Een Chromatine Assay voor menselijk hersenweefsel

Summary

Tot voor kort werden expressie studies over menselijke hersenen beperkt tot de kwantificering van RNA of eiwit. Met de chromatine immunoprecipitatie technieken beschreven in dit document, zal het mogelijk zijn om histon-methylatie en andere epigenetische regulatoren van genexpressie in postmortem hersenen kaart.

Abstract

Chronische neuropsychiatrische aandoeningen zoals schizofrenie, bipolaire aandoeningen en autisme men denkt dat het gevolg zijn van een combinatie van genetische en omgevingsfactoren die zouden kunnen resulteren in epigenetische veranderingen in genexpressie en andere moleculaire pathologie. Traditioneel waren echter expressie studies in postmortem hersenen beperkt tot de kwantificering van mRNA of eiwit. De beperkingen aangetroffen in postmortem hersenonderzoek zoals variabiliteit in de tijd autolyse en weefsel integriteiten zijn waarschijnlijk ook alle studies die van hogere orde chromatine structuren impact. Echter, de nucleosomale organisatie van genomisch DNA met inbegrip van DNA: kern histon-binding - lijkt grotendeels bewaard in representatieve monsters als bedoeld door verschillende hersenen banken. Daarom is het mogelijk de studie van de methylatie patroon en andere covalente modificaties van de kern histon-eiwitten op bepaalde genomische loci in postmortem hersenen. Hier presenteren we een vereenvoudigde inheemse chromatine immunoprecipitatie (NChIP) protocol voor bevroren (nooit-vast) menselijke hersenen exemplaren. Te beginnen met micrococcal nuclease vertering van hersenhomogenaten, NChIP gevolgd door qPCR kan worden afgerond binnen de drie dagen. De methodologie hier gepresenteerde moet nuttig zijn om epigenetische mechanismen van genexpressie te helderen in normale en zieke menselijke brein.

Protocol

Procedure:

1 ^ste dag

1. Homogeniseren 50-500 mg van bevroren post-mortem grijze massa weefsel met Douncing Buffer.

! LET OP - Human weefsel moet met zorg worden behandeld onder strikte veiligheidsvoorwaarden. Het moet mogelijk worden behandeld BSL-2 of hoger veiligheidsnormen.

1. Neem eerder ontleed, post-mortem brain van -80 ° C, ze dounce in 5X hersenvolume van Douncing Buffer, en plaats in 2,0 mL microcentrifugebuis. Matched monster en controle paren zijn gelijktijdig verwerkt.

2. Micrococcal Nuclease (MN) Spijsvertering

1. Voeg 5U/mL van Micrococcal nuclease aan het monster en mix in de oplossing door en neer te pipetteren voordat u op ijs.
   * Cruciale stap - Het is belangrijk om deze stap te snel te doen, omdat MN heeft de mogelijkheid om op te treden bij zelfs 4 ° C.
2. Incubeer monsters gedurende 7 minuten bij 37 ° C.
3. Na de 7 minuten incubatie, voeg 0,5 M EDTA tot een concentratie van 10mm tot de MNase activiteit te stoppen.

3. Hypotonisation

1. Leg monsters in een 15 ml Falcon buis. Voeg 10X het monster volume van 0,2 mm EDTA, 1 / 2000 monstervolume van 0,2 M benzamidine en 1 / 1000 monstervolume van 0,1 M phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF). De laatste twee verbindingen worden gebruikt als proteaseremmers.
   * Cruciale stap - Het is belangrijk om de monsters te houden op ijs gedurende al deze stappen.
2. Incubeer steekproef voor een uur, terwijl de vortexen het elke 10 minuten.
3. Aan het eind van het uur lange incubatietijd, voeg 1 / 2000 monstervolume van 3M DTT, nog een andere proteaseremmer.
4. Vortex monster nogmaals en centrifugeer bij 3175 RCF gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
   * Optionele stap - Precleansing met Proteïne G Agarose.
   1. Neem supernatant en zet in de nieuwe 15 ml Falcon buis.
   2. Voeg 500 ul van Proteïne G Agarose.
   3. Draaien bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
   4. Centrifugeer bij 4000 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C.
5. Verdeel supernatant zodat 500 pL worden gebruikt als input-controle (met alleen genomisch DNA), en de rest wordt verdeeld in twee buizen met 1600 pi van het monster per stuk - die bestemd zijn voor chromatine immunoprecipitatie (ChIP) monsters.
6. De Input controle is geplaatst bij -80 ° CO / N tot gebruik.
7. Om de chip monsters - toe te voegen 01:10 volume van de 10XFSB en 4μg van antilichaam, dan vortex de monsters en draai ze op 4 ° C gedurende de nacht.
   ! LET OP - Bedrag en verdunning van antilichamen kan verlangen optimalisatie.

^2e dag

! LET OP! - 2 ^e dag Begin met het wassen van de Protein G Agarose die zal worden gebruikt om nucleosomale DNA te isoleren. Aangezien de agarose parels zijn erg gevoelig, is het noodzakelijk af te snijden van de hoofden van de tips, wanneer pipetteren elke oplossing die agarose kralen.

1. Indringende Proteïne G Agarose Beads naar DNA

1. Voeg 1,6 mL 1XFSB tot 245 pi eiwit G-agarose (genoeg voor 4 buizen) in een 2 ml microcentrifugebuis (lus).
2. Scheid de oplossing in twee 2 ml tubes en vul elk tot 1,6 ml met 1X FSB.
3. Roteren met RT voor 30 seconden en centrifugeer bij 0,1 RCF gedurende 30 sec.
4. Verwijder de bovenstaande vloeistof met behulp van een vacuüm.
5. Voeg 1,6 ml 1X FSB weer. Draai de monsters gedurende 30 seconden en centrifugeer op 0,1 RCF gedurende 30 sec.
6. Verwijder de bovenstaande vloeistof weer, en combineer beide buizen met 1,5 ml 1XFSB.
7. Voeg 15 uL gesoniceerd zalmsperma DNA (10mg/mL).
   ! LET OP - Deze stap moet in principe, te verminderen niet-specifieke binding van de immunoprecipitaat aan de kralen. Echter, dit ook kan leiden tot valse positieven voor een aantal van de (menselijke) DNA-sequenties.
8. Draaien bij RT gedurende 30 min, centrifugeer bij 0,1 RCF gedurende 30 sec.
9. Verwijder het supernatant. Voeg 200 ul van 1XFSB.
10. Voeg 90 ul van agarose parels in elke ChIP monster. Draaien bij 4 ° C gedurende 1 uur.
11. Voeg 1 ml van 1XFSB in de resterende agarose parels om te dienen als een negatieve controle en op 4 draaien ° C gedurende 1 uur.
12. Na de uren lange incubatie, centrifuge de monsters en negatieve controle op 0,1 RCF gedurende 30 sec. Giet het supernatans af.

2. Wassen van de Beads

! LET OP! - Wassen buffers moeten worden bewaard bij 4 ° C tot gebruik, en moeten alleen worden gebruikt als zijn minder dan een maand oud.

1. Voeg 1 ml van elk wassen oplossing voor de kralen en draaien voor 3 min bij RT.
2. Centrifugeer bij 0,1 RCF gedurende 30 sec.
3. Gooi supernatant met behulp van vacuüm.

* Elke wasoplossing

- Lage zout wasbuffer

- Hoge zout wasbuffer - Lithium-oplossing - alleen draaien op RT gedurende 1 minuut!

- TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH = 8)

3. Elutie

* Kritische stap - het maken van verse elutiebuffer voor elk experiment op de dag het is om te worden gebruikt.

1. Voeg 250 ul van vers bereide elutiebuffer aan elk monster.
2. Roteren gedurende 15 min bij RT, centrifugeer met 0,4 RCF gedurende 1 minuut.
3. Sla de bovenstaande vloeistof in een 2,0 ml microcentrifugebuis (Loop).
4. Voeg 250 ul van elutiebuffer aan elk monster en de vortex met de hand voor een paar seconden. Dan, vortex monsters gedurende 15 minuten op een mulitvortexer.
5. Centrifugeer bij 16 RCF rpm gedurende 4 minuten en op te slaan supernatant in dezelfde 2,0 ml tube (Loop).

4. Digest Protein

1. Voeg 10 ul 0.5M EDTA, 25 pi 0,8 M Tris-HCl, pH 6,5, 10 mg / ml proteïnase K (1 / 200 sample) toe aan elk ChIP monster.
2. Aan elke ingang controle, toe te voegen lysis buffer voor proteinase K spijsvertering (1 / 10 van het monster buffer) en 10mg/ml Proteinase K (1 / 200 van het monster buffer).
3. Incubeer Input en Chip monsters in 52 ° C gedurende ten minste drie uur.

5. Fenol / chloroform extractie

! LET OP - Experiment waarbij fenol / chloroform moeten worden uitgevoerd onder de motorkap. Gebruik nitril handschoenen bij het hanteren van fenol / chloroform.

1. Na de 3 uur incubatie, voegen we de 500 ul fenol-chloroform aan elk monster.
2. Vortex alle monsters gedurende enkele seconden, centrifugeer bij 13 RCF rpm gedurende 5 minuten.
3. Op dit punt, zullen twee fasen aanwezig zijn en wij zijn geïnteresseerd in de inhoud van de bovenste fase. Haal de bovenste fase en zet het in een 2 ml microcentrifugebuis.
4. Voeg een mengsel van 2μL van glycogeen en 50μL van 3M natriumacetaat toe aan elk monster, samen met 1.375 ml 100% ethanol.
5. Vortex alle monsters krachtig. Plaats ze in de -80 ° C gedurende de nacht.

^3e dag

1. Verwijder de monsters vorm -80 ° C en plaats ze op ijs voor ze te ontdooien.
2. Centrifugeer bij 15 RCF gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
3. Voorzichtig supernatans verwijderen zonder de pellet te verstoren op de bodem van de buis.
4. Voeg 1 ml koude 75% ethanol aan elk monster, keer dan ze 4-6 keer.
5. Centrifugeer bij 18 RCF gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
6. Verwijder supernatant nog eens en laat de pellets aan de lucht drogen.
7. Los gedroogde pellets in 50 ul van 4mm Tris-HCl, pH8 en bewaar bij -80 ° C tot verder gebruik.

Discussion

Het protocol hier beschreven is vooral handig voor onderzoekers geïnteresseerd zijn in histon-en / of DNA-methylatie handtekeningen van menselijke hersenen, omdat deze chromatine markeringen mogen, indien minder gevoelig is voor postmortale artefacten in vergelijking met andere types van wijzigingen, inclusief (histonen) acetylering en fosforylatie ^{1, 2.} Het postmortem hersenen vatbaar is voor de studie van de mono-nucleosomale preparaten; het DNA blijft grotendeels aan de kern van histonen, althans in exemplaren met een representatieve autolyse intervallen (de tijd tussen de dood en het bevriezen / opslaan van het weefsel), meestal in het bereik van enkele uren tot 1,5 dagen ^1. Kan echter mono-nucleosomale voorbereidingen gevoelig zijn voor veranderingen in nucleosomale positionering en dichtheden, met name rond sequenties omringende transcriptie startplaatsen van genen ^3. Daarom moet controle-experimenten met modificatie-onafhankelijke anti-histon-antilichamen worden opgenomen. Als alternatief kan het mogelijk zijn om poly-nucleosomale fracties te isoleren van menselijke brein extracten, met behulp van een kortere incubatietijd voor de micrococcal nuclease verteren in combinatie met extra zuiveringsstappen (incl. ultracentrifugatie). Ten slotte is een recente studie over genome-wide transcriptiefactor verbindend in al postmortem hersenen gewoon geschoren chromatine via sonicatie ^4. Met name kan het opstellen van chromatine door fixatie voorafgaand aan sonicatie of enzym-gebaseerde vertering niet ideaal zijn vanuit het oogpunt van postmortem studies, omdat de afbraak-en / of kunstmatige herconfiguratie van hogere orde chromatine structuren na de dood van zijn potentiële verwart moeilijk te controleren voor. Vandaar dat ChIP assays op postmortem hersenen zijn waarschijnlijk bruikbaar zijn voor een beperkt aantal moleculen, waaronder nucleosomale kern histonen en andere eiwitten stevig bevestigd aan de genomische DNA. Zelfs met dit voorbehoud rekening gehouden met de benaderingen die in deze presentatie zullen waarschijnlijk tot nieuwe inzichten te verschaffen in chromatine-geassocieerde mechanismen die neuronale en gliale functies in de normale en zieke menselijke brein.

We hebben gebruik gemaakt van deze techniek met succes in de eerste plaats voor het meten van histon-methylatie en histon bezettingsgraden op specifieke promotors met behulp van gen-gen door qPCR ^{1, 5, 6.} Zoals eerder vermeld het menselijk brein postmortem lijkt te zijn ontvankelijk voor de studie van de mono-nucleosomale bereidingen omdat het DNA blijft grotendeels aan de kern van histonen. Typisch, bij het starten met 75 mg van het menselijk kind of volwassene cerebrale cortex (grijze stof) kan men verwachten dat het gebruik van de hierboven gepresenteerde protocol-een rendement van 20-30 ng / ul in een totaal volume van 50 ul voor de Input en 10-15 ng / ul in een totaal volume van 50 ul voor Chip, tenminste als modificatie specifieke anti-histon-antilichamen worden gebruikt. De zogenaamde chip Input-ratio is de eenheid van de maatregel. Specificiteit van de reactie wordt gecontroleerd door smeltcurve analyse, gelelektroforese, en sequencing. Bovendien negatieve controles (i) die niet over de specifieke antilichamen of (ii) met (niet-specifieke) immunoglobuline dient verwerkt door qPCR worden parallel aan de chip en Input monsters en mogen niet resulteren in specifieke product. Wees ervan bewust dat wanneer zalmsperma wordt gebruikt als een blokkerend middel, controlemonsters kan resulteren in een uitstrijkje bij het lopen op een gel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	EMD Millipore	9310
Magnesium Chloride Hexahydrate	OmniPur, EMD Millipore	5980
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C614-3
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0	OmniPur, EMD Millipore	4055
Sodium Chloride	Mallinckrodt Baker Inc.	7581-06
SDS Solution 10% (w/v)	Bio-Rad	161-0416
Triton X-100	Fluka	93426
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I-3021
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-25G
Lithium Chloride	Sigma-Aldrich	L9650-100G
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S7277-250G
Sodium Acetate (anhydrous)	Sigma-Aldrich	S-2889
Nuclease micrococcal from Staphylococcus	Sigma-Aldrich	N3755-200UN
Benzamidine	Fluka	12072
Phenylmethanesulfonylfluoride	Sigma-Aldrich	P7626-1G
3M DTT	Fluka	43815
Protein G Agarose, Fast Flow	Upstate, Millipore	16-266
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit	Stratagene, Agilent Technologies	201190
Proteinase K from Engyodontium album	Sigma-Aldrich	P2308
Phenol:Chloroform 1:1	OmniPur, EMD Millipore	6810
Glycogen, From Mussels	Sigma-Aldrich	G1767-1VL
Ethyl Alcohol (200 Proof)	Pharmco-AAPER	111000200
Solutions: nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5 Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5 Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.