अलगाव और अपरा से hematopoietic स्टेम सेल का विश्लेषण

Summary

हम विकास के दौरान एक प्रमुख hematopoietic अंग के रूप में नाल की पहचान की है. हमने पाया है कि hematopoietic स्टेम सेल (HSCs) दोनों उत्पन्न कर रहे हैं और अद्वितीय microenvironmental niches में नाल में विस्तार. यहाँ, हम प्रयोगात्मक अलगाव और माउस नाल में HSCs के दृश्य के लिए आवश्यक तकनीक का वर्णन.

Abstract

Hematopoietic स्टेम सेल (HSCs) आत्म नवीनीकृत और एक व्यक्ति की जीवन भर खून प्रजातियों के सभी प्रकार की कोशिकाओं को उत्पन्न करने की क्षमता है. सभी HSCs भ्रूण विकास के दौरान उभरने, जो अपने पूल के आकार के बाद स्वयं renewing सेल डिवीजनों के द्वारा बनाए रखा है. HSCs और महत्वपूर्ण विकासात्मक घटनाओं HSC विकास की प्रक्रिया को विनियमित करने के संरचनात्मक मूल की पहचान के रूप में कई संरचनात्मक साइटों भ्रूण hematopoiesis के दौरान भाग लेने के जटिल है. हाल ही में, हम एक प्रमुख hematopoietic अंग जहां HSCs उत्पन्न होते हैं और अद्वितीय microenvironmental niches में विस्तार (Gekas, एट अल, 2005 रोड्स, एट अल 2008) के रूप में नाल की पहचान की. नतीजतन, अपरा उनके उद्भव और प्रारंभिक विस्तार के दौरान एक HSCs की एक महत्वपूर्ण स्रोत है.

इस अनुच्छेद में, हम E10.5 और E12.5 भ्रूण, HSCs की दीक्षा और नाल में HSC पूल के आकार में चोटी के विकास के चरणों के लिए इसी, क्रमशः से murine नाल के अलगाव के लिए विच्छेदन तकनीक दिखा. इसके अलावा, हम वर्तमान प्रवाह cytometry या कार्यात्मक assays में उपयोग के लिए एकल कक्ष निलंबन में placental ऊतक के enzymatic और यांत्रिक हदबंदी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल. हमने पाया है कि नाल के एकल कक्ष निलंबन के लिए collagenase के उपयोग HSCs की पर्याप्त पैदावार देता है. एक महत्वपूर्ण कारक नाल से HSC उपज को प्रभावित यांत्रिक हदबंदी से पहले की डिग्री है, और, enzymatic उपचार अवधि है.

हम भी अपने सटीक सेलुलर niches में immunohistochemistry से HSCs के विकास के दृश्य के लिए निर्धारित जमी अपरा ऊतक वर्गों की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. के रूप में hematopoietic विशिष्ट प्रतिजनों आयल एम्बेडेड वर्गों की तैयारी के दौरान संरक्षित नहीं हैं, हम नियमित अपरा HSCs और progenitors स्थानीयकृत के लिए तय जमी वर्गों का उपयोग करें.

Protocol

1. भ्रूण हटाने और अपरा विच्छेदन शुरू करने के लिए, भ्रूण पहली बार गर्भवती बांधों से अलग होना चाहिए. पशु अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार euthanized हैं – हमारे मामले में हम संवेदनाहारी isoflurane का एक घातक खुराक…

Discussion

प्रयोगात्मक इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं अलगाव और अपरा ऊतक और hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के दृश्य के लिए अनुमति देगा. उम्मीद सेलुलर उपज और भ्रूण के विकास के दौरान अपरा और अन्य भ्रूण hematopoietic अंग…

Materials

Materials List:
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12×75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)