Summary
Deze video laat zien hoe menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) groeien op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-cellen. Deel 1 van 3.
Abstract
Deze video laat zien hoe menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) groeien op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-cellen.
Protocol
Splitsen van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) uitgeplaat op muis embryonale fibroblasten (MEF)
Meestal een confluente hESC plaat kan worden gesplitst 1u06-01u10, afhankelijk van de specifieke hESC lijn. De splitsing plaat zal weer samenvloeiing 5-7 dagen na het splitsen.
- Twee dagen voor de splitsing, gelatineren platen met behulp van een 0,1% gelatine-oplossing. Voor een 6-wells plaat, voeg 2 ml in elk putje en incubeer plaat in een 37 ° C, 5% CO 2 weefselkweek incubator 's nachts.
- Plaat MEF op ontsloten 6-well platen de dag voordat u van plan op de splitsing van de hESC 's. (NB: MEFs kunnen worden uitgeplaat zoveel als drie dagen eerder, indien nodig na ~ 3 dagen, MEFs worden vlakker en meer verspreid-out en kan niet in stand hESC 's en frisser MEFs kunnen..) Neem een flesje van de g-bestraald of mitomycine C die werden behandeld CF1 MEFs, met 5-6 x 10 6 cellen, uit vloeibare stikstof en ontdooien gedurende 2 minuten in een 37 ° C waterbad. Een keer wassen cellen met warm MEF Cultuur Media in een 50 ml Falcon buis en resuspendeer in het uiteindelijke volume van de warme MEF Cultuur Media. Op 5-6 x 10 6 cellen, is dit voldoende om bord twee of drie 6-well platen.
- Terwijl de MEF wordt gewassen, neem de gegelatineerd borden, verwijder alle oplossing uit de putten en voeg 2,5 ml van MEF Cultuur Media per well.
- Voeg 0,5 ml van MEF suspensie per goed te bereiken 3 ml als een laatste volume in elk putje. Zorg ervoor dat MEF zijn gelijkmatig verspreid en terug te plaatsen borden in de incubator 's nachts om zich te vestigen.
- Op de dag van hESC te splitsen, voor te bereiden vers of gebruik <2 weken oude steriele collagenase IV oplossing bij 1mg/ml. Verwijder al het papier uit de hESC bronnen u wilt splitsen, een keer wassen met 2 ml per putje van de warme 1 × PBS, pH 7,4, en voeg 1 ml collagenase IV oplossing. Incubeer bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten. Neem de 6-well hESC plaat uit de incubator en voeg 1 ml van ES media (zonder bFGF) aan elk putje. Met behulp van de oplossing in elk putje, met een 1 ml pipet opzuigen van de media en blaas de stamcellen af van de plaat. Voor elke goed deze duurt ongeveer 5 tot 10 herhalingen. Dan overdracht van de geschorste hESC 's in een 50 ml falcon buis. Doe dit voor al de putten, die splitsen en combineren in een 50 ml falcon buis. Pellet de hESC 's bij kamertemperatuur op 200 g gedurende 5 minuten en was een keer met ES media ontbreekt bFGF.
- Terwijl de hESC 's worden gewassen, neem de MEF borden, verwijdert u alle media uit de wells en was een keer met steriel, warm 1 × PBS, pH 7,4 voeg vervolgens 2,5 ml van ES media (nu aangevuld met 10 ng / ml bFGF) per goed.
- Resuspendeer de gepelleteerde hESC 's in een geschikt volume van ES media, aangevuld met 10ng/ml bFGF. (LET OP:.. Als de hESC 's zijn geresuspendeerd, ze moeten van ongeveer uniform kolonie grootte en vorm De resuspensie volume is afhankelijk van de splitsing ratio) voorzichtig pipet de hESC vering op en neer een paar keer om de kolonies kleinere en meer uniforme, maar niet zo veel, dat enkele cellen of zeer kleine kolonies worden gegenereerd. Voeg 0,5 ml van hESC suspensie per goed aan de MEF platen tot 3 ml bereiken als een uiteindelijk volume in elk putje. Een visuele controle om ervoor te zorgen dat de hESC 's gelijkmatig worden verdeeld voor het plaatsen van de borden terug in de incubator' s nachts om zich te vestigen. Na plating, zal het meestal een paar dagen voor de kolonies te nemen op hun karakteristieke vorm en de grens uiterlijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze video laat zien hoe menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) groeien op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-cellen. In de laatste stap vóór plating, wanneer de hESC 's zijn geresuspendeerd, moeten zij worden van ongeveer uniform kolonie grootte en vorm. Voorzichtig pipet de hESC vering op en neer een paar keer om de kolonies kleiner en meer uniform, maar niet zo veel, dat enkele cellen of zeer kleine kolonies zijn generated.Immunofluorescence vlekken en microscopie of flowcytometrie voor hESC pluripotentie markers, zoals Oct- 4 en SSEA-4, zijn nodig om het onderhoud van hESC 's in een ongedifferentieerde staat tijdens de cultuur te bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Menselijke embryonale stamcellen studies in de Teitell lab worden ondersteund door een Californische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde (CIRM) Seed Grant RS1-00313. Wij danken de leden van de globale Centrum voor Regeneratieve Geneeskunde en Stamcelonderzoek aan de UCLA, in het bijzonder Dr Amander Clark, Dr Jerome Zack, en leden van de UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility voor hun steun aan onze studies.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science . 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).
