Summary
이 비디오에서는, 우리는 인간의 배아 줄기 세포의 mitochondrial 호흡 체인 단지가 겔 활동 assays 사용하여 분석할 수있는 방법을 보여줍니다.
Abstract
Mitochondria 세포질 세포의 대사 및 항상성에 주요 역할을 organelles, 세포 신호 네트워크의 규제 및 프로그램 세포 사망 있습니다. Mitochondria 생산 ATP는 세포질 산화 환원 상태와 Ca2 + 균형을 조절 지방산을 catabolize, 헴, 세포핵, 스테로이드 호르몬, 아미노산을 합성하고, 단백질의 철 - 유황 클러스터를 조립 도움이됩니다. Mitochondria는 열 생산에 필수적인 역할을했습니다. mitochondrial 게놈의 변이는 인간의 장애 여러 종류의 원인이됩니다. mtDNA 변이의 축적이 노화와 상호 및 암의 개발에 중요한 역할을 가지고 의심됩니다. 모든 세포 유형에서 극히 중요한 역할로 인해, mitochondria의 기능은 또한 줄기 세포에 중요합니다. 주요 진보는 줄기 세포 생존, 증식 및 분화 능력에 대한 우리의 이해에되었습니다. 그러나 줄기 세포의 기능 활동은, 특히 그들의 에너지 상태, 아직 자세히 연구되지 않았습니다. 거의 아무것도 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)와 그들의 차별화된 전구체 자손의 mitochondrial 속성에 대한 알려진되지 않습니다. hESC 기능과 발달 가능성에 mitochondria의 역할을 이해하고 평가하는 한 가지 방법은 직접 mitochondrial 호흡 단지의 활동을 측정하는 것입니다. 여기, 우리는 hESCs의 다섯 호흡기 체인 단지를 분석하는 방법으로 젤 활동 시각화의 고해상도 명확한 기본 겔 전기 영동과 이후에 대해 설명합니다.
Protocol
Mitochondrial 콤플렉스에 대한 고해상도 네이티브 클리어 젤 Electophoresis (hrCNE)가 인 - 젤 활동 Assays
인간 배아 줄기 세포 (hESCs)은 다음 표준 약관을 사용 MEF - 냉방 중간에 5 일 동안 Matrigel에서 성장으로 전환 ˠ - 조사 또는 mitomycin C - 대우 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)의 monolayer에서 유지 관리되었습니다. MEFs 오염을 제거하려면, hESCs는 Matrigel에 다시 도금 및 추가 3 일간 MEF - 냉방 매체 성장했다. pluripotency 마커 월 4 SSEA - 4 Immunofluorescence 현미경은 hESC 차별 부족을 확인하는 데 사용되었다.
- 5 분 trypsinization (6 잘 플레이트에 따라 잘 1ml 1X의 트립신) 다음 따뜻한 1X PBS, pH를 7.4와 세포를 씻으십시오.
- 신선한 트립신 억제제의 동일한 음량을 (1X PBS, pH를 7.4에서 1mg/ml) 추가합니다. 200g에 수확 세포와 원심 분리기, 5 분, 실온.
- 신선한 1 '테아제 억제제 칵테일과 함께, 1.7ml (세포 펠렛의 크기에 따라) 얼음 차가운 mitochondria 절연 버퍼 (6.6mM 이미다졸 / HCL, pH를 7.0 83mM 자당)의 - 0.8에서 뜨는 및 resuspend pelleted 세포를 폐기하십시오. 10 분 얼음에 품어.
- 균 질기 (- 50 치기 ~ 40)와 세포를 다운스. 가벼운 현미경을 사용하여 균질의 완전성을 확인 trypan 파랑과 dounced 세포의 나누어지는 스테인.
- 4 10 분 2만그램에서 원심 분리기 ° C 또한 핵 및 큰 세포 조각이 들어있는 원유 mitochondrial 펠렛을 얻을 수 있습니다. 가만히 따르다가와 뜨는을 버리고 시켰던 원유 mitochondrial 펠렛의 무게. 펠렛은 -80에 저장할 수 있습니다 ·이가 멈추는 지점있다면 C 액화 질소에 즉시 냉동에 따라.
참고 : 차등 원심 분리 또는 기타 그라디언트 기반 절차가 순수한 mitochondrial 막 분획을 분리하고 수집하기 위해 사용될 수 있습니다. 심판을 참조하십시오. 자세한 내용은 4. 이러한 대체 방법은 mitochondrial 단백질 대신 세포 중량 또는 휴대폰 번호의 MG 당 복잡한 활동의 MG 당 mitochondrial 복잡한 활동을 얻을 것입니다. mitochondrial 단백질의 농도는이 비교를하기 위해 정화 후 결정이 필요합니다. 또한, 다른 절연 버퍼이 접근 방식이 필요할 수 있습니다. 순수 mitochondrial 막 분획의 solubilization 들어, 아래의 단계 6 다음의 참고를 참조하십시오. - 얼음 차가운 solubilization 버퍼 (50mM NaCl, 50mM 이미다졸 / HCL 산도 7.0, 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 2mM 6 aminohexanoic 산성)과 vortexing하여 얼음에 원유 mitochondrial 펠렛을 Solubilize. 6 - aminohexanoic 산성은 1X 테아제 억제제 칵테일로 교체할 수 있습니다. 펠렛 중량의 20mg 당 solubilization 버퍼의 35μl를 사용하십시오. 10% 펠렛 중량 및 튜브를 flicking하여 믹스 20mg 당 W / V digitonin의 20μl를 추가합니다. 얼음 5-10 분 알을 품다. Dodecyl - BD - maltoside 또는 트리톤 X - 100은 단백질을 solubilize하는 digitonin에 대한 대체하실 수 있습니다. 세제 및 수량의 선택은 supercomplexes 또는 mitochondrial 단지의 multimeric 형태의 형성에 영향을 줄 수 있습니다. 자세한 내용은 ref.1를 참조하십시오.
참고 : 순수한 mitochondrial 막 분획을 solubilize에 필요한 세제의 수량 2~6그램 / G. 이르는 세제 / 단백질 무게 비율에 해당하는 mitochondrial 세포막을 solubilize하는 최적의 비율이 dodecyl - BD - maltoside에 대한 G / 2.5G이며, 대한 3g / G 트리톤 X - 100과 6g / digitonin에 대한 g. - 4 15 분 ° C.에 대한 10만그램에서 solubilized 펠릿을 원심 분리기 맑은 뜨는를 수집합니다.
- 최종 5% W / V 글리세롤과 0.01 % W / V 개양귀비빛의 S (50 % W / V 글리세롤, 0.1 % W / V 개양귀비빛의 S 로딩 버퍼 재고 솔루션을 사용)에 버퍼를 로드할 추가합니다.
- 레인 당 원유 mitochondrial 펠릿 20 - 40mg이 들어있는 볼륨 젤 우물을로드합니다. 3.5 %가 젤 스태킹있는 아크릴 아미드 기울기 젤 (4 -13 %)를 사용합니다.
참고 : 젤 준비와 전기 영동 조건 :
bisacrylamide의 아크릴 아미드와 1.5g (49.5 % T, T는 AA와 bisAA와 C의 총 농도는 3% C.가의 48g : 겔 준비, 다음과 같은 아크릴 아미드 / 비스 - 아크릴 아미드 (AA / bisAA) 3 믹스를 사용하여 총 단량체로 crosslinker (bisAA)의 비율).
젤 버퍼 (3 ') : 1.5M 6 - aminohexanoic 산성, 75mM 이미다졸, 산도 7.0
| 그라데이션 젤 : | 4퍼센트 | 13% | 젤 스태킹 : | 3.5 % |
| AA / bisAA 세 믹스 | 2 ML | 6.5 ML | 0.6 ML | |
| 젤 버퍼 3 ' | 8.3 ML | 8.3 ML | 2.7 ML | |
| 글리세린 | 5g | |||
| H 2 O | 14.7 ML | 5 ML | 4.7 ML | |
| 총 부피 | 25 ML | 25 ML | 8 ML | |
| 10 % APS | 139 μl | 125 μl | 67 μl | |
| TEMED | 14 μl | 12.5 μl | 6.7 μl |
양극 버퍼 : 25mM 이미다졸 / HCL, pH를 7.0
음극 버퍼 : 50mM Tricine, 7.5mM 이미다졸 / HCL, 0.02 % W / V dodecyl - BD - maltoside, 0.05 % W / V deoxycholate, 산도 7.0
기름을 붓고 감기 방 (4-7 ° C)에서 젤을 실행합니다. 사용되는 초기 전압은 100V입니다. 예제는 스태킹 젤 입력되면, 전압은 15mA (0.15 '14'14 cm 젤)로 현재 제한과 500V 증가합니다. 전기 영동은 붉은 개양귀비빛의 S 염료의 날카로운 라인이 젤 전면에 접근 3-4 H 후에 중지됩니다. 또는 젤은 70 100V에서 일정한 전압 밤새 실행할 수 있습니다.
- 인 겔 활동 assays. 각 분석에 대한 부화의 시간은 단백질 solubilization의 효율성과 잘 당 로드된 자료의 양에 따라 달라집니다. 단지 I, IV 및 V는 일반적으로 단지 II 및 III보다 강한 신호를 얻을 수 있습니다.
콤플렉스 I (CI)
몇 시간 동안 실온에서 CI 버퍼 (2.5mg/ml NBT,, 0.1mg/ml NADH 5mM 트리스 - HCL, pH를 7.4)로 겔 슬라이스를 품어.
CI 버퍼 : 5mM 트리스 - HCL, pH를 7.4의 100ml 당 추가 :
0.01g NADH
0.25g NBT
15-45 분의 50 %와 10 %의 메탄올 초산에서 젤 수정. 고정 젤은 10% 초산에 보존되어 있습니다.
콤플렉스 II (CII)
몇 시간 동안 실온에서 CII 버퍼 (5mM 트리스 - HCL pH는 7.4, 0.2mM phenazine의 methasulfate,, 2.5mg/ml NBT succinate 20mM 나트륨)로 겔 슬라이스를 품어.
CII 버퍼 : 5mM 트리스 - HCL, pH를 7.4의 100ml 당 추가 :
200μl 1M 나트륨 succinate
80μl의 phenazine의 methasulfate (250mM PMS는 DMSO에 용해)
0.25g NBT
처럼 복잡한에 대한 설명 젤 수정
콤플렉스 III (CIII)
상온에서 몇 시간 동안, CIII 버퍼 (0.05 % 3,3 '- diaminobenzidine의 tetrahydrochloride (DAB) 50mM 인산 나트륨, 산도 7.2)로 겔 슬라이스를 품어.
CIII 버퍼 : 50mM 인산 나트륨, 산도 7.2 100ml 당 추가 :
50mg의 diaminobenzidine의 tetrahydrochloride
처럼 복잡한에 대한 설명 젤 수정
콤플렉스 IV (문학)
몇 시간 동안 실온에서, 문학 버퍼 (0.05 % 3,3 '- diaminobenzidine의 tetrahydrochloride (DAB), 50μM 말을 마음 시토크롬 C 50mM 인산 나트륨, 산도 7.2)로 겔 슬라이스를 품어.
문학 버퍼 : 50mM 인산 나트륨, 산도 7.2 100ml 당 추가 :
50mg의 diaminobenzidine의 tetrahydrochloride
0.1g 말을 마음 시토크롬 C
처럼 복잡한에 대한 설명 젤 수정
콤플렉스 V (CV)
CV 버퍼 (35 밀리 트리스베이스, 270mM 글리신, 25 pH를 8.3 ° C, 14mM MgSO 4, 0.2 % W / V PB (NO 3) 2, 필름 ATP) 몇 시간 동안 실온에서.로 겔 슬라이스를 품어
CV 버퍼 : 솔루션의 당 100ml 추가 :
| 트리스베이스 | 0.424g |
| 글리신 | 2.026g |
| MgSO 4 | 0.345g |
| PB (NO 3) 2 | 0.29g |
산도를 (8.3 있어야합니다) 조정 필요 - 산성이나베이스를 사용하지 마십시오. 필터 추가
| ATP | 0.441g |
30 분 50 % 메탄올에서 젤를 수정하고 물을 전송할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 비디오에서는, 우리는 인간의 배아 줄기 세포, 높은 해상도 명확한 기본 겔 전기 영동 (hrCNE)하여 분리하고, 인 겔 촉매 활동 assays에 의해 이후의 분석에서 mitochondrial 단백질 단지의 추출을 설명합니다. hrCNE 파란색 기본 겔 전기 영동의 비교 해상도 mitochondrial 막 단백질 단지를 해결 및 - 겔 활동 assays를위한 우수합니다. 이 기술은 mitochondrial 호흡 단지 IV를 정할뿐만 아니라 hESCs과 그들의 유도체 자손 모두에 어떤 mitochondrial 막 단백질 복합의 subunit 구성을 분석할뿐만 아니라 고용 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Teitell 연구소에서 인간 배아 줄기 세포 연구는 현재 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM) 씨앗 부여 RS1 - 00313에 의해 지원됩니다. 우리는 이러한 추가적인 연구에 조언과 통찰력을 제공하는 박사 칼라 쾰러 (UCLA)와 쾰러 실험실 구성원 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | adjust pH to 8.0 with NaOH |
| 1M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500MG | |
| 1M Sodium succinate | Fisher Scientific | S413-500 | |
| 0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2 | Fisher Scientific | BP332-1 and BP329-1 | Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C |
| 1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH) | EMD Millipore | 9010 | store at 4 C |
| 1M imidazole/HCl, pH 7.0 | Sigma-Aldrich | I-2399 | store at 4 C |
| 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| 20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM) | Fluka | 44205-500MG | Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C. |
| 10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization) | Fluka | 37008-1G | Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use. |
| 2M 6-aminohexanoic acid | Fluka | 07260-100G | store at 4 C |
| 10x Ponceau S/glycerol stock solution | Sigma-Aldrich | P-3504 and G6279-1L | 0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water. |
| 10% w/v sodium deoxycholate | Fluka | 30970-25G | Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature. |
| 250 mM phenazine methasulfate (PMS) | TCI America | P0083 | Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C. |
| Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Amresco | 0329-1G | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | TCI America | D0078 | |
| Pb(NO3)2 | Fisher Scientific | L62-100 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G45-212 | |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383-5G | Grade I, minimum 99% |
| beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form | Sigma-Aldrich | N-8129 | |
| Cytochrome c From horse heart | Sigma-Aldrich | C2506-250MG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| 100x protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Store at – 20 C. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | |
| 10x Trypsin (0.5%) | GIBCO, by Life Technologies | 15400-054 | |
| Trypsin Inhibitor | GIBCO, by Life Technologies | 17075-029 |
References
- Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).
- Castle, J. D. Purification of Organelles from Mammalian Cells. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).
