmetli bir yaklaşım. Birbirlerine yakın zorla kök hücreleri arasındaki etkileşimler EBS üretimi teşvik etmektedir. Kuyuların her medya her gün el değiştirebileceği sahip olduğundan, bu yaklaşımın elle yoğundur.
Ayrıca, aynı koşullar altında kültüre, hücre-hücre, hücre eriyen faktör etkileşimleri, pH ve oksijen kullanılabilirliği de dahil olmak üzere çevresel parametrelerin EB boyutu fonksiyonlar olabilir, çünkü, geleneksel asılı damla elde edilen hücre popülasyonlarının bile dramatik olarak değişebilir. Son çalışmalar gerçekten ilk sayıda toplu oluşturan hücrelerin kök hücre farklılaşması üzerinde önemli etkilere sahip olduğunu göstermiştir. Biz microfabricated kuyu içine hücrelerin önceden tanımlı numaralar yüklemek ve embriyoid vücut gelişimi için onları korumak için, basit, hızlı ve ölçeklenebilir bir kültür yöntemi geliştirdik. Son olarak, bu hücreler daha fazla analiz ve deney için kolayca ulaşılabilir. Bu yöntem, herhangi bir laboratuvar için uygun ve hiçbir özel ekipman gerektirir. Biz kırmızı floresan fare hücre hattı (129S6B6 F1) kullanarak embriyoid organları oluşturarak bu yöntemi göstermektedir.
Protocol
1. Shrinky-Dink Kalıp
- Istenilen desen iyi bir tanımı yazıcı kullanarak shrinky dink kağıda yazdırın.
- 163 derecede pişirin shrinky dink sac ° C, yaklaşık 10 dakika kadar veya tam olarak küçülür ve düzenli bir şekil kazanmış.
- Shrinky-dink kalıp soğuduktan sonra, bir izopropanol banyo batığın o tam bir yüzey ancak kaplıdır kadar.
- Dikkatle, kalıp üzerinde bazı aseton sprey ve kap birkaç kez sallayın. Daha izopropanol aseton aşırı yıkama ve shrinky kalıp temiz görünüyor kadar bu adımı birkaç kez tekrar ettiniz.
- Distile su içinde kalan organik çözücü yıkayın için 10 dakika süreyle daldırın kalıp.
- Hava temiz shrinky-kalıp. 163 yaklaşık 5 dakika boyunca yeniden ısı ° C Bu herhangi bir kalan solvent buharlaşması kompakt mürekkep ve.
2. PDMS mikro oyukların yapma
- 10:01 PDMS / sertleştirici karışımı hazırlayın, ve birkaç dakika kuvvetlice ajitasyon.
- Küçük bir petri kabına yerleştirin shrinky-dink kalıp. Kalıp yüzey üzerinde yaklaşık 1 / 2 cm ulaşıncaya kadar PDMS karışımı dökün.
- PDMS karışımı tüm kabarcıklarını ortadan kaldırmak için, vakum çan altında yer çanak.
- Yeri çanak fırında 70 ° C, gece boyunca.
- Kalıp katı PDMS kesilmiş ve sadece basınç uygulayarak bir cam slayt bağlamak.
- PDMS arasında süslü mürekkep kalıntılarının bu yana, ilk kuyu çip atın.
- Mürekkep ve daha tanımlı bir şekle sahip ikinci bir çip üretmek için bu yordamı yineleyin.
- Temiz kuyu-çip% 70 etanol çözeltisi kullanarak. Sterilize etmek için 10 dakika UV ışık kaynağı altında yerleştirin.
3. Mikro oyukların içinde Yakalama hücreleri
- Hücre sayımı ve istenen konsantrasyon (istiyorum kaç kuyularında ilk hücreleri bağlı olarak) kültür ortamı sulandırmak. Örneğin, yanı başına yaklaşık 10-15 hücreleri (ortalama = 11, SS = 5.4, yükleme hızı =% 93), 8 × 10 4 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon kullandı. 17 × 10 4 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon için, güvenilir hücreleri başına 25 ile 35 arasında (ortalama = 27,17857 SD = 7.7, yükleme hızı =% 100) alabilir.
- Kuyu çip katılaşmış bir PDMS baz içeren 50 ml santrifüj tüpüne dikkatlice yerleştirin.
- Hücreli çözüm 2JDP ml ekleyin.
- Santrifüj için 5 760 rpm'de dakika ve 4 ° C
- Aşırı çözüm pipetleyin ve dikkatle PBS 1X çözümü ile kuyu yıkayın.
- Santrifüj tüpüne çip alırken dikkatli olmak, küçük bir Petri kabı kuyu yerleştirin.
- 1 X PBS çözümü kullanarak hücre fazlalığı yıkayın.
- De ortalama hücre amaçlanan numarasını doğrulamak için bir inverted mikroskop altında kuyu çipi yerleştirin.
- Inkübe kuyu standart koşullar içeren hücreler.
4. Hücre inkübasyon
- Laboratuvar normal EB protokolü uygulayın.
- Yavaş yavaş odanın yan orta değiştirme; kuyu hücre rahatsız etmemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz microfabricated kuyuları (Shrinky-Dinks kalıplı), hücrelerin önceden tanımlı numaralar yüklemek ve embriyoid vücut gelişimi için onları korumak için, basit, hızlı ve ölçeklenebilir bir kültür yöntemi geliştirdik. Son olarak, bu hücreler daha fazla analiz ve deney için kolayca ulaşılabilir. Bu yöntem, herhangi bir laboratuvar için uygun ve fotolitografi için gerek bırakmayacak, çünkü hiçbir özel ekipman gerektirir. Biz embriyoid organlarının sayısını ve boyutunu değiştirmek için mikro oyukların boyutu yanı sıra hücre / kuyu konsantrasyon değişebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
CIRM Biz bu işi destek için teşekkür etmek istiyorum. Hücre hattı cömertçe, Toronto Mount Sinai Hastanesi Dr. Andras Nagy bağışlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | |||
References
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).
- Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies. J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).
- Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Controlled differentiation of stem cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).
- Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media. Development. 129, 539-549 (2002).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. J Transl Med. 4, (2006).
