Summary
Questo video mostra la procedura per la differenziazione delle cellule dendritiche mieloidi dal midollo osseo dei topi. Isolamento di tibia e femore del mouse, e la lavorazione del midollo osseo sono dimostrati. Immagini che dimostrano morfologia cellulare prima e dopo la differenziazione, e le figure raffiguranti fenotipo delle cellule e IL-12 maturazione di produzione utilizzando i seguenti CpG sono mostrati.
Abstract
Mieloide cellule dendritiche (DC) sono spesso usati per studiare le interazioni tra meccanismi immunitari innati e adattivi e la prima risposta alle infezioni. Perché questi sono l'antigene più potenti cellule presentanti l', DC sono sempre più usato come vettore vaccino per studiare l'induzione di risposta immunitaria antigene-specifica. In questo video, dimostriamo la procedura per la raccolta delle tibie e femori da un topo donatore, l'elaborazione del midollo osseo e differenziare DC in vitro. Le proprietà del cambiamento DC a seguito di stimolazione: le cellule dendritiche immature sono fagociti potenti, mentre DC mature sono capaci di presentazione dell'antigene e di interazione con CD4 + e CD8 + T. Questo cambiamento di attività funzionale corrisponde al upregulation dei marcatori di superficie delle cellule e la produzione di citochine. Molti agenti possono essere utilizzati per DC mature, tra cui citochine e Toll-like ligandi del recettore. In questo video, dimostriamo confronti citometria a flusso di espressione di due molecole co-stimolatorie, CD86 e CD40, e le citochine, IL-12, a seguito di stimolazione durante la notte con trattamento di CpG o modelli. Dopo la differenziazione, DC può essere ulteriormente manipolata per l'utilizzo come vettore vaccino o per generare una risposta immunitaria antigene-specifica in vitro utilizzando impulsi peptidi o proteine, o trasdotte con vettori virali ricombinanti.
Protocol
Questo protocollo è stato adattato da Lutz et al 1.
Raccolta ed elaborazione di midollo osseo
- Isolamento della tibia e femore: eutanasia il mouse donatore e spruzzare le gambe con il 70% di etanolo. Afferrare la caviglia prima saldamente con una pinza smussato e cominciare a tagliare via la pelle e la muscolatura sottostante per esporre la tibia. Per evitare di danneggiare l'osso, tagliato lentamente e in parallelo alla tibia, lasciando intatto il ginocchio.
Per pulire il femore, immobilizzare l'articolazione del ginocchio afferrando con una pinza contundente. Pulire via la muscolatura con un paio di forbici affilate e pinze curve. Continuare verso l'alto fino a quando l'anca è esposto e forbici può essere posizionato tra la testa del femore e dell'anca. Togliere le ossa, tagliando tra comuni femore e dell'anca e del luogo in tampone fosfato (PBS) su ghiaccio. - La rimozione del midollo osseo: Pulizia muscolatura residua dalle ossa con le forbici e pinze curve. Tagliare il epifisi di ogni osso e individuare la cavità centrale. Utilizzando una siringa da 10 ml caricato con PBS e un 25G0.5 "ago, a livello del midollo osseo in un non-tessuto piatto rivestito di Petri.
- L'elaborazione di midollo osseo: Utilizzare l'estremità in gomma dello stantuffo da una siringa da 1 ml per dissociare il midollo osseo in una cella singola sospensione (utilizzare un su e giù, non raschiando movimento). Raccogliere midollo osseo in un tubo conico falco, e risciacquare midollo osseo residuo con PBS.
Coltura di cellule dendritiche
- Risospendere le cellule in DC media e precursori DC contare su un emocitometro (Figura 1). Vedrete le cellule di varie dimensioni, i precursori DC sono i più grandi e più brillanti. Differenziale contano solo queste cellule. Da due femori e due tibie di una wild-type C57BL / 6 del mouse (6-8 settimane), si dovrebbe aspettare tra 25-40 x 10 6 precursori DC totale.
Figura 1
- Celle di coltura ad una densità di 2 x 10 5 precursori DC / mL in DC dei media integrato con 40 ng / mL ricombinante murino GM-CSF. Cellule piastra in lastre di polistirene non tessuto rivestito di Petri.
Aggiungi media (giorno 3)
Per aggiornare i media, aggiungete la metà del volume totale di mezzi freschi integrata con 40 ng / mL GM-CSF.
Sostituire un terzo della media (giorno 6) e la maturazione
Per aggiornare i media, con attenzione rimuovere un terzo del volume totale dei media e sostituire questo volume con nuove mezzi di comunicazione integrata con DC 40 ng / mL GM-CSF al giorno 6 di cultura.
Se lo si desidera, le cellule dendritiche possono essere stimolati per la maturazione con citochine o toll-like ligandi del recettore. Nel video, DC erano maturate dalla stimolazione durante la notte con 5 ng / ml CpG.
Raccolta di cellule dendritiche
Cultura DC è completa (Figura 2). Cellule saranno sia in sospensione e liberamente aderito alla piastra. Aderito cellule possono essere rimosse raschiando il piatto con un raschietto coltura di tessuti e risciacquo con PBS. Il numero totale di cellule aumenterà 5-8 volte durante la settimana di cultura e il periodo di differenziazione, quindi, si aspettano di raccogliere 1-1,6 x 10 6 cellule / ml. 
Figura 2
Reagenti
- DC dei media
- RPMI-1640 mezzi di comunicazione, integrato con:
- 10% di siero fetale bovino
- 100 UI / ml penicillina
- 100 mg / ml streptomicina
- 1% di L-glutammina
- 0,1% 2-mercaptoetanolo
- 1X aminoacidi non essenziali
- 1X sodio piruvato
- Ricombinante murino GM-CSF
- rmGM-CSF (Peprotech inc, New Jersey, nessun catalogo. 315-03)
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Discussion
DC sono utili per gli studi di interazioni immune innata e adattativa, e può essere impiegato come vettore di vaccino. In questo video, abbiamo dimostrato i passi per isolare midollo osseo e differenziare cellule dendritiche mieloidi in vitro. Dopo il periodo di coltura, queste cellule possono essere visualizzate sia le cellule al microscopio come aderenti, che spesso possiedono dendriti, e non aderente cellule rotonde. La DC può essere ulteriormente manipolata per la presentazione dell'antigene da pulsante con l'antigene o stimolate per la produzione di citochine e molecole co-stimolatorie upregulation utilizzando citochine e / o toll-like ligandi del recettore (per la revisione, vedere Gilboa, 2008 (2)).
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Acknowledgments
JB è sostenuto da borse di studio dalle scienze naturali e ingegneria Research Council (NSERC). Il supporto per questo progetto è stato fornito dal Canadian Institutes of Health Research, Grant MOP-67066.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| recombinant murine GM-CSF | Reagent | Peptrotech | 315-03 |
References
- Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).
- Gilboa, E.
